酶解輔助乙醇提取 牡丹果皮木犀草素的研究

陳 剛,楊玉珍,張 敏,羅 青,王國(guó)霞

(鄭州師范學(xué)院,河南鄭州 450044)

牡丹籽油在2011年被認(rèn)定為新資源食品,“鳳丹”牡丹(Paeoniasuffruticosa“Feng Dan”)是榨取牡丹籽油常用的品種之一,隨著牡丹籽油的急性肝損傷保護(hù)作用[1],抗糖尿病活性[2],降血脂、降血糖作用[3-4],防曬[5]等保健功能[6-8]逐漸被人們重視,其種植面積也將逐年擴(kuò)大,同時(shí)也將產(chǎn)生大量的果皮,因此為果皮資源的再利用提供技術(shù)支持是非常迫切的。木犀草素為黃酮類(lèi)化合物,具有抗氧化[9]、抗菌[10]、抗腫瘤[11]、抗炎[12]等生物活性。目前有學(xué)者[13]研究了牡丹種皮木犀草素的提取工藝,但牡丹果皮中木犀草素的提取研究尚未見(jiàn)報(bào)道,本文研究牡丹果皮木犀草素的提取工藝，可為油用牡丹果皮資源的再利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“鳳丹”牡丹果皮 2016年8月采收的五年生實(shí)生苗“鳳丹”牡丹果皮置于室內(nèi)陰干備用;木犀草素對(duì)照品 上海源葉生物科技有限公司;果膠酶(酶活力500 U·g-1) Sigma公司;纖維素酶(酶活力10000 U·g-1) 南京都萊生物技術(shù)有限公司;無(wú)水乙醇、乙酸、乙酸鈉、鉬酸銨 均為分析純。

JA3003N電子天平 上海菁海儀器有限公司;PHSJ-5實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海精科;MINID實(shí)驗(yàn)室超純水器 河南森空儀器設(shè)備有限公司;TGL16M冷凍離心機(jī) 湖南湘立科學(xué)儀器設(shè)備有限公司;TH-250B型數(shù)控超聲波清洗機(jī) 濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司;DHG-9140電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 邢臺(tái)市潤(rùn)聯(lián)機(jī)械設(shè)備有限公司;CT410粉碎機(jī) 蘇州安創(chuàng)儀器有限公司;FCD-270SE電冰柜 青島海爾特種電冰柜有限公司;T6型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乙醇提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 乙醇提取工藝單因素實(shí)驗(yàn) 取牡丹果皮,洗凈,在55 ℃的干燥箱干燥8 h后用粉碎機(jī)制粉,將過(guò)100目篩后的粉末存放于磨砂的廣口瓶密封,置于4 ℃冰箱中備用。

分別取1 g牡丹果皮粉末,按照10∶1的液料比分別加入60%、65%、70%、75%、80%的乙醇溶液搖勻,靜置提取30 min,在10000 r·min-1、4 ℃離心10 min,取出上清液,再按相同比例向殘?jiān)屑尤胍掖既芤?搖勻并再次靜置相同時(shí)間,在相同離心條件下離心,取出上清液,合并上清液,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)木犀草素得率的影響。

分別取1 g牡丹果皮粉末,按照10∶1的液料比加入65%的乙醇溶液搖勻靜置浸泡提取20、25、30、35、40 min,其它操作同上,考察靜置浸泡時(shí)間對(duì)木犀草素得率的影響。

分別取1 g牡丹果皮粉末,按液料比6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1 (mL·g-1)加入65%的乙醇溶液搖勻,靜置提取30 min,其它操作同上,考察液料比對(duì)木犀草素得率的影響。

分別取1 g牡丹果皮粉末,按照10∶1的液料比加入65%的乙醇溶液,搖勻靜置提取30 min,在10000 r·min-1、4 ℃離心10 min,取出上清液。按相同操作提取1、2、3、4、5次,考察提取次數(shù)對(duì)木犀草素得率的影響;以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.2.1.2 乙醇提取工藝正交實(shí)驗(yàn) 在上述單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用L9(34)正交實(shí)驗(yàn),對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、浸泡時(shí)間及提取次數(shù)這四個(gè)因素的條件進(jìn)行優(yōu)化,方案如表1所示。

表1 乙醇提取木犀草素正交實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 1 The orthogonal test factors and levels of ethanol extracttion of luteolin

1.2.2 酶解輔助乙醇提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 酶解輔助乙醇提取工藝單因素實(shí)驗(yàn) 分別取10份1 g牡丹果皮粉末置于試管中,加入pH4.0的酶緩沖液5 mL(分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g·L-1的纖維素酶,0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g·L-1的果膠酶)搖勻后于50 ℃水浴保溫120 min。再以90 ℃水浴滅活5 min,按照優(yōu)化的乙醇提取條件提取,測(cè)得木犀草素得率,考察不同的酶種類(lèi)及酶濃度對(duì)木犀草素得率的影響。

分別取1 g牡丹果皮粉末,加入pH4.0的0.10 g·L-1的果膠酶緩沖液5 mL,搖勻后于50 ℃水浴保溫80、100、120、140、160 min,其他操作同上,考察水浴時(shí)間對(duì)木犀草素得率的影響。

分別取1 g牡丹果皮粉末,加入pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的0.10 g·L-1的果膠酶緩沖液5 mL,搖勻后50 ℃水浴保溫120 min,其他操作同上,考察pH對(duì)木犀草素得率的影響。

分別取1 g牡丹果皮粉末,加入含有pH4.0的0.10 g·L-1的果膠酶緩沖液5 mL,搖勻后在40、45、50、55、60 ℃水浴保溫120 min,其他操作同上,考察水浴溫度對(duì)木犀草素得率的影響;以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.2.2.2 酶解輔助乙醇提取工藝正交實(shí)驗(yàn) 在上述的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用L9(34)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),對(duì)酶濃度、水浴時(shí)間、水浴溫度和pH四個(gè)因素的條件進(jìn)行優(yōu)化,設(shè)計(jì)方案如表2所示。

表2 酶解輔助乙醇提取木犀草素正交實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 2 The orthogonal test factors and levels of enzyme assisted ethanol extraction of luteolin

1.2.3 木犀草素得率的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[14]的方法,有改進(jìn)。以4.00 g·L-1的鉬酸銨溶液為對(duì)照品,分別配制濃度為0.0040、0.0056、0.0072、0.0088、0.0104、0.0120、0.0136 mg·mL-1的木犀草素標(biāo)準(zhǔn)使用液,在360 nm處測(cè)定吸光度,得出線性回歸方程。

準(zhǔn)確量取提取液1 mL用鉬酸鹽分光光度法[14]測(cè)定吸光度,將結(jié)果代入制作好的木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,根據(jù)公式計(jì)算結(jié)果。

木犀草素得率的計(jì)算公式如下:

式中,C為根據(jù)測(cè)得的吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出的樣品中木犀草素濃度(mg·mL-1),V為提取的上清液體積(mL),K為稀釋倍數(shù),m為果皮粉末質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft office 2010 作圖,SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,采用鄧肯氏新復(fù)極差法檢驗(yàn),以p<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果及分析

2.1 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的木犀草素標(biāo)準(zhǔn)溶液及其所對(duì)應(yīng)的吸光度值,擬合線性方程為y=43.906x+0.0173,R2=0.9929,式中y為吸光度值,x為木犀草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.2 乙醇提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)木犀草素得率的影響 由圖1可知,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%至65%的范圍內(nèi),木犀草素得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加,乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)其得率為10.18 mg·g-1,達(dá)到最大值,但乙醇體積分?jǐn)?shù)大于65%時(shí),提取得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加反而降低,這是因?yàn)殡S著乙醇-水體積分?jǐn)?shù)的變化,溶劑的極性也隨之變化,對(duì)木犀草素的溶出率發(fā)生變化,而且體積分?jǐn)?shù)不同的乙醇水溶液對(duì)組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)影響不同,同時(shí)水的減少也削弱了對(duì)顆粒細(xì)胞的溶脹,所以乙醇體積分?jǐn)?shù)提高到一定程度,木犀草素的提取率反而降低[15]。體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí),木犀草素得率為8.42 mg·g-1,比乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)木犀草素得率10.18 mg·g-1,低17.29%,方差分析結(jié)果顯示,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí),顯著(p<0.05)大于其它處理水平的木犀草素得率。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)木犀草素得率的影響Fig.1 Effect of volume fraction of ethanol on luteolin yield

2.2.2 浸泡時(shí)間對(duì)木犀草素得率的影響 由圖2可以看出,浸泡時(shí)間在20～30 min范圍時(shí),木犀草素得率是逐漸上升的,在浸泡時(shí)間為30 min時(shí),木犀草素得率達(dá)到最大,為9.95 mg·g-1,這是由于浸泡時(shí)間越長(zhǎng)就會(huì)有越多的木犀草素溶解到提取液中;而浸泡時(shí)間為30～40 min時(shí),木犀草素得率反而下降,40 min的得率為8.60 mg·g-1,可能是由于木犀草素保存在溶劑里時(shí)間過(guò)長(zhǎng)被氧化破壞的緣故。方差分析結(jié)果表明,浸泡時(shí)間30 min時(shí)的木犀草素得率顯著(p<0.05)高于25 min和35 min,故選取25、30和35 min三個(gè)處理水平用于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖2 浸泡時(shí)間對(duì)木犀草素得率的影響Fig.2 Effect of soak time on luteolin yield

2.2.3 液料比對(duì)木犀草素得率的影響 由圖3可知,液料比在6∶1～10∶1的范圍內(nèi),木犀草素得率是不斷增加的,當(dāng)液料比為10∶1時(shí),木犀草素得率最大,為10.70 mg·g-1,這是因?yàn)殡S著乙醇量的增加,使其與底物的接觸機(jī)會(huì)增大,從而得到更多的木犀草素;但當(dāng)液料比在10∶1～14∶1范圍內(nèi)時(shí),木犀草素得率反而降低,是因?yàn)榕c木犀草素競(jìng)爭(zhēng)乙醇溶液的其他醇溶性雜質(zhì)溶出量增加,導(dǎo)致木犀草素的溶出率降低,得率下降[16]。當(dāng)液料比為6∶1時(shí)木犀草素得率為9.96 mg·g-1,比液料比為10∶1時(shí)木犀草素得率10.70 mg·g-1低6.92%。方差分析結(jié)果表明,液料比為10∶1時(shí),顯著(p<0.05)大于其他處理水平的木犀草素得率。因此,選取液料比為8∶1、10∶1、12∶1三個(gè)水平用于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖3 液料比對(duì)木犀草素得率的影響Fig.3 Effect of liquid to solid ratio on luteolin yield

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)木犀草素得率的影響 由圖4可以看出,提取次數(shù)在1～2次范圍內(nèi),木犀草素得率是逐漸增大的,最高為9.42 mg·g-1,這可能是因?yàn)樘崛〈螖?shù)增多使得更多的木犀草素溶解在提取液中;而在提取次數(shù)為2～5次時(shí),木犀草素得率反而是下降的,提取5次時(shí)的木犀草素得率為9.00 mg·g-1,出現(xiàn)此變化的原因可能是提取次數(shù)過(guò)多導(dǎo)致提取液中的木犀草素被氧化分解造成的。方差分析結(jié)果表明,提取次數(shù)為2次時(shí)的木犀草素得率顯著(p<0.05)高于1次和3次,故選取1、2和3次三個(gè)處理水平用于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖4 提取次數(shù)對(duì)木犀草素得率的影響Fig.4 Effect of extracting times on luteolin yield

2.3 正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及極差分析結(jié)果如表3所示,影響牡丹果皮木犀草素得率的主次關(guān)系依次為提取次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸泡時(shí)間、液料比。

表3 乙醇提取木犀草素正交實(shí)驗(yàn)因素結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal test of ethanol extract luteolin

由表4可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸泡時(shí)間、液料比、提取次數(shù)四因素都達(dá)到了顯著(p<0.05)水平,表明實(shí)驗(yàn)中的乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸泡時(shí)間、液料比、提取次數(shù)均顯著(p<0.05)地影響了木犀草素得率。

表4 乙醇提取木犀草素方差分析結(jié)果Table 4 The results of ANOVA of ethanol extract luteolin

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)極差分析可知,當(dāng)組合為A1B2C2D3,即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,浸泡時(shí)間30 min,液料比10∶1,提取3次時(shí),木犀草素得率最大。而此組合并未出現(xiàn)在上述正交實(shí)驗(yàn)組合中,所以在此工藝條件下驗(yàn)證,得出的最優(yōu)組合提取條件下的木犀草素得率為(15.48±0.18) mg·g-1。對(duì)比優(yōu)化前的提取條件,即60%乙醇溶液浸泡25 min、液料比為8∶1、提取一次的條件下所得的木犀草素得率9.25 mg·g-1,優(yōu)化后的得率為優(yōu)化前的1.67倍。

2.5 酶解輔助乙醇提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 酶種類(lèi)及酶質(zhì)量濃度對(duì)木犀草素得率的影響 由圖5可知,果膠酶對(duì)于木犀草素得率的影響更加明顯,所以選用果膠酶輔助提取木犀草素。在果膠酶濃度為0.05～0.10 g·L-1范圍內(nèi),得率不斷增大,果膠酶濃度為0.10 g·L-1時(shí)木犀草素的得率達(dá)到最大為17.94 mg·g-1,是因?yàn)殡S著果膠酶濃度升高,酶與底物接觸的機(jī)會(huì)增加,有更多的木犀草素被分離出來(lái);而酶濃度為0.10～0.25 g·L-1時(shí),木犀草素得率反而逐漸降低,果膠酶濃度為0.25 g·L-1時(shí),木犀草素得率為16.34 mg·g-1,比0.10 g·L-1時(shí)低9.79%。方差分析結(jié)果顯示,當(dāng)果膠酶濃度為0.10 g·L-1時(shí)的得率顯著(p<0.05)大于其他處理水平的木犀草素得率。因此,選擇果膠酶濃度為0.05、0.10、0.15 g·L-1三個(gè)水平用于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖5 纖維素酶濃度和果膠酶濃度對(duì)木犀草素得率的影響Fig.5 Effect of cellulase concentration and pectinase concentration on luteolin yield

2.5.2 水浴時(shí)間對(duì)木犀草素得率的影響 由圖6可知,在水浴時(shí)間為80～140 min范圍內(nèi),隨著水浴時(shí)間的不斷延長(zhǎng),得率也不斷升高,當(dāng)水浴時(shí)間為140 min時(shí)得率最大,為17.98 mg·g-1,這可能是因?yàn)樗r(shí)間越長(zhǎng)就有越多的木犀草素溶解到提取液中;但當(dāng)水浴的時(shí)間在140～160 min時(shí),木犀草素的得率反而降低至16.88 mg·g-1,比水浴時(shí)間為140 min時(shí)木犀草素得率低6.12%,這可能是因?yàn)槟鞠菟卦谳^高溫度下保持時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而被氧化破壞的緣故。方差分析結(jié)果顯示,水浴時(shí)間為140 min時(shí),顯著(p<0.05)大于其他處理水平的木犀草素得率。所以選擇120、140、160 min三個(gè)水平用于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖6 水浴時(shí)間對(duì)木犀草素得率的影響Fig.6 Effect of water bath time on luteolin yield

2.5.3 pH對(duì)木犀草素得率的影響 如圖7所示,pH3.5～4.0范圍內(nèi),木犀草素得率隨著pH增大而升高,pH4.0時(shí)得率達(dá)到最大值,為17.80 mg·g-1,這可能是因?yàn)殡S著pH的升高,酶的活性也隨之升高;但當(dāng)pH4.0～5.5范圍內(nèi)時(shí),木犀草素得率反而降低,pH5.5時(shí)為16.62 mg·g-1,比pH4.0時(shí)低了6.63%,這可能是pH過(guò)高,果膠酶活性降低,從而使得木犀草素得率降低。方差分析結(jié)果顯示,pH4.0時(shí),顯著(p<0.05)大于其他處理水平的木犀草素得率。因此選取pH為3.5、4.0、4.5三個(gè)水平用于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖7 pH對(duì)木犀草素得率的影響Fig.7 Effect of pH on luteolin yield

2.5.4 水浴溫度對(duì)木犀草素得率的影響 由圖8可知,水浴溫度在40～55 ℃時(shí),木犀草素得率不斷增高,在55 ℃時(shí)達(dá)到最大,為17.62 mg·g-1,這也許是因?yàn)闇囟壬?酶活性也隨之增大;但在55～60 ℃范圍內(nèi)時(shí),木犀草素得率反而降低,60 ℃時(shí)為16.06 mg·g-1,比55 ℃時(shí)低8.85%,這是因?yàn)楣z酶的最適溫度為55 ℃,溫度過(guò)高會(huì)使果膠酶活性降低,從而使木犀草素得率降低。方差分析結(jié)果顯示,水浴溫度是55 ℃時(shí)的得率,顯著(p<0.05)大于其它處理水平的木犀草素得率。因此,選取45、50、55 ℃三個(gè)水平用于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖8 水浴溫度對(duì)木犀草素得率的影響Fig.8 Effect of water bath temperature on luteolin yield

2.6 正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析結(jié)果見(jiàn)表5,由表5可知,影響牡丹果皮木犀草素得率的主次關(guān)系依次為水浴時(shí)間、水浴溫度、pH、果膠酶濃度。

表5 酶解輔助乙醇提取木犀草素正交實(shí)驗(yàn)因素結(jié)果Table 5 Design and results of orthogonal test of enzyme assisted ethanol extraction of luteolin

表6 酶解輔助乙醇提取木犀草素方差分析結(jié)果Table 6 The results of ANOVA of enzyme assisted ethanol extraction of luteolin

由表6可知,果膠酶濃度、水浴時(shí)間、pH、水浴溫度四因素均達(dá)到顯著(p<0.05)水平,說(shuō)明了實(shí)驗(yàn)中的果膠酶濃度、水浴時(shí)間、pH、水浴溫度均顯著(p<0.05)地影響木犀草素得率。

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)極差分析表明,當(dāng)組合為A1B3C2D3,即在果膠酶濃度0.05 g·L-1、水浴加熱160 min、pH4.0、水浴溫度55 ℃條件下進(jìn)行處理后,再在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、浸泡時(shí)間為30 min、液料比為10∶1的條件下提取3次,木犀草素得率預(yù)計(jì)達(dá)到最大。因?yàn)榇私M合并沒(méi)有出現(xiàn)在以上正交實(shí)驗(yàn)組合中,所以在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證,得出的最優(yōu)組合提取條件下的木犀草素得率為(19.30±0.41) mg·g-1。對(duì)比未經(jīng)優(yōu)化的提取條件,即60%乙醇溶液浸泡25 min、液料比為8∶1、提取一次的條件下所得的木犀草素得率9.25 mg·g-1,優(yōu)化后的產(chǎn)品得率為優(yōu)化前的2.09倍;對(duì)比酶解條件未優(yōu)化的得率,即果膠酶0.05 g·L-1、水浴加熱120 min、pH3.5、水浴溫度45 ℃的條件下處理后,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、果皮浸泡30 min、液料比為10∶1條件下提取3次所得木犀草素得率16.70 mg·g-1,優(yōu)化后的產(chǎn)品得率為優(yōu)化前的1.15倍。

3 結(jié)論

本研究采用酶解輔助乙醇提取牡丹果皮木犀草素的工藝條件,首先進(jìn)行乙醇提取牡丹果皮木犀草素最優(yōu)條件的探究,通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出最優(yōu)提取組合,即在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、浸泡時(shí)間30 min、液料比為10∶1的條件下提取3次,木犀草素得率為15.48 mg·g-1;在此最優(yōu)組合的條件下加入果膠酶,同樣在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出酶解條件的最佳組合為果膠酶0.05 g·L-1、水浴加熱160 min、pH4.0、水浴溫度55 ℃,再以兩次正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,即在果膠酶0.05 g·L-1、pH4.0、水浴加熱160 min、水浴溫度55 ℃的條件處理后,再在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、果皮浸泡30 min、液料比為10∶1的條件下提取3次,牡丹果皮木犀草素得率最高達(dá)19.30 mg·g-1。對(duì)比本實(shí)驗(yàn)最初研究結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)果膠酶輔助乙醇提取后,木犀草素得率為優(yōu)化前的2.09倍,達(dá)到了強(qiáng)化提取的預(yù)期效果,節(jié)約了能源,提高了提取效率。

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