基于單分子實時測序技術的 3個當陽廣椒樣品細菌多樣性研究

王玉榮,孫永坤,代凱文,孫京新,沈 馨,郭 壯,*

(1.湖北文理學院化學工程與食品科學學院,鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所,湖北襄陽 441053； 2.當陽市食品藥品監(jiān)督管理局,湖北宜昌 444100； 3.青島農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,山東青島 266109)

鲊廣椒是一種特色傳統(tǒng)發(fā)酵食品,常以大米或玉米為主要原料,以鮮紅辣椒和食鹽為輔料,通過將原料入壇后塞入稻草并將壇子倒扣于水盆中發(fā)酵而成。我國湖北、云南、貴州、四川和重慶等少數(shù)民族地區(qū)均有制作和食用鲊廣椒的習俗[1],但是目前市場上尚無較為成熟的鲊廣椒產(chǎn)品。食醋和醬油等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展策略,為成熟鲊廣椒產(chǎn)品的推出提供了借鑒,在解析傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物群落結構的基礎上,對其優(yōu)勢菌群進行分離、鑒定、保藏和篩選,繼而采用高密度發(fā)酵技術和冷凍干燥技術相結合的手段進行直投式發(fā)酵劑制備,不僅可推動傳統(tǒng)發(fā)酵食品的產(chǎn)業(yè)化,亦可以摒除傳統(tǒng)發(fā)酵食品中蘊含的致病菌或條件致病菌,對提升產(chǎn)品的安全性具有積極的意義[2-3]。由此可見,為實現(xiàn)鲊廣椒的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),對其微生物多樣性進行解析是首要開展的工作,然而令人遺憾的是,目前關于鲊廣椒微生物多樣性的研究報告尚少。

表1 測序所用barcode和引物序列Table 1 Barcode and primer sequence for sequencing

作為第三代高通量測序技術,單分子實時(Single Molecule Real-Time,SMRT)測序技術充分利用了DNA聚合酶的特性,通過顯微鏡實時觀測和記錄DNA聚合酶作用下的邊合成邊測序過程,具有讀數(shù)長、準確率高、通量高、速度快和成本低的優(yōu)點[4]。尤其是PacBio RS II測序平臺結合了P6/C4試劑后,其測序讀數(shù)長達10～14 kb,準確率達到99%,可以從分類學“種”的水平獲取樣本中微生物的信息[5],有效彌補了DGGE通量低、分辨率有限、分離片段小以及羅氏454焦磷酸測序平臺和Illumina MiSeq & HiSeq為代表的二代測序技術讀數(shù)短、易錯配的缺點。值得一提的是,SMRT測序技術在解析微生物多樣性和豐富度均較高的復雜基質研究方面具有較大的技術優(yōu)勢,極大地推動了微生物多樣性研究領域的進步[6],在乳制品[7]和腸道[8]微生物多樣性研究方面具有廣泛的應用。由此可見,SMRT測序技術為我們解析鲊廣椒中微生物的多樣性提供了新的研究思路和視野。

本研究采用SMRT測序技術,以16S rRNA基因全長為測序靶點,結合生物信息學手段,在分類學地位“種”水平上,對3 份采集自湖北當陽地區(qū)的鲊廣椒中細菌微生物的多樣性進行了解析,以期為后續(xù)鲊廣椒中微生物菌株的分離及發(fā)酵劑的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鲊廣椒 3份樣品均采集于2017年4月,用一次性采樣勺采集,每個樣品約30 g,采集溫度在25 ℃左右,采樣后置于含有冰袋的采樣箱中冷鏈運送回實驗室，湖北省當陽市草埠湖鎮(zhèn)農(nóng)戶家;E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒 美國OMEGA公司;2×EasyTaq PCR SuperMix 北京全式金生物技術有限公司;SMRT Cell、SMRTbell TM Template Prep Kit 1.0試劑盒、DNA Polymerase Binding Kit P6 v2試劑盒、MagBead Buffer Kit v2試劑盒和Qubit定量試劑盒 美國Pacific Biosciences公司。

SMRT RS II測序平臺(配置P6/C4試劑) 美國Pacific Biosciences公司;UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng) 美國BIO-RAD公司;ND-2000C微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司;vetiri梯度基因擴增儀 美國AB公司;DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠;5810R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;HWS24 型恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 取3.0 g鲊廣椒樣品加入8 mL pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液,振蕩混勻后800×g離心10 min取上清液,上清液于13000×g離心10 min后收集菌體,采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒進行微生物宏基因組DNA提取。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計對DNA樣品的完整度、純度以及濃度進行評價,要求DNA樣品條帶明亮且無彌散現(xiàn)象,OD260/280在1.8～2.0間且濃度大于10 ng/μL。符合要求的DNA樣品置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細菌16S rRNA基因全長擴增 選擇細菌16S rRNA基因全長序列作為目的擴增片段,采用標簽(barcode)對樣品進行標記以區(qū)分每個樣品[9]。測序所用的barcode和引物序列信息如表1所示。

擴增體系為:25 μL 2×EasyTaq PCR SuperMix,1.5 μL 10 μmol/L正向引物,1.5 μL 10 μmol/L反向引物,10 ng DNA模板,加ddH2O補充至50 μL。擴增條件為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min,58 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,30 個循環(huán);72 ℃ 7 min,PCR產(chǎn)物置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PacBio SMRT三代測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、混樣后,用SMRTbell TM Template Prep Kit 1.0試劑盒對純化后的DNA進行修復,修復后的高質量DNA構建文庫,然后使用DNA/Polymerase Binding Kit P6 v2試劑盒及MagBead Buffer Kit v2試劑盒將構建成功的文庫進行引物、聚合酶的連接,在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室高通量測序中心使用PacBio RS II測序平臺配置P6/C4試劑進行上機測序。

表2 樣品16S rRNA測序情況及各分類地位數(shù)量Table 2 16S rRNA read counts and number of identifiable units at different taxonomical levels

注:計算每個樣品超1和香農(nóng)指數(shù)時,樣品的測序量均為910條序列。

1.2.4 高質量序列的提取 使用SMRT RS II測序平臺自帶軟件中的RS_ReadsOfinsert.1方法對下機序列進行質量控制,存在下列情況之一則該序列予以剔除:通過率小于5;預測精確度小于99%;序列長度小于1400 bp;序列長度大于1800 bp;通過篩選的序列定義為高質量序列,并納入下一步的生物信息學分析。

1.2.5 生物信息學分析 使用QIIME(v1.7.0)分析平臺[10]進行物種鑒定和相對含量分析,主要的處理流程為:使用PyNAST[11]軟件將所有序列對齊;采用兩步UCLUST算法[12]分別以100%和97%的相似度進行序列劃分并建立分類操作單元(Operational taxonomic units,OTU);使用ChimeraSlayer去除可能存在嵌合體的OTU[13];使用RDP(Ribosomal Database Project,Release 11.5)[14]和Greengenes(Release 13.8)[15]數(shù)據(jù)庫對OTU中的代表性序列進行序列同源性比對,進而明確其分類學地位;基于代表序列使用 FastTree 軟件[16]繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹,計算鲊廣椒中細菌微生物的香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)和超 1 指數(shù)(Chao1 index)等α多樣性指標。

1.2.6 優(yōu)勢和核心菌群的定義 若隸屬于某一細菌種或OTU的微生物類群在3 個鲊廣椒樣品中均存在,則將其定義為核心種或OTU;若該細菌種平均含量大于1.0%,則將其定義為優(yōu)勢種;若某一細菌種平均含量大于1.0%且在3 個樣品中均存在,則將其定義為優(yōu)勢核心種。

1.2.7 核酸登錄號 所有高通量測序數(shù)據(jù)均已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫,ID號為mgp81522。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 使用在線工具Venny 2.1繪制維恩(Venn)圖,進而展現(xiàn)3 個樣品所共有的OTU 數(shù)目和序列數(shù);采用Mega 5.0軟件繪制核心OTU系統(tǒng)發(fā)育樹;采用Origin 8.6 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

3個鲊廣椒樣品16S rRNA基因全長序列測序情況及各分類地位數(shù)量如表2所示。

由表2可知,本研究采集的3個鲊廣椒樣品共產(chǎn)生了3286條高質量16S rRNA序列,平均每個樣品產(chǎn)生1095條。根據(jù)100%的相似性進行序列劃分共得到2709條代表性序列,根據(jù)序列的97%相似性進行操作分類單元劃分后,共得到153個OTU,去除嵌合體后還剩121個OTU,嵌合體去除率為20.91%,每個樣品平均54個OTU。由表2亦可知,DY2樣品的α多樣性指數(shù)均明顯低于其他2個樣品,由此可見DY2樣品的細菌微生物豐富度和多樣性均最低。通過使用稀疏曲線和香農(nóng)指數(shù)曲線,進一步對測序深度是否滿足后續(xù)生物信息學分析的要求進行了評估,其結果如圖1所示。

圖1 稀疏曲線圖(A)和香農(nóng)指數(shù)曲線圖(B)Fig.1 Rarefaction analysis(A)and shannon diversity estimates(B)of the high throughput sequencing

由稀疏曲線圖可知,隨著序列數(shù)的增多，捕獲新物種的數(shù)量亦增加,而由香農(nóng)指數(shù)曲線圖可知,每個樣品的香濃多樣性曲線已經(jīng)進入平臺期。由此可見,隨著測序深度的增大，盡管新的細菌種系型可能會被發(fā)現(xiàn),但其多樣性已經(jīng)不再隨之發(fā)生變化了,因而本研究中每個樣品產(chǎn)生1095條16S rRNA基因全長序列的測序深度是可以滿足后續(xù)生物信息學分析要求的。

2.2 基于各分類學地位鲊廣椒細菌相對含量的分析

在采用兩步UCLUST劃分OTU的基礎上,本研究進一步使用RDP和Greengenes數(shù)據(jù)庫對序列進行了同源性比對,將納入本研究的序列鑒定為6個門、8個綱、14個目、22個科、25個屬和43個種,僅有0.26%和1.47%的序列不能鑒定到屬和種水平。納入本研究的3 個當陽鲊廣椒樣品中平均相對含量大于1.0%的優(yōu)勢細菌門和屬分別為硬壁菌門(Firmicutes)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus),其含量分別為97.88%和94.25%。鲊廣椒中優(yōu)勢細菌種相對含量的比較分析如圖2所示。

圖2 鲊廣椒中優(yōu)勢細菌種相對含量的比較分析Fig.2 Comparative analysis on the content of the dominant bacterial species in Zhaguangjiao samples

由圖2可知,鲊廣椒樣品中平均相對含量大于1.0%的種包括隸屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的破布子乳桿菌(L.pobuzihii)、食品乳桿菌(L.alimentarius)、費斯莫爾德乳桿菌(L.versmoldensis)、類短乳桿菌(L.parabrevis)、短乳桿菌(L.brevis)、朝鮮乳桿菌(L.koreensis)和類食品乳桿菌(L.paralimentarius),其平均相對含量分別為32.31%、23.17%、22.01%、8.90%、3.31%、1.63%和1.05%;及隸屬于魏斯氏菌屬(Weissella)的類腸膜魏斯氏菌(W.paramesenteroides),其平均相對含量為1.05%。上述8 個優(yōu)勢細菌屬的累計平均相對含量為93.56%,其他35 個屬的平均相對含量累計僅為4.97%。由此可見,當陽鲊廣椒中的細菌微生物主要由隸屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的若干個種構成。Chen YS等首先從臺灣傳統(tǒng)發(fā)酵植物調味品破布子(CordiadichotomaForst. f.)中分離到破布子乳桿菌(L.pobuzihii)[17],Rapsang GF等亦從傳統(tǒng)發(fā)酵魚制品tungtap中分離到了隸屬于該種的乳酸菌[18],并證實其對傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphi)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)和大腸桿菌(Escherichiacoli)等致病菌或條件致病菌具有較好的抑菌作用。作為兼性發(fā)酵乳酸菌,食品乳桿菌(L.alimentarius)在腌制鯡魚中被認為是腐敗菌[19],在我國侗族發(fā)酵酸肉[20]和泡菜[21]中亦有分離。2003年Kr?ckel L首次從發(fā)酵香腸中分離到了費斯莫爾德乳桿菌(L.versmoldensis)[22],有報道稱其亦為埃及Domiati奶酪[23]和意大利臘腸[24]中的優(yōu)勢乳酸菌。本研究進一步對鲊廣椒中優(yōu)勢核心細菌種相對含量進行了比較分析,其結果如圖3所示。

圖3 鲊廣椒中優(yōu)勢核心細菌種相對含量的比較分析Fig.3 Comparative analysis on the content of the core dominant bacterial species in Zhaguangjiao samples

由圖3可知,破布子乳桿菌(L.pobuzihii)、短乳桿菌(L.brevis)、費斯莫爾德乳桿菌(L.versmoldensis)、食品乳桿菌(L.alimentarius)和類食品乳桿菌(L.paralimentarius)為納入本研究的3 個當陽鲊廣椒中優(yōu)勢核心細菌菌群,其平均累計相對含量為81.85%,這也進一步證實了,當陽鲊廣椒共有大量的細菌菌群。本研究進一步統(tǒng)計了OTU在3 個樣品中出現(xiàn)的次數(shù),其結果如圖4所示。

圖4 OTU在鲊廣椒樣品中出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計Fig.4 Distribution of OTU as a function of their prevalence in Zhaguangjiao samples

由圖4可知,3 個鲊廣椒樣品共產(chǎn)生121 個細菌OTU,其中核心OTU僅有6 個,占OTU總數(shù)的4.96%,分別出現(xiàn)2 次和1 次的OTU分別有28 個和87 個,分別占OTU總數(shù)的23.14%和71.90%。基于OTU水平的Venn圖如圖5所示。

圖5 基于OTU水平的Venn圖Fig.5 Venn diagram based on OTU

由圖5可知,雖然納入本研究的3 個當陽鲊廣椒樣品中核心OTU數(shù)僅占OTU總數(shù)的4.96%,但其包含了1014 條序列,占所有質控后合格序列數(shù)的29.58%。在3 個當陽鲊廣椒樣品中出現(xiàn)2 次和1 次的OTU所包含序列數(shù)分別為2075 條和196 條,分別占所有質控后合格序列數(shù)的60.53%和5.72%。綜上所述,雖然納入本研究的3 個當陽鲊廣椒樣品共有大量的細菌類群,但有的鲊廣椒樣品中可能含有一些相對含量較低且較為獨特的細菌種系型。核心OTU在各鲊廣椒樣品中相對含量的熱圖如圖6所示。

圖6 核心OTU在各鲊廣椒樣品中相對含量的熱圖Fig.6 Heat map of the contents of core OTU in Zhaguangjiao samples注:依據(jù)OTU的進化關系建立了左側的系統(tǒng)發(fā)育樹。

由圖6可知,6 個核心OTU中有4 個隸屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus),2 個隸屬于類芽胞桿菌屬(Paenibacillus),核心OTU在3 個鲊廣椒樣品中累計相對含量分別為13.24%、4.19%和10.84%。值得一提的是,OTU67和OTU47在3 個樣品中的相對含量均大于1.0%,且均被鑒定為食品乳桿菌(L.alimentarius)。

微生物菌株是生產(chǎn)發(fā)酵食品必不可少的原材料,菌株的發(fā)酵特性及功能特性直接影響了食品的風味、氣味及感官特性。因此,微生物菌種開發(fā)和生產(chǎn)技術是發(fā)酵食品加工業(yè)中的核心技術之一。當陽地區(qū)鲊廣椒由于其生境環(huán)境和發(fā)酵基質與傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品和泡菜有著較大的差異,因而其優(yōu)勢乳酸菌種群較為獨特。在后續(xù)研究中,以單分子實時測序結果為指導,使用KOMODO(Known Media Database)網(wǎng)站[25]以細菌16S rRNA全長序列來預測培養(yǎng)優(yōu)勢菌培養(yǎng)基的配方,進而實現(xiàn)對優(yōu)勢乳酸菌菌株的分離,無論是對我國商業(yè)化乳酸菌的開發(fā)利用,還是對乳酸菌遺傳進化研究工作的開展均具有積極的意義。

3 結論

以16S rRNA基因全長為測序靶點,采用SMRT測序技術對3 份采集自湖北當陽地區(qū)鲊廣椒樣品細菌微生物的多樣性進行了解析,研究表明鲊廣椒中的細菌微生物主要由隸屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的食品乳桿菌(L.alimentarius)、費斯莫爾德乳桿菌(L.versmoldensis)、類短乳桿菌(L.parabrevis)和短乳桿菌(L.brevis)等若干個種構成,且鲊廣椒樣品共有大量的細菌類群。

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