基于宏基因組學技術分析“泡菜老湯” 發(fā)酵甘藍原核微生物群落結構

燕平梅,荊雪嬌,李艷琴，*,柴 政,喬宏萍,趙文婧,王 琪

(1.太原師范學院生物系，山西太原 030012;2.山西大學生物學院,山西太原 030031)

發(fā)酵蔬菜是蔬菜的冷加工制品,既保持了蔬菜的原滋原味,又因含有乳酸菌等腸道有益菌群而具有保健功能[1-2]。發(fā)酵蔬菜產(chǎn)業(yè)成為蔬菜加工的主流方向。發(fā)酵蔬菜的生產(chǎn)方式一般分為自然發(fā)酵和人工接種發(fā)酵兩種方式。自然發(fā)酵是借助于天然附著在蔬菜表面上微生物的作用來進行的,因為蔬菜收獲后表面所含的微生物數(shù)量大、種類多,包括細菌、酵母和霉菌等[3],發(fā)酵時微生物區(qū)系復雜,存在發(fā)酵啟動困難,容易發(fā)酵終止、不徹底、結果不可控制以及易產(chǎn)生腐敗,食用安全性差,尤其發(fā)酵蔬菜中亞硝酸含量的異常增加等缺點[4-7]。人工接種發(fā)酵工藝根據(jù)接種的菌類分為純種發(fā)酵和混合菌群發(fā)酵[8];純種發(fā)酵接種的菌種單一,容易控制,可以縮短發(fā)酵周期和提高設備的利用率,但是發(fā)酵出來的蔬菜制品,口感和品質不佳[9-11]?；旌暇旱陌l(fā)酵沿用“老湯”(以前的發(fā)酵液)的企業(yè)較多,“老湯”對發(fā)酵蔬菜原核微生物群落結構影響的研究基于傳統(tǒng)微生物學方法[12-13]。但是,現(xiàn)在已培養(yǎng)的微生物可能不到自然界微生物總量的1%[14],大量未培養(yǎng)的微生物在相應生境中存在種類到底有多少,如何發(fā)揮功能,傳統(tǒng)微生物學方法已經(jīng)不能全面解答[15]。

宏基因組學的出現(xiàn)和興起擴展了人們對微生物群落的認識?；诤昊蚪M的微生物多樣性檢測技術如DGGE/TGGE技術[16-17]、克隆文庫分析法[18-19]和高通量測序技術[20]等被廣泛應用于發(fā)酵蔬菜微生物檢測中。其中DGGE/TGGE技術具有一些不可替代的優(yōu)點，能夠更加直觀地比較和分析微生物群落結構的變化規(guī)律[21]。本研究以基于宏基因組的DGGE技術探究“老湯”對發(fā)酵蔬菜原核微生物群落結構影響,為闡明“老湯”發(fā)酵蔬菜的機理提供參考數(shù)據(jù)和方法,同時,為改進蔬菜發(fā)酵的工藝提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘藍、無碘鹽、白砂糖、花椒、大料(八角) 山西省太原市長風街美特好超市;泡菜老湯 四川某飯店DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒 北京天根生化科技有限公司;X-gal、氨芐(Amp) 北京全式金生物技術有限公司;PCR引物 上海生工生物工程公司。

瓊脂糖凝膠電泳儀、PCR儀、變性梯度凝膠電泳儀、NanoDrop2000DNA濃度儀、凝膠成像系統(tǒng) Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 泡菜制作配方及方法 將新鮮的甘藍清洗干凈,自然瀝干,切成2 cm的方塊,備用。其次,將玻璃泡菜壇子洗凈,用開水燙洗兩次后,備用。然后,按配方所示(表1),在開水中分別加入無碘鹽(2%)、白砂糖(1%)、大料(1%),煮沸10 min,待其冷卻后,盛到泡菜壇子中,補無菌水至2500 mL。最后加入已瀝干的蔬菜,水封壇子口,且用黑色塑料袋將壇子罩住,閉光發(fā)酵,室溫發(fā)酵,每隔24 h取樣。每種處理設3個重復。不加老湯的泡菜水為新湯,是對照實驗。

表1 不同泡菜的制作配方Table 1 Different recipes of pickled vegetables

1.2.2 樣品采集及DNA的提取 樣品的采集:每隔24 h用5 mL無菌移液器從泡菜罐的上、中、下部位各取10 mL發(fā)酵液(總量30 mL)于離心管中,以保證樣品的代表性。然后在11740 r/min離心10 min,收集菌體。再用PBS buffer 洗滌大離心管中的沉淀物,將菌體收集在1.5 mL的EP管中。將三個平行實驗所收集的菌體混合,以備后續(xù)實驗。泡菜新湯、老湯中DNA的提取按照試劑盒(DNA提取試劑盒)給定步驟進行。

1.2.3 細菌16S rDNA V3可變區(qū)PCR擴增 以泡菜新湯、老湯總DNA為模板,Touchdown-PCR擴增16S rDNA V3可變區(qū)(338 f～518 r)[22]。以Touchdown-PCR產(chǎn)物為模板,采用帶夾子的引物(338 f-GC和518 r),進行Reconditioning-PCR擴增[23]。

1.2.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)及染色 細菌16S rDNA V3區(qū)PCR產(chǎn)物進行DGGE分離,應用8%聚丙烯酰胺凝膠,變性劑梯度范圍為41%～58%。由于銀染法的靈敏度高,但是銀離子的殘留,不易進行后續(xù)的條帶回收,故本實驗DGGE圖譜分析采用銀染法,條帶回收采用4S RedPlus染色法。4S RedPlus染色法:電泳后將凝膠放入4S RedPlus液(4S RedPlus 120 μL,1×TAE 300 mL)中染色30 min,用UVI凝膠成像系統(tǒng)檢測并記錄結果,以備后續(xù)回收條帶使用。

1.2.5 Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和主成分分析方法 DGGE圖譜采用Quantity One 軟件對每個發(fā)酵蔬菜樣品的電泳條帶的多少、條帶密度進行數(shù)字化,導出的結果用于多樣性分析和主成分分析(PCA)。多樣性指數(shù)的計算公式如下[24]:

式中,H為Shannon-Wiener多樣性指數(shù);Ni為樣品DGGE圖譜中第i條帶灰度;N為該樣品所有條帶的總灰度;Pi為第i條帶灰度占該泳道總灰度的比率。

采用CANOCO排序軟件根據(jù)不同樣品條帶亮度和位置的數(shù)值對細菌群落結構組成進行主成分分析。

1.2.6 不同發(fā)酵階段泡菜汁的pH測定 每隔24 h,用5 mL無菌槍頭取泡菜汁20 mL于50 mL的錐形瓶中,然后用pH計測定,每個樣品測三次,取其平均值。

1.2.7 泡菜可滴定酸的測定 每隔24 h,用無菌的鑷子,從泡菜壇子中,準確稱取發(fā)酵蔬菜10.0 g于勻漿機打成漿狀研缽中,碾碎,加蒸餾水,8層紗布過濾,最終定容到100 mL容量瓶中。然后加40 mL蒸餾水,用NaOH標準溶液(0.10 mol/L)滴定,酚肽作指示劑(0.5%),滴定至溶液變微紅,記下消耗的NaOH體積數(shù)[25]。

2 結果與分析

2.1 細菌16S rDNA V3區(qū)PCR擴增

2.1.1 Touchdown-PCR擴增產(chǎn)物檢測 分別以甘藍的老湯發(fā)酵液和新湯液中微生物總DNA為模板,338F和518R為引物進行第一次PCR,用1.2%的瓊脂糖凝膠檢測擴增產(chǎn)物,結果依次如圖1所示,擴增片段大小為180 bp左右,且無非特異性擴增,故結果可用于后續(xù)實驗。

圖1 甘藍新湯和老湯第一次PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 The first PCR amplification products of new and old soup in cabbage pickles注:1～8代表甘藍新湯的取樣時間:1、2、3、4、5、6、7、8 d;9～16代表甘藍老湯取樣時間: 1、2、3、4、5、6、7、8 d;M為Marker,圖2～圖5同。

2.1.2 Reconditioning-PCR擴增產(chǎn)物檢測 以第一次PCR產(chǎn)物為模板,用帶夾子的引物338F-GC和518R進行第二次擴增。產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠檢測,結果依次見圖2所示。

圖2 甘藍新湯和老湯第二次PCR擴增產(chǎn)物Fig.2 The second PCR amplification products of new and old soup in cabbage pickles

2.2 甘藍新湯、老湯細菌16S rDNA V3區(qū)DGGE結果

圖3 甘藍新湯和老湯的細菌DGGE電泳圖譜Fig.3 DGGE analysis of bacteria in new and old soup of cabbage pickle

2.2.1 DGGE圖譜分析 甘藍的新湯和老湯連續(xù)8 d的細菌DGGE圖譜見圖3。可見新湯的DGGE條帶數(shù)明顯多于老湯,說明在新湯發(fā)酵體系,細菌的群落結構更為復雜。并且,新湯第1 d條帶較少,第2、3、4、5 d條帶數(shù)及條帶亮度均增加,第6 d反而變少,第7、8 d又增多,可以明顯的感覺到細菌群落結構存在著動態(tài)的變化,而老湯中的條帶數(shù)就相對一致,說明老湯的細菌群落結構相對穩(wěn)定。

2.2.2 香農(nóng)指數(shù)分析(Shannon-Wiener index) 香農(nóng)指數(shù)是微生物物種數(shù)、細胞數(shù)及分布均勻度的綜合指標[30]。圖4表示了自制甘藍泡菜的新湯、老湯的原核微生物多樣性變化情況。新湯中香農(nóng)指數(shù)隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律為低-高-較低。第1 d,香農(nóng)指數(shù)為最低值,可能是由于蔬菜表面的細菌在適應新的環(huán)境,處于休眠狀態(tài);第2 d,香農(nóng)指數(shù)明顯大于第1 d,在第3 d達到頂峰,第4～5 d又有輕微的下降,趨于平穩(wěn),可以認為2～5 d為甘藍泡菜發(fā)酵的中期;從第6 d開始,香農(nóng)指數(shù)明顯的下降,低于2～5 d,說明很多細菌開始衰亡,到達了衰退期,第7、8 d,雖然香農(nóng)指數(shù)有所回升,但是也已經(jīng)低于第2～5 d,可以認為6～8 d為甘藍泡菜發(fā)酵后期。

圖4 甘藍新湯和老湯的細菌多樣性指數(shù)分析Fig.4 Shannon-wiener analysis of bacteria in new and old soup of cabbage pickle

老湯中香農(nóng)指數(shù)隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律為高-低-較高。前期相當于新湯的后期,故可以看出老湯第1～2 d香農(nóng)指數(shù)和新湯第8 d大體一致。而老湯中新加了甘藍,在第3 d,香農(nóng)指數(shù)達到最低,可能是由于原核微生物群落重新構建形成其微生態(tài)的過程,即可能是由于老湯中,乳酸菌利用蔬菜發(fā)酵形成了乳酸,降低了鹵汁的pH,從而抑制了新菜中很多雜菌的生長。在4～8 d,可以認為是達到了發(fā)酵的中后期,香農(nóng)指數(shù)回升,但依舊不能達到新湯第2 d的水平,說明老湯中的微生態(tài)環(huán)境影響了很多微生物的生長。

2.2.3 主成分分析(PCA) 為了更精確的分析發(fā)酵過程過中原核微生物群落結構的動態(tài)變化,通過數(shù)字化的矩陣對DGGE圖譜進行了主成分分析。如圖5所示:在PC1方向上,甘藍老湯1～8 d聚合在一起;新湯中除了1 d,其他的也都聚合在一起。在PC2方向上,老湯1～8 d也明顯聚合在一起;新湯2～8 d也都聚合在一起,其中2～5 d及6～8 d聚合的更緊密,跟上述香農(nóng)指數(shù)分析結果一致。

圖5 甘藍新湯和老湯的主成分分析(PCA)Fig.5 The principal component analysis of bacteria in new and old soup of cabbage pickles

2.2.4 聚類分析 聚類圖譜是顯示微生物群落相似度指標(圖6)。以50%以上的相似度來看,新湯第8 d與老湯1～8 d的所有樣品聚為一類,說明新湯發(fā)酵8 d后,其穩(wěn)定的微生物區(qū)系已形成,繼續(xù)加入蔬菜不會造成其微生物群落結構大的改變。新湯中2～5 d的結果相似度高達66%以上,此結果跟香農(nóng)指數(shù)分析結果新湯第2～5 d可視為發(fā)酵中期一致。

圖6 甘藍新湯和老湯的細菌聚類分析圖譜Fig.6 The cluster analysis of bacteria in new and old soup of cabbage pickle注:#1～#8代表新湯取樣時間:1、2、3、4、5、6、7、8 d;#9～#16分別對應老湯的取樣時間:1、2、3、4、5、6、7、8 d。

2.3 甘藍泡菜及新湯和老湯的酸度變化

2.3.1 新湯和老湯的pH曲線 由圖7可知,甘藍新湯中,隨著發(fā)酵時間的增加,pH呈先下降后平穩(wěn)的趨勢,尤其在第1～3 d之內,pH下降尤為明顯。老湯中,第1 d的pH與新湯發(fā)酵后期的pH一樣,雖然pH也呈先下降后平穩(wěn)的趨勢,但下降幅度不大,基本平穩(wěn)。

圖7 甘藍新老湯發(fā)酵過程中pH的變化Fig.7 Changes of pH in new and old soup of cabbage pickles

2.3.2 新老湯泡菜的可滴定酸變化曲線 分別將新老湯腌制的甘藍研磨過濾,測定其可滴定酸,發(fā)酵過程中變化情況如圖8所示。新湯甘藍泡菜在第1 d,酸度最低,第2 d達到最高后回落,第3～5 d小幅下降,第6～8 d小幅回升;老湯發(fā)酵過程中,可滴定酸的變化幅度不大,差異不顯著,相對平穩(wěn)。此結果與DGGE法分析的細菌群落結構變化趨勢相一致。

圖8 新湯和老湯發(fā)酵過程中泡菜的可滴定酸變化曲線Fig.8 Changes of pH with cabbage in new and old soup pickles

3 討論

本團隊曾用培養(yǎng)方法和基于PCR-16S rDNA技術的非培養(yǎng)方法研究了泡菜老湯中主要微生物為乳酸菌[12],并通過微生物的計數(shù),說明用泡菜老湯發(fā)酵蔬菜能夠增強發(fā)酵系統(tǒng)中乳酸菌種群優(yōu)勢,形成有利于乳酸菌生長的環(huán)境,且能抑制乳酸菌之外的以腸桿菌科為主雜菌的生長[13]。泡菜老湯發(fā)酵甘藍因加入大量的乳酸菌，增強發(fā)酵甘藍中乳酸菌種群優(yōu)勢,形成有利于乳酸菌生長的環(huán)境,并且乳酸(可滴定酸)含量增高,pH降低,本實驗的研究結果也說明了老湯發(fā)酵甘藍初期pH較新湯發(fā)酵低;而乳酸含量較對照發(fā)酵高這一事實。

老湯發(fā)酵中引入大量的乳酸菌導致發(fā)酵初期微生物Shannon-Wiener指數(shù)較新湯中高,另一方面,引入大量乳酸菌,導致pH的迅速降低;由于乳酸菌、低pH抑制發(fā)酵甘藍中的其它微生物的出現(xiàn),如需氧嗜溫菌和腸桿菌的減少,導致老湯發(fā)酵中期甘藍中微生物Shannon-Wiener指數(shù)較新湯中低。同樣的結果也見于其它的發(fā)酵產(chǎn)品[26-28]。發(fā)酵后期由于耐酸微生物的生長繁殖,老湯發(fā)酵甘藍中微生物Shannon-Wiener指數(shù)略有回升。

蔬菜收獲后表面所含的微生物數(shù)量大,如甘藍外葉含微生物約13×108個/g,但發(fā)酵初期,由于供給微生物生長的甘藍汁營養(yǎng)物質未成為微生物細胞可用的狀態(tài),此時新湯發(fā)酵甘藍中微生物Shannon-Wiener指數(shù)較老湯中低。隨著甘藍營養(yǎng)物質向外滲透,其中大量的微生物處于快速增長,新湯發(fā)酵甘藍中微生物Shannon-Wiener指數(shù)較老湯中高,乳酸菌同樣也快速繁殖,乳酸桿菌是形成酸的主要微生物[29-30],隨著酸含量增高,pH降低,低pH和大量的乳酸菌抑制發(fā)酵甘藍中的其它微生物的出現(xiàn),因此甘藍發(fā)酵后期,新湯發(fā)酵甘藍中微生物Shannon-Wiener指數(shù)較老湯中低。

4 結論

以不加“泡菜老湯”的自然發(fā)酵甘藍為對照,研究“泡菜老湯”對發(fā)酵甘藍原核微生物群落結構的影響。研究結果表明,對照組中Shannon-Wiener指數(shù)隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律為低-高-較低,泡菜老湯中香農(nóng)指數(shù)的隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律為高-低-較高,即對照中微生物多樣性低于加泡菜老湯;主成分分析說明泡菜老湯發(fā)酵甘藍1～8 d聚合在一起;對照中除了第1 d,其他的也都聚合在一起;聚類圖譜顯示對照第8 d與泡菜老湯發(fā)酵1～8 d的所有樣品微生物群落高度相似,表明泡菜老湯發(fā)酵的原核微生物群落結構較對照相對穩(wěn)定,對照發(fā)酵第8 d后進入穩(wěn)定狀態(tài)。

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