鐵皮石斛快繁體系多糖積累的研究

婁文娟,歐陽(yáng)凡,董文賓

(1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西西安 710021)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科石斛屬多年生草本植物,大多分布在云貴、江浙一帶?，F(xiàn)有化學(xué)分析鐵皮石斛復(fù)含多糖、生物堿及少量黃酮和酚類物質(zhì)[1],大量藥理學(xué)研究表明鐵皮石斛具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、提高免疫力等諸多功效[2-3],極具藥用價(jià)值和保健特性。其中石斛多糖為鐵皮石斛藥用有效性和保健功能的主要體現(xiàn)物質(zhì)[4-6]。

鐵皮石斛自然條件下不易生長(zhǎng),且難以控制品質(zhì)質(zhì)量[7],現(xiàn)廣泛運(yùn)用的植物組織培養(yǎng)技術(shù)[1]確保了穩(wěn)定且充足的鐵皮石斛來(lái)源。在此基礎(chǔ)上,鐵皮石斛組培體系的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)急需確定并統(tǒng)一,因此組培過(guò)程中多糖積累的研究是獲得穩(wěn)定且高質(zhì)的種苗的前提,由此盡可能獲得多糖含量高的原料來(lái)源,實(shí)現(xiàn)功能保健性與經(jīng)濟(jì)利益的最大化。

目前鐵皮石斛多糖積累的研究多局限在單一因素如激素[8]、基本培養(yǎng)基[9]、溫濕度[10]等,對(duì)多因素的綜合作用研究較淺。故本實(shí)驗(yàn)基于具有強(qiáng)生命活性的原球莖為載體,以多糖含量為篩選指標(biāo),研究了多種不同因素對(duì)鐵皮石斛的多糖積累的影響,從而獲得優(yōu)化后多糖含量高的組培苗,以便進(jìn)行后期進(jìn)一步生產(chǎn)與加工。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛種子 陜西秦脈蘭業(yè)有限公司;硝酸鉀 深圳南山有限公司，分析純;硝酸銨 西安化學(xué)試劑廠，分析純;蔗糖 天津盛奧化學(xué)試劑有限公司，分析純;芐基腺嘌呤(BA) 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，化學(xué)純;激動(dòng)素(KT) 上海山浦化工有限公司,化學(xué)純;無(wú)水葡萄糖 天津市科密歐有限公司,分析純;香蕉汁、椰汁 均為市售自配。

SC-3610型低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;DZ-1BC型真空干燥箱 上海艾測(cè)電子科技有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 西安安泰儀器科技有限公司;UV-2600型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海儀分科學(xué)儀器有限公司;電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;高壓滅菌鍋 杭州亞旭生物科技有限公司;250B型光照培養(yǎng)箱 金壇市城東新瑞儀器廠;SW-CJ-1型單人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原球莖的獲得 選取長(zhǎng)勢(shì)均一良好的鐵皮石斛種子,在超凈工作臺(tái)上用氯化汞處理1 min和無(wú)水乙醇沖洗5～8次后,接種至MS+NAA 0.4 mg/L+BA 1.8 mg/L+椰汁100 g/L固體培養(yǎng)基放在光照培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)溫度為(20±2) ℃，濕度為60%，pH為5.5，保證光照10 h/d,光照強(qiáng)度(3000±20) lx,增殖繼代3次,每20 d繼代1次,選出長(zhǎng)勢(shì)均勻翠綠茁壯的原球莖。

1.2.2 原球莖的轉(zhuǎn)接培養(yǎng) 選取長(zhǎng)勢(shì)均勻翠綠的原球莖,按照下述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)接種到不同配方的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)條件與1.2.1保持一定,培養(yǎng)50 d后對(duì)原球莖進(jìn)行多糖含量的測(cè)定。

1.2.3 多糖的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[11-12]。

1.2.4 Plackett-Burman設(shè)計(jì) 基于Minitab軟件進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),所選的每個(gè)因素取高低兩個(gè)水平,高水平一般為低水平的1.5～2.5倍。通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)工作,本實(shí)驗(yàn)選出影響較大的7個(gè)因素,即氮源分子比、蔗糖、BA、KT、接種量、香蕉汁、椰汁。其他因素如NAA、溫度、pH、光照時(shí)間和強(qiáng)度保持恒定,選用N=12的Plackett-Burman 設(shè)計(jì)表,另設(shè)3個(gè)虛擬變量,用于考察實(shí)驗(yàn)誤差。各因素所代表參數(shù)、水平見(jiàn)表1。根據(jù)所得結(jié)果分析各因素對(duì)多糖含量Y水平的效應(yīng),并進(jìn)行顯著性(p<0.05)評(píng)價(jià),從而獲得對(duì)Y水平有顯著影響的因素,篩選后的不顯著因素在本實(shí)驗(yàn)不再考慮進(jìn)行深入研究,之后進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)皆取最低水平。

表1 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

注:硝態(tài)氮和銨態(tài)氮分子比是在氮濃度為60 mmol/L的情況下分子比的比值。

1.2.5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在得到顯著因素后,使因素水平同時(shí)朝向響應(yīng)值的最大方向變化,逼近最大響應(yīng)區(qū)間找出峰值,才能建立有效響應(yīng)面方程[13]。在本實(shí)驗(yàn)中,對(duì)多糖含量影響不明顯的因素都選取最低水平,將得到的3個(gè)顯著因素(硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比、蔗糖、BA)根據(jù)響應(yīng)值最大化的方向?yàn)榕榔路较?再依據(jù)3個(gè)顯著因素各因素效應(yīng)值與比例來(lái)確定變化步長(zhǎng),以便更快鎖定最佳值區(qū)域。

1.2.6 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù) Box-Behnken的中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,結(jié)合之前得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,基于Desgin-Expert軟件進(jìn)行Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。以多糖含量為考察指標(biāo),選取硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比(A)、蔗糖(B)、BA(C)3個(gè)對(duì)顆粒質(zhì)量影響較顯著的因素為自變量,每個(gè)自變量的低、中、高實(shí)驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼。每組重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果取均值,實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)試驗(yàn)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels in RSA

注:硝態(tài)氮和銨態(tài)氮分子比是在氮濃度為60 mmol/L的情況下分子比的比值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析和顯著性研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選主效應(yīng)因子

以鐵皮石斛原球莖為實(shí)驗(yàn)材料,以多糖含量為響應(yīng)值,對(duì)影響多糖含量的7個(gè)因素(硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比、蔗糖、BA、KT、接種量、香蕉汁、椰汁)進(jìn)行綜合全面的篩選,并于3個(gè)空項(xiàng)(D、G、J)作誤差分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3,7個(gè)因素對(duì)考察指標(biāo)影響的次序見(jiàn)圖1和表4。

圖1 影響因素標(biāo)準(zhǔn)化的帕拉圖Fig.1 Pareto chart of influencing factor standardization

由圖1和表4可知,因素B(蔗糖)、E(BA)、F(硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比)效應(yīng)顯著,p值分別為0.031、0.045、0.048,可作為Box-Behnken進(jìn)一步優(yōu)化研究實(shí)驗(yàn)的因素。其他因素效應(yīng)不顯著,對(duì)響應(yīng)值影響不大,出于顯著性影響和經(jīng)濟(jì)成本的考慮,凡是影響不顯著因素取低水平保持一致即可。

表3 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(n=3)Table 3 Design and results of Plackett-Burman tests(n=3)

表4 回歸系數(shù)顯著性分析Table 4 Significance analysis of regression coefficient

注:p<0.01為極顯著**,p<0.05為顯著*。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,可以看出因素B(蔗糖)、E(BA)、F(硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比)對(duì)于原球莖多糖含量均有積極的促進(jìn)作用。適當(dāng)?shù)卦黾右蛩谺(蔗糖濃度)、E(BA濃度)、F(硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比)的量,會(huì)使多糖含量升高。蔗糖為原球莖提供了能量來(lái)源和大分子物質(zhì)[14]的合成材料,加速其新陳代謝,有效促進(jìn)了石斛多糖的合成。而氮源的比例使原球莖朝著增殖或分化的方向發(fā)展[15],多糖的積累大多在分化階段。當(dāng)培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮多過(guò)銨態(tài)氮,表現(xiàn)為石斛多糖含量的增加時(shí),則說(shuō)明硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比越高會(huì)促進(jìn)原球莖分化,從而積累更多的活性成分。細(xì)胞分裂素BA的加入可有效促進(jìn)原球莖的生長(zhǎng)活性[16],一定程度上會(huì)促進(jìn)多糖的積累。

按照之前PB法得出的三個(gè)顯著影響因素效應(yīng)的大小確定最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的爬坡方向和步長(zhǎng),盡可能來(lái)逼近最大響應(yīng)值(多糖含量)的區(qū)域,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可以看出,在第4組實(shí)驗(yàn)中多糖含量最高,表明第4組實(shí)驗(yàn)的周圍存在著最優(yōu)點(diǎn)。則用實(shí)驗(yàn)4的條件為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn),即蔗糖濃度、BA濃度、硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比分別為30 g/L、1.6 mg/L、2∶1。

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 5 Design matrix and experimental results of steepest accent

2.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)三個(gè)因素硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比(A)、蔗糖濃度(B)、BA濃度(C)進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì),并利用Design-Expert軟件對(duì)15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析,如表6顯示為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果。實(shí)驗(yàn)9、14、15為區(qū)域的中心點(diǎn),另外12個(gè)點(diǎn)為析因點(diǎn)。

表7 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 7 Analysis of variance of Box-Behnken experiment

注:p≤0.0001為高度顯著,用**表示;p≤0.05為顯著,用*表示;p>0.05為不顯著。

表6 RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 6 Experimental design of RSM and corresponding results

實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)方差分析后所得模型的二次多項(xiàng)回歸方程:Y=33.85-0.27A-1.12B+0.79C+1.34AB-1.17AC-0.70BC-4.29A2-4.04B2-2.20C2。

在本實(shí)驗(yàn)所選定的因素水平范圍內(nèi),各因素對(duì)原球莖多糖含量的影響順序?yàn)?蔗糖>BA>硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比。根據(jù)回歸方程作出的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖見(jiàn)圖2～圖4。圖中能夠較為清楚地表現(xiàn)出各因素及其兩兩之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。根據(jù)等高線的形狀可以判斷兩因素間的交互效應(yīng)對(duì)響應(yīng)值的影響,圓形表現(xiàn)為不顯著,而橢圓形體現(xiàn)著顯著。

圖2 氮源分子比和蔗糖對(duì)多糖含量交互影響的 響應(yīng)面面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for effect of interaction between nitrate/ammonium molecule ratio and sucrose

圖2顯示了當(dāng)BA濃度一定時(shí),多糖含量隨著氮源分子比和蔗糖添加量的增加而增加,且蔗糖添加量比氮源分子比對(duì)多糖含量影響更為明顯,從等高線圖可判斷出這兩個(gè)因素間存在明顯的交互作用。如圖3所示,當(dāng)蔗糖添加量一定時(shí),一定范圍內(nèi)多糖含量隨著硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比和BA濃度的增加而增加,且BA濃度相對(duì)于氮源分子比對(duì)多糖含量更顯著,這兩個(gè)因素之間存在著明顯的交互作用。觀察圖4響應(yīng)面圖的響應(yīng)趨勢(shì)可知,多糖含量隨著蔗糖和BA濃度的加大而增加,但到達(dá)中心區(qū)域后,多糖含量下降,并且蔗糖濃度相對(duì)BA濃度對(duì)多糖含量影響更為顯著。由等高線圖和方差分析表可知蔗糖添加量和BA濃度兩個(gè)因素之間不存在交互作用。

圖3 氮源分子比和BA對(duì)多糖含量交互影響的 響應(yīng)面面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots for effect of interaction between nitrate/ammonium molecule ratio and BA concentration

圖4 蔗糖和BA對(duì)多糖含量交互影響的 響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for effect of interaction between sucrose and BA concentration

2.4 最佳培養(yǎng)條件的驗(yàn)證

通過(guò)Design-Expert軟件根據(jù)二次多項(xiàng)回歸方程求一階偏導(dǎo)得出Y的極大值是在A=-0.09,B=-0.87,C=0.05,即硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比、蔗糖、BA分別為1.91∶1,29.13 g/L,1.65 mg/L時(shí)原球莖的多糖含量最大為34.05%,相對(duì)于優(yōu)化前實(shí)驗(yàn)(MS+BA 2.0 mg/L)得到的多糖含量25.36%已有顯著提升?？紤]到實(shí)際操作和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的可行性,將上述最佳條件修正為硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比為1.90∶1,蔗糖添加量為29.1 g/L,BA濃度為1.65 mg/L。在此條件下重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)5次,測(cè)得培養(yǎng)的原球莖多糖平均含量為33.95%,與理論預(yù)測(cè)值34.05%的相對(duì)誤差較小,這說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中的回歸方程適合于原球莖多糖含量的預(yù)測(cè)和分析。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在鐵皮石斛快繁體系中選擇生長(zhǎng)旺盛的原球莖階段作為多糖積累的載體,運(yùn)用Plackett-Burman設(shè)計(jì)從7種影響原球莖多糖含量的培養(yǎng)基成分中確定了硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比、蔗糖和BA濃度為影響多糖含量最顯著的影響因素。本著最快找出中心點(diǎn)的目的,設(shè)計(jì)了最陡爬坡實(shí)驗(yàn)并進(jìn)一步進(jìn)行Box-Behnken Design響應(yīng)面方法分析,得出回歸模型存在的最優(yōu)結(jié)果為:當(dāng)硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比、蔗糖濃度、BA濃度分別為1.90∶1,29.1 g/L,1.65 mg/L時(shí),多糖含量由優(yōu)化前的25.36%提高到了33.95%,優(yōu)化效果明顯,在保證快速繁育的同時(shí)得到了較高質(zhì)量的鐵皮石斛苗。

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