具高乙醇耐受力酵母菌的 選育及其在獼猴桃果酒中的應(yīng)用

陳忠軍,楊小沖,趙 潔,胡佳星,袁文艷

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

獼猴桃在我國歷史悠久,素有“水果之王”的美稱。其原產(chǎn)于我國,成熟的獼猴桃果實,果肉多汁,香酸甜度適中,別俱風(fēng)味,除鮮食外,還可制成果醬、果汁、果脯、糖水罐頭等。獼猴桃含豐富維生素C(含量比蘋果高數(shù)倍乃至數(shù)十倍)[1]和維生素E,獼猴桃籽油中的亞麻酸、不飽和脂肪酸和活性油脂[2]及抗突變谷胱甘肽[3]等物質(zhì),還具有一定的藥用價值。因而得到國內(nèi)外的重視和歡迎,但是獼猴桃的保藏技術(shù)尚不完善,為保持其營養(yǎng)價值的同時又能符合人們飲食結(jié)構(gòu)的改變,石瑞麗[4]以紅心獼猴桃為原料探索了獼猴桃果酒的發(fā)酵工藝,發(fā)酵所得獼猴桃果酒平均酒精度為12%vol,酒體醇厚清澈。釀制的獼猴桃果酒較獼猴桃果汁相比含有更多的多酚及黃酮類物質(zhì)[5]。但迄今為止,我國對獼猴桃果酒的開發(fā)研究仍較少,技術(shù)路線尚未成熟,商業(yè)規(guī)模還未形成,因而開發(fā)獼猴桃果酒具有巨大的市場前景。

酵母菌是果酒釀造的重要微生物,在其發(fā)酵過程中會產(chǎn)生酒精,而酒精作為釀酒酵母厭氧發(fā)酵的產(chǎn)物,當(dāng)酒精濃度為4%vol時,便會對其細胞本身產(chǎn)生毒害作用,使一些酵母菌株對糖、離子及氨基酸的吸收率降到50%[6],同時抑制細胞的增殖和代謝,使得發(fā)酵不完全,酒精產(chǎn)率較低,從而影響產(chǎn)品的質(zhì)量與產(chǎn)量。吳華昌等[7]為獲得耐酒精能力較強的酵母在白酒窖池酒糟中分離得到一株乙醇耐受力為18%vol,產(chǎn)酒精能力為9.5%vol的菌株A2,而傳統(tǒng)的釀酒酵母乙醇耐受性只有10%vol左右[8]。因釀酒酵母產(chǎn)酒精能力與耐酒精能力是密不可分的,本文將實驗室保存的野生型高產(chǎn)高耐的酵母菌株進行了誘變處理后選育正向突變菌株,并將其作為發(fā)酵菌株對獼猴桃果酒的釀造工藝進行研究,為釀酒企業(yè)菌株選育及獼猴桃果酒的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌種 實驗室篩選出的野生型酵母菌株HJ-1;新鮮獼猴桃 購買于家樂福超市;YPD液體培養(yǎng)基 葡萄糖20 g、大豆蛋白胨10 g、酵母浸膏10 g、水1000 mL、pH=6.0、115 ℃滅菌20 min;YPD固體培養(yǎng)基 葡萄糖20 g、大豆蛋白胨10 g、酵母浸膏10 g、瓊脂20 g、水1000 mL、pH=6.0、115 ℃滅菌20 min;發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖350 g、酵母浸膏10 g、大豆蛋白胨20 g、硫酸銨1 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂1 g、水1000 mL、pH=6.0、115 ℃滅菌20 min;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;檸檬酸鈉 大自然生物集團有限公司;蔗糖 市售;實驗所用試劑除檸檬酸鈉與均蔗糖為食用級,其余均為分析純。

WBL25B36 三合一多功能家用榨汁機 美的科技企業(yè)集團;PB-10精密電子pH計 德國Sartorius;SE602F電子天平 奧豪斯儀器上海有限公司;HZQ-F100全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實驗設(shè)備廠;LRH-500F生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;752紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司;PAL-1糖度儀 TOKOY ATAGO;WZB數(shù)顯折光儀 上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺 濟南來保醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化 將實驗菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中,28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后,按照2%的接種量,根據(jù)上述操作再次進行傳代,至第三代活菌濃度為3×107cfu/mL為止,以下實驗所用均為三代菌液。

1.2.2 菌株的紫外誘變及正突變菌株的篩選

1.2.2.1 紫外誘變 根據(jù)預(yù)實驗,將出發(fā)菌株HJ-1活化后用生理鹽水制成濃度為1×108cfu/mL左右的菌懸液在距離30 W紫外燈源25 cm處直接照射120 s時菌株致死率約為85%。選擇紫外照射致死率為85%的誘變時間[9],將培養(yǎng)18 h后處于對數(shù)生長期的HJ-1菌懸液按上述條件紫外誘變處理120 s,并將誘變處理后的菌懸液按照5%的接種量接種于酒精濃度為16%vol的YPD液體培養(yǎng)基當(dāng)中,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)48 h后,用劃線的方法接種于YPD固體培養(yǎng)基中并在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h,從中挑選菌落飽滿且較大的優(yōu)勢菌株。

1.2.2.2 TTC法篩選實驗 將挑取的突變菌株采用劃線的方法接種于TTC下層培養(yǎng)基[10]中,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,在TTC下層培養(yǎng)基上覆蓋一層TTC上層培養(yǎng)基[10],并于28 ℃的條件下保溫培養(yǎng)3 h,觀察培養(yǎng)平皿中的顯色情況[11],從中篩選出菌落顯色明顯的突變菌株。

1.2.2.3 杜氏小管篩選實驗 將經(jīng)TTC法篩出的顯色明顯的突變酵母菌株,按照5%的接種量分別接種于帶有杜氏小管的YPD液體培養(yǎng)基中,并排盡小管中的氣體,于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),分別在培養(yǎng)12、24、36 h時,觀察并記錄杜氏小管中的產(chǎn)氣情況[12]。

1.2.2.4 乙醇耐受力篩選實驗 將經(jīng)TTC法及杜氏小管篩選實驗篩得的菌株活化后按照5%的接種量分別接種于酒精濃度為16%、17%、18%、19%、20%的YPD液體培養(yǎng)基中,于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h,在λ=660 nm處測各菌液在不同酒精濃度下的吸光值。

1.2.2.5 搖瓶發(fā)酵篩選實驗 將經(jīng)乙醇耐受力篩選出的各突變酵母菌株,按照5%的接種量分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,放于28 ℃,130 r/min振蕩培養(yǎng)箱中進行發(fā)酵,每間隔24 h測其發(fā)酵醪液二氧化碳失重,發(fā)酵6 d后測定發(fā)酵培養(yǎng)基中殘?zhí)呛俊⒕凭?、可溶性固形物折光率及發(fā)酵醪液pH。

1.2.2.6 指標(biāo)測定 殘?zhí)呛坎捎帽銛y式手持糖度儀測定;二氧化碳失重采用電子天平精稱的方法[13],測定每間隔24 h發(fā)酵醪液的二氧化碳失重;酒精度根據(jù)國標(biāo)GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》蒸餾后酒精計法[14]測定;pH采用精密電子pH計測定;糖醇轉(zhuǎn)化率[15]:按照公式S(%)=(C/G)×100 進行計算,式中:S為糖醇轉(zhuǎn)化率(%),C為酒精度(%vol),G為消耗糖度(Brix);可溶性固形物折光率:使用數(shù)顯折光儀進行測定。

1.2.3 獼猴桃果酒生產(chǎn)工藝 為確保酵母能夠發(fā)酵完全,發(fā)酵前在獼猴桃果漿中按照100 g/L的比例添加蔗糖,固不在以糖添加量為影響因素設(shè)計單因素實驗。

1.2.3.1 獼猴桃果酒的工藝流程 獼猴桃鮮果→獼猴桃的分選→清洗→去皮→破碎打漿→調(diào)整成分→接種酵母菌→恒溫發(fā)酵→12 ℃陳釀90 d→過濾澄清→果酒

1.2.3.2 果漿初始pH對果酒品質(zhì)的影響 獼猴桃果漿初始pH為4.5,用檸檬酸鈉將獼猴桃果漿的pH分別調(diào)為4.5、4.8、5.2、5.5、6.0,在此基礎(chǔ)上對獼猴桃果漿分別接入2%的菌種,SO2添加量為60 mg/L在24 ℃下發(fā)酵7 d,以酒精度和感官評定為指標(biāo),研究pH對獼猴桃果酒發(fā)酵的影響。

1.2.3.3 接種量對果酒品質(zhì)的影響 獼猴桃果漿在SO2添加量為60 mg/L,果漿初始pH為4.5條件下分別以體積分數(shù)為1%、2%、3%、4%、5%的接種量進行接種,然后置于24 ℃恒溫發(fā)酵7 d,測定酒精度,并進行感官評定。

表2 感官評定標(biāo)準Table 2 Sensory evaluation criteria

1.2.3.4 SO2添加量對果酒品質(zhì)的影響 獼猴桃果漿在接種量為2%,果漿初始pH為4.5的基礎(chǔ)上,調(diào)整SO2添加量[16]分別為30、60、90、120、150 mg/L,然后將其置于24 ℃條件下恒溫發(fā)酵7 d,測定酒精度,并進行感官評定。

1.2.3.5 發(fā)酵溫度對果酒品質(zhì)的影響 獼猴桃果漿在接種量為2%,SO2添加量為60 mg/L,果漿初始pH為4.5的基礎(chǔ)上分別在20、22、24、26、28 ℃的溫度下恒溫發(fā)酵7 d,測定酒精度,并進行感官評定。

1.2.3.6 發(fā)酵時間對果酒品質(zhì)的影響 獼猴桃果漿在接種量為2%,SO2添加量為60 mg/L,果漿初始pH為4.5的條件下,24 ℃分別發(fā)酵5、6、7、8、9 d,測定酒精度,并進行感官評定。

1.2.3.7 正交實驗 在單因素水平實驗的基礎(chǔ)上,選擇影響顯著的果漿初始pH、接種量、SO2添加量、發(fā)酵溫度作為影響獼猴桃果酒發(fā)酵的主要因素,并根據(jù)表1設(shè)計L9(34)正交實驗,以感觀評定及酒精度作為指標(biāo),確定獼猴桃果酒的最佳生產(chǎn)工藝。

表1 實驗因素與水平Table 1 Experimental factors and levels

1.2.3.8 感官評定指標(biāo) 發(fā)酵的獼猴桃果酒共邀請12名實驗室的成員進行品嘗,并根據(jù)表2感官評定標(biāo)準進行感官評分,評定分數(shù)采用100分制,取其總分的平均分值為最終的感官評價得分。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 實驗重復(fù)三次,以減少實驗誤差。實驗數(shù)據(jù)利用Excel軟件進行處理分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 正突變菌株的篩選

將處于對數(shù)生長期的HJ-1菌株經(jīng)紫外誘變處理后,經(jīng)16%vol酒精濃度的YPD液體培養(yǎng)基篩選后采用劃線的方法從中共挑出6株菌株長勢比較健壯,菌落較大且飽滿的突變菌株HJ-1A、HJ-1B、HJ-1C、HJ-1D、HJ-1E、HJ-1F,作為后續(xù)實驗菌株。

2.1.1 TTC法篩選實驗 采用劃線的方法,將6株突變菌株接種于TTC培養(yǎng)基中,6株突變菌株中HJ-1B、HJ-1C、HJ-1E與HJ-1F菌株的顯色結(jié)果最明顯,為深紅色,其次為HJ-1A菌株與HJ-1D菌株,顯色為紅色,根據(jù)菌株產(chǎn)酒精能力越強,顯色反應(yīng)越明顯原理[17]共挑選出HJ-1F、HJ-1B、HJ-1E與HJ-1C四株酵母菌株,進行杜氏小管篩選實驗。

2.1.2 杜氏小管篩選實驗 HJ-1B、HJ-1C、HJ-1E、HJ-1F四株突變菌株的產(chǎn)氣情況如表3所示。

表3 杜氏小管篩選產(chǎn)氣結(jié)果Table 3 The result of screening of gas production in the proximal tubule

注:“+”表示氣體約占杜氏小管體積的1/5;“++”表示氣體約占杜氏小管體積的2/5;“+++”表示氣體約占杜氏小管體積的3/5;“++++”表示氣體約占杜氏小管體積的4/5;“+++++”表示杜氏小管充滿氣體。

由表3可知,其中HJ-1B菌株的產(chǎn)氣性能最好,其次為HJ-1C。培養(yǎng)12 h后菌株HJ-1C僅有少量產(chǎn)氣,當(dāng)培養(yǎng)至24 h時產(chǎn)氣已約占杜氏小管體積的4/5?？赡茉谂囵B(yǎng)初期菌株以增殖為主,發(fā)酵性能較差,產(chǎn)氣較少,增殖完成后,菌株活性增強,發(fā)酵性能突出,故產(chǎn)氣劇增。HJ-1B與HJ-1C在培養(yǎng)24 h時,產(chǎn)氣已充滿杜氏小管體積的4/5,而HJ-1E與HJ-1F在24 h時杜氏小管中氣體僅占3/5,HJ-1E直至36 h時,小管中才充滿了4/5的氣體,HJ-1F菌株在48 h后產(chǎn)氣才將杜氏小管充滿,故將HJ-1B與HJ-1C、HJ-1E作為乙醇耐受力篩選實驗菌株。

2.1.3 乙醇耐受力篩選實驗 HJ-1B與HJ-1C、HJ-1E三株突變菌株在不同酒精濃度的YPD液體培養(yǎng)基中的生長情況如圖1可知,HJ-1B與HJ-1E菌株的乙醇耐受力最好,最高可耐受18%vol的酒精,其次為HJ-1C菌株,乙醇耐受力為17%vol。當(dāng)酒精濃度達到19%vol時,三株突變菌株均不能正常生長。因此,將HJ-1B與HJ-1E作為發(fā)酵菌株,進行搖瓶發(fā)酵實驗。

表4 搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果Table 4 The result of shake flask fermentation

圖1 突變菌株的酒精耐受實驗Fig.1 Alcohol tolerance test of mutant strain

2.1.4 搖瓶發(fā)酵篩選實驗 HJ-1B與HJ-1E兩株突變菌株搖瓶發(fā)酵6 d后的結(jié)果如表4所示。

由表4可知,HJ-1E菌株產(chǎn)酒精能力最強,酒精度為11.9%vol,糖醇轉(zhuǎn)化率為68.79%,而HJ-1B菌株產(chǎn)酒精能力稍弱為10.4%vol,兩突變菌株比實驗室保藏菌株HJ-1產(chǎn)酒精能力(9.8%vol)與乙醇耐受力(15%vol)均有所提高,其中HJ-1E菌株的乙醇耐受性與產(chǎn)酒精能力最為突出,較出發(fā)菌株,其產(chǎn)酒精能力與乙醇耐受力分別提升了21.43%與20%,故將HJ-1E正向突變菌株作為獼猴桃果酒釀造菌株。

2.2 獼猴桃果酒加工工藝優(yōu)化

2.2.1 果漿初始pH對果酒的影響 獼猴桃壓果漿在不同pH條件下發(fā)酵的結(jié)果見圖2。

圖2 初始pH對果酒質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of initial pH on fruit wine quality

由圖2可知,pH對感官指標(biāo)、酒精度的影響比較大。在一定的pH范圍內(nèi),隨著獼猴桃果漿pH的增大,獼猴桃果酒的酒精度逐漸上升,感官評分增加。果漿初始pH若過高,不僅僅會破壞獼猴桃果漿中的營養(yǎng)成分,還會使果漿變成褐色,從而降低獼猴桃果酒的品質(zhì)[18]。當(dāng)初始pH為5.5時,獼猴桃果酒酒精度及感官評分均最高,說明獼猴桃果酒發(fā)酵適宜的pH為5.5。

2.2.2 接種量對果酒的影響 獼猴桃果漿分別按照不同的接種量接種發(fā)酵結(jié)果見圖3。在一定范圍內(nèi),接種量越大,發(fā)酵速度越快。一定程度的擴大接種量,可以提高菌體增殖速度,酵母菌株的代謝物也會隨之增多。但接種量過大,果汁中的營養(yǎng)物更多地消耗在菌體細胞生長繁殖上,導(dǎo)致代謝底物變少,發(fā)酵產(chǎn)物并不會因接種量增大而變多。由圖3可知,當(dāng)接種量為3%時獼猴桃果酒酒精度高且感官評分最高,表明在獼猴桃果酒釀造時適宜的接種量為3%。

圖3 接種量對果酒質(zhì)量影響Fig.3 Effect of inoculum concentration on fruit wine quality

2.2.3 SO2添加量對果酒的影響 獼猴桃果漿在添加不同濃度的SO2條件下發(fā)酵結(jié)果見圖4,可得隨著SO2添加量的增大,酒精度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)SO2添加量為60 mg·L-1時獼猴桃果酒的酒精度和感官評定均為最高。隨著SO2濃度的上升,雖能較好的抑制雜菌的生長,避免果酒因氧化而變色,但是濃度過高的SO2會超過酵母自身的耐受能力,對其呼吸作用產(chǎn)生抑制,使得發(fā)酵性能降低,酒精度呈遞減趨勢,這表明獼猴桃果酒生產(chǎn)時適宜的SO2添加量為60 mg·L-1。

圖4 SO2添加量對果酒質(zhì)量影響Fig.4 Effect of SO2 addition on fruit wine quality

2.2.4 發(fā)酵溫度對果酒的影響 獼猴桃果漿在不同溫度下發(fā)酵的結(jié)果如圖5,可知,發(fā)酵溫度對獼猴桃果酒感官評定的影響較明顯,在發(fā)酵溫度為22 ℃時,酒精度數(shù)和感官評定分值均為最高。造成這一現(xiàn)象的主要原因是隨著發(fā)酵溫度的升高,菌體繁殖速度加快,獼猴桃果汁里較多的糖分被用于菌體自身生長,導(dǎo)致糖醇轉(zhuǎn)化率降低,所釀獼猴桃果酒因酒精度偏低,口感一般,感官評分也相對較低。將發(fā)酵溫度控制在22 ℃,在此溫度下釀制的獼猴桃果酒不僅酸甜可口,而且果香濃郁。

圖5 發(fā)酵溫度對果酒質(zhì)量影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on fruit wine quality

2.2.5 發(fā)酵時間對果酒的影響 獼猴桃果漿不同時間下恒溫發(fā)酵的結(jié)果如圖6所示,隨著發(fā)酵時間的延長,酒精度呈上升趨勢,當(dāng)發(fā)酵時間為8 d時,酒精度和感官評定都達到最高,并逐漸趨于平穩(wěn)。說明獼猴桃果酒在發(fā)酵8 d時品質(zhì)達到最佳。

圖6 發(fā)酵時間對果酒品質(zhì)影響Fig.6 Effect of fermentation time on fruit wine quality

2.2.6 正交實驗 根據(jù)單因素實驗選定獼猴桃果漿初始pH、接種量、SO2添加量、發(fā)酵溫度四因素設(shè)計L9(34)正交實驗,其實驗結(jié)果見表5。

表5 正交實驗結(jié)果Table 5 The result of Orthogonal test

由表5可知,SO2添加量對果酒的酒精度及感官得分的影響最大。從發(fā)酵酒精度及感官評定結(jié)果顯示最佳組合為A3B3C1D3。即獼猴桃果酒的最佳工藝條件為:酵母菌接種量3.5%,SO2添加量70 mg/L,初始pH5.7,21 ℃發(fā)酵8 d。

2.2.7 驗證實驗 對正交實驗所得最佳工藝組合A3B3C1D3進行驗證實驗,實驗重復(fù)三次。在酵母菌接種量3.5%,SO2添加量70 mg/L,初始pH5.7,21 ℃發(fā)酵8 d條件下釀造的獼猴桃果酒酒體清澈、果香濃郁、入口甘爽,酒精度為13.3%vol,殘?zhí)菫?.9 Brix,糖醇轉(zhuǎn)化率可達52.44%。獼猴桃果酒最終的感官評分為86分,均優(yōu)于正交實驗其他組合,表明正交實驗所得的此優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

以自然界篩出的具有高乙醇耐受力酵母菌株HJ-1為出發(fā)菌株,紫外誘變處理后經(jīng)三級篩選最終獲得一株發(fā)酵性能提高的正向突變的菌株HJ-1E。發(fā)酵6 d后HJ-1E菌株可產(chǎn)酒精11.9%vol,乙醇耐受力為18%vol,較出發(fā)菌株HJ-1相比,HJ-1E菌株產(chǎn)酒精能力與乙醇耐受力分別提高了21.43%與20%,是一株極具研究與應(yīng)用價值的酵母菌株。

將HJ-1E酵母菌株應(yīng)用于獼猴桃果酒的發(fā)酵,通過單因素及正交實驗,確定了果酒的最佳發(fā)酵工藝條件為:酵母菌接種量3.5%,初始pH5.7,發(fā)酵溫度21 ℃,SO2添加量70 mg/L,在此條件下發(fā)酵8 d,獼猴桃果酒酒精度為13.3%vol,具有濃郁的獼猴桃果香和酒香。

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