反相高效液相色譜法測定治糜康栓中苦參堿和氧化苦參堿的含量

于 澎，宋鳳媛，錢 圳，董坤園，許天陽

（長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117）

治糜康栓由黃柏、苦參、枯礬、兒茶、冰片5味中藥組成[1]，其中苦參為豆科植物苦參（Sophora fl avescens Ait.）的干燥根，主要活性成分為苦參堿及氧化苦參堿。

治糜康栓原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅對黃柏中鹽酸小檗堿進(jìn)行了含量測定，但未說明苦參中活性成分的含量測定方法[2-3]。本文建立治糜康栓中苦參堿及氧化苦參堿總含量的測定方法，可以提升該制劑原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

LC-2030高效液相色譜儀（日本島津公司）、十萬分之一天平（METTLER TOLEDO）；色譜柱4.6 mm×250 mm，ZORBAX SB-C18，5 μm（Agilent Technoligies）；治糜康栓為市售品及自制品，苦參堿對照品（110805-200508）、氧化苦參堿對照品（110780-201508）由中國食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 治糜康栓的制備 1）市售栓劑：購自通化金馬藥業(yè)，批號20170530，保存?zhèn)溆谩?）實驗室自制治糜康栓：改進(jìn)藥典工藝路線，去掉醇沉步驟，其余步驟相同。2.2 苦參堿、氧化苦參堿的含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相：乙腈-磷酸鹽緩沖液（7 :93，每1.7 g磷酸二氫鉀加500 mL純水溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH = 3）；檢測波長：220 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；2種成分理論板數(shù)均不低于2 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 取苦參堿對照品、氧化苦參堿對照品適量，加流動相分別制成約0.2 mg/mL的苦參堿溶液及約0.1 mg/mL的氧化苦參堿溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取上述2種栓劑，剪碎，每個樣品約取3 g，置具塞錐形瓶中，加0.5 mL濃氨水，潤濕后加20 mL三氯甲烷，稱重，超聲（功率250 W，頻率50 Hz）25 min，放至室溫，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，取上清液并過濾。取5 mL續(xù)濾液，以中性氧化鋁柱為固定相（100～200目，5 g，內(nèi)徑為1 cm），依次用三氯甲烷20 mL、三氯甲烷-甲醇（7 : 3）20 mL洗脫，收集洗脫液并蒸干。用流動相溶解殘渣，定容至10 mL，搖勻，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 測定方法 取上述對照品以及供試品溶液各l0 μL，依次注入高效液相色譜儀，測定。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系 1）苦參堿線性關(guān)系：配制濃度為20、50、100、150、200 μg/mL 的苦參堿對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件測定，得到苦參堿線性回歸方程：Y=5 456.8X+5 992.5，r2=0.999 9；結(jié)果表明在20～200 μg/mL范圍內(nèi)呈線性。2）氧化苦參堿線性關(guān)系：配制濃度為10、25、50、75、100 μg/mL的氧化苦參堿對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件測定，得到氧化苦參堿線性回歸方程：Y=5 429.7X-1 164.6，r2=0.999 8；結(jié)果表明在10～100 μg/mL范圍內(nèi)呈線性。

2.3.2 精密度試驗 取2.2.2項下對照品溶液，分別重復(fù)測定6次，10 μL/次。得到苦參堿與氧化苦參堿含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.04%、0.15%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 精密稱取實驗室自制栓劑6份，按2.2.3項下制備方法制備，按2.2.1項下色譜條件測定，得出6份供試品中苦參堿及氧化苦參堿的總含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.84%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密稱取實驗室自制栓劑，按2.2.3項下制備方法制備，按2.2.1項下色譜條件，于0、2、4、8、12、24 h后分析測定，得出苦參堿及氧化苦參堿總含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.63%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的實驗室自制栓劑6份，每份約3.0 g，分別精密加入對照品適量，按2.2.3項下制備方法制備，按2.2.1項下色譜條件測定，得出實驗室自制栓劑中苦參堿和氧化苦參堿的回收率分別為98.75%、99.46%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.61%、2.29%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 含量測定實驗結(jié)果 取2.2.3項下供試品溶液，按

2.2.1 項下色譜條件測定，測定結(jié)果，見表1。

表1 實驗室自制栓劑及市售栓劑含量測定結(jié)果

3 小結(jié)

3.1 色譜柱的選擇 高效液相色譜法測定生物堿類成分，《中國藥典》分別收載了十八烷基硅烷鍵合硅膠柱和氨基柱測定法，但氨基柱價格較高不常用。同時預(yù)試驗結(jié)果表明其出峰時間過長，因此本試驗選擇了實驗室常用的十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，同時測定治糜康栓中苦參堿及氧化苦參堿的總含量[4]。

3.2 檢測波長的選擇 本試驗先后以205、210、215、220 nm為檢測波長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)波長越小，生物堿的吸收峰越大，但雜質(zhì)峰也隨之明顯，故本試驗采用220 nm為測定波長。

3.3 供試品制備方法的選擇 分別以二氯甲烷、三氯甲烷和乙醚作為提取溶劑，篩選后發(fā)現(xiàn)使用三氯甲烷并超聲處理，提取效率最高[5-7]。濃縮方式分別采用蒸干、常溫?fù)]干2種，結(jié)果表明，干燥方法對含量無顯著影響。為避免基線干擾，最終選擇以流動相定容供試品。

3.4 流動相的選擇 本次試驗分別嘗試了以甲醇-水（55 : 45）、甲醇-水-三乙胺（55 : 45 : 0.02）[8]、乙腈-水-三乙胺（20 : 80 : 0.02）、乙腈-磷酸鹽（10 : 90）作為流動相；經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液（7 : 93，1.7 g磷酸二氫鉀加500 mL純水溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH = 3）時，峰形較好，平衡時間最短，可以排除來自其他成分的干擾，目標(biāo)組分可與樣品中其他組分較好的分離[9-11]。

3.5 栓劑前處理工藝的優(yōu)化 實驗證明醇沉可能造成中藥有效成分的流失，影響中藥制劑的有效性，并且存在醇沉?xí)r間長等問題。本實驗證明未經(jīng)醇沉的栓劑中苦參堿和氧化苦參堿的總含量顯著增多，可見除非實踐證明醇沉法不影響有效成分含量和療效，否則一般不宜采取醇沉法，以傳承中醫(yī)藥傳統(tǒng)特色[12]。

結(jié)論：本實驗結(jié)果表明，單獨將苦參堿或氧化苦參堿含量作為含量測定指標(biāo)是不完整的，以它們的總量為定量指標(biāo)更恰當(dāng)[13-20]。本實驗建立的方法可以同時測定治糜康栓中苦參堿和氧化苦參堿的含量，方法簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，可以更加全面地評價治糜康栓的質(zhì)量狀況。由于本實驗研究的樣品數(shù)量少，尚無法制定該制劑的最佳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，今后將逐步積累數(shù)據(jù)，為制定治糜康栓質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

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