三硫烷二丁烯酸對金黃色葡萄球菌抑菌的研究

黃益娜，吳濤，劉銳，張民

（天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，食品生物技術(shù)教育部工程研究中心，天津科技大學(xué)食品生物技術(shù)與食品工程學(xué)院，天津 300457）

大蒜屬多草本植物，蘊含著大量的多功能硫化合物，具有廣譜抑菌、抗腫瘤、保護(hù)心血管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)血糖和提高免疫等多種生物活性[1～6]，目前，對其研究大部分集中在大蒜素上，但是，由于大蒜素的不穩(wěn)定及其提取分離純化難度大，價格昂貴，導(dǎo)致其市場應(yīng)用價值低，大蒜類生物醫(yī)藥制品等高端產(chǎn)品國內(nèi)未見報道[7]。因此，工作者對其含硫化合物中S-S(S=O)鍵為母體進(jìn)行了修飾合成、尋找合適的化合物成為當(dāng)今研究的熱點。Hisae等通過比較大蒜素(Allicin)、S-甲基亞磺酸硫代丙烯酯(AllS(O)Sme)、Z,E-亞硫?；惐?AllS(O)SPn-(Z,E))得出AllS(O)SMe、AllS(O)SPn-(Z,E)均有明顯的抑菌作用，最小抑菌濃度（MIC值）分別為5 mg/mL、80 mg/mL、20 mg/mL，但是抑菌效果較大蒜素Allicin弱[8]。任方奎發(fā)現(xiàn)大蒜素的不同衍生物抑菌活性隨著結(jié)構(gòu)的變化而改變，其中二(3-甲基-2-丁烯基)三硫醚比大蒜素效果好[9]。Jay等[10]通過比較不同含硫化物抑菌強(qiáng)弱表明：二烯丙基四硫化物>二乙基四硫化物>二甲基四硫化物>二烯丙基二硫化物>二乙基三硫化物>二甲基三硫化物>二丙基二硫化物>烯丙基二硫化物。這些研究表明了大蒜硫化合物中S-S(S=O)鍵是主要的抑菌結(jié)構(gòu)，其抑菌活性大小受其基團(tuán)結(jié)構(gòu)的影響。

近年來計算機(jī)技術(shù)的迅速發(fā)展，通過統(tǒng)計學(xué)方法以及揭示活性和結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系變化，以數(shù)學(xué)模型或圖形概況來表征量變規(guī)律，從而避免大量人力物力和財力的浪費，使其在化學(xué)、藥物設(shè)計、農(nóng)藥領(lǐng)域、醫(yī)藥領(lǐng)域和食品中的應(yīng)用越來越廣泛。但是，利用計算機(jī)技術(shù)通過構(gòu)效關(guān)系構(gòu)建模型來設(shè)計大蒜衍生物未見報道。本論文是通過前期構(gòu)建比較分子力場Comparative Molecular Field Analysis (CoMFA)模型，以二烯丙基三硫化物（DATS）為母體來改造、設(shè)計一種新的化合物TSDB，其對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC值）為16 μg/mL，抑菌強(qiáng)度是DATS的3倍，很好的提高了抑菌活性，并測定了生長曲線、電導(dǎo)率、培養(yǎng)液中蛋白含量基礎(chǔ)上，采用蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法、高效液相色譜測定有機(jī)酸變化、AnnexinV單染色法觀察細(xì)胞凋亡情況，重點研究了TSDB的抑菌機(jī)理，從而將TSDB開發(fā)成為抑菌劑提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

金黃色葡萄球菌，天津科技大學(xué)菌株保藏中心提供；95%三硫烷二丁烯酸（TSDB）、95%二烯丙基三硫化物（DATS），大連茵泰科技有限公司提供；NB營養(yǎng)肉湯，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白Marker，Takara Bio；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液等蛋白電泳相關(guān)試劑，北京索來寶科技有限公司；色譜純L-蘋果酸、L-乳酸、檸檬酸、草酸；磷酸二氫鉀；甲醇；冰乙酸；考馬斯亮藍(lán)；Tris；甘氨酸等其他的試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相，日本島津公司；倒置熒光顯微，CKX41-FL；垂直蛋白質(zhì)電泳儀，北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)，北京六一儀器，高速小型臺式離心機(jī)，Thermo Fisher；無菌操作臺，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

無菌操作條件下，將保藏中的菌種接種到肉湯（牛肉膏蛋白胨）培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，重復(fù)兩次。用接種環(huán)取活化后的菌液在斜面固體培養(yǎng)基上劃線接種，37 ℃培養(yǎng)24 h。活化后的受試菌液于NB液體培養(yǎng)基中37 ℃下培養(yǎng)8 h，調(diào)整細(xì)菌的終濃度約為105CFU/mL。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 SDS-PAGE電泳

參照文獻(xiàn)[11]，將細(xì)菌接種于6 mL NB營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)至對數(shù)生長期后的菌液，實驗組中加入MIC濃度的TSDB和DATS，未處理組為對照組，于37 ℃培養(yǎng)10 h，以4300 r/min離心10 min，去上清液，加入少量無菌PBS（pH=7.4)洗三次，加入300 μL的10 mg/mL溶菌酶溶液，37 ℃下放置20 min，4 ℃、4300 r/min離心5 min，取上清液30 μL加入10 μL Buffer，振蕩，于100 ℃熱水浴中10 min，15 μL上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，染色、脫色、拍照觀察菌體蛋白表達(dá)情況。

1.3.3 有機(jī)酸測定

按照文獻(xiàn)[12]，取培養(yǎng)至對數(shù)生長期后的菌液，實驗組中加入MIC濃度的TSDB和DATS，未處理組為對照組，于37 ℃培養(yǎng)10 h，43000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用無菌生理鹽水洗滌兩次后沸水浴10 min，取出后劇烈震蕩，并將其于10000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm微孔膜過濾后測定上清液中有機(jī)酸生成情況。

進(jìn)樣體積：10 μL；檢測波長：210 nm；柱溫：35 ℃；流動相：0.1 mol/L KH2PO4溶液（超純水配制，pH 2.65）和乙腈，溶液比例采用程序梯度洗脫，流速0.5 mL/min。

1.3.4 AnnexinV細(xì)胞凋亡測試

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液，調(diào)節(jié)菌體濃度大約為5×105CFU/mL，43000 r/min離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞兩次，加入500 μL結(jié)合液，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，隨后滴一滴上述細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞，于熒光顯微鏡下檢測。

1.4 統(tǒng)計分析結(jié)果

所有試驗重復(fù)三次，結(jié)果以X±SD（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）表示。采用SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，差異顯著采用Duncan法進(jìn)行比較，p<0.05即認(rèn)為存在顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 TSDB和DATS對蛋白質(zhì)合成的影響

TSDB和DATS對金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白合成的影響如圖1所示?？梢钥闯觯簩φ战M和處理組菌株活性蛋白電泳條帶有較大的差異。主要表現(xiàn)為分子質(zhì)量在44.3～200 ku之間的條帶變模糊或者消失，比較TSDB處理與DATS蛋白圖譜可知TSDB條帶明顯較DATS消失。

蛋白質(zhì)圖譜可以反映出它的全部基因組，因此功能蛋白質(zhì)的變化可以由凝膠電泳圖譜表現(xiàn)出來，其條帶深淺的改變、增加或缺失都表明蛋白表達(dá)量有所變化[13]。SDS-PAGE電泳蛋白條帶明顯改變的現(xiàn)象，說明了受試化合物TSDB和DATS可能影響了菌體蛋白的正常表達(dá)或影響了其功能，改變了細(xì)菌某些關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)或功能蛋白的合成。TSDB條帶明顯較DATS消失，可能是因為新化合物TSDB比DATS多了功能團(tuán)-COOH，使其與蛋白受體結(jié)合更牢固或者接觸面積增大，從而加強(qiáng)了抑菌活性。Ankri等研究結(jié)果表明大蒜素主要抑菌機(jī)理是通過與巰基的化學(xué)作用（比如乙醇脫氫酶、硫氧還蛋白等還原酶和RNA聚合酶），從而影響半胱氨酸蛋白活性，抑制蛋白質(zhì)合成來殺死細(xì)菌[14]。Saeed等人研究報道：蛋白質(zhì)條帶模糊和消失會隨處理時間不同而不同，是由大蒜或其它植物提取物抑制了蛋白的合成、表達(dá)[15]。張緯等研究發(fā)現(xiàn)在檸檬提取物作用下，蛋白質(zhì)條帶在分子量為14.4～43.0 ku之間缺失或變淺，表明檸檬提取物改變細(xì)菌蛋白組成和表達(dá)量[16]。

圖1 TSDB和DATS處理下金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of proteins extracted from S. aureus treated with TSDB and DATS

2.2 TSDB和DATS對有機(jī)酸代謝影響

圖2 TSDB和DATS對Saureus胞內(nèi)有機(jī)酸代謝影響Fig.2 Organic acids in the cell-supernatants after treating with the TSDB and DATS

代謝是一切生命形式活動的基本特征，微生物在代謝過程中，會產(chǎn)生多種的代謝產(chǎn)物，如氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸等[17]。其代謝產(chǎn)物會受外界環(huán)境的變化而不同。

由圖2中可知，實驗組中蘋果酸、草酸、檸檬酸和乳酸的含量相對于對照組明顯下降，其TSDB處理組金黃色葡萄球菌胞內(nèi)草酸和乳酸未檢測到，而DATS組金黃色葡萄球菌胞內(nèi)草酸含量下降至1.63 mg/L（降低了48.74%），是對照組的0.55倍；蘋果酸含量分別下降至5.49 mg/L和6.62 mg/L(減少了65.16%和57.99%)，呈顯著差異（p<0.05）。此外，TSDB組和DATS組檸檬酸含量分別減少至9.79 mg/L和12.32 mg/L（下降了56.18%、44.85%），表明TSDB處理組能夠改變金黃色葡萄球菌中有機(jī)酸代謝，其中對草酸和蘋果酸含量的影響強(qiáng)于DATS組。

金黃色葡萄球菌胞內(nèi)有機(jī)酸含量明顯的減少，說明TSDB和DATS改變金黃色葡萄球菌的細(xì)胞代謝途徑。檸檬酸、蘋果酸是三羧酸循環(huán)中的代謝產(chǎn)物，其含量明顯的減少，說明TSDB和DATS有可能抑制三羧酸循環(huán)中檸檬酸合成酶等關(guān)鍵酶的活性，導(dǎo)致代謝無法正常進(jìn)行[18,19]。同時，三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生的蘋果酸可以脫酸生成丙酮酸，并進(jìn)一步參與其它代謝途徑，由于TSDB和DATS處理使蘋果酸含量顯著降低，有可能導(dǎo)致中間代謝產(chǎn)物丙酮酸減少，進(jìn)而對蛋白質(zhì)、糖代謝造成一定影響。

2.3 TSDB和DATS對細(xì)胞凋亡的影響

AnnexinV是一種磷脂結(jié)合蛋白，能與細(xì)胞凋亡過程中翻轉(zhuǎn)到膜外的磷脂酰絲氨酸（PS）高親和力特異結(jié)合而呈現(xiàn)。PS外翻發(fā)生在細(xì)胞核破裂，DNA片段化出現(xiàn)之前，這使得AnnexinV與PS的結(jié)合成為凋亡早期的一種重要檢測手段。TSDB和DATS處理后金黃色葡萄球菌細(xì)胞凋亡情況如圖3所示?？梢钥闯?，未經(jīng)處理組圖中細(xì)胞膜表面呈蘋果綠色的圓點很少，而TSDB和DATS處理后細(xì)胞出現(xiàn)蘋果綠的圓點急劇增加，且TSDB組蘋果綠圓點比DATS組多，說明化合物TSDB和DATS處理使得細(xì)胞膜內(nèi)磷脂酰絲氨酸外翻，細(xì)胞凋亡。

實驗結(jié)果間接說明，TSDB和DATS主要是破壞金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜，其中TSDB對細(xì)胞膜的破壞效果要強(qiáng)于DATS，前期實驗室研究也表明大蒜降解產(chǎn)物主要是破壞大腸桿菌細(xì)胞膜，影響其內(nèi)環(huán)境的改變，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡[20]。研究報告大蒜素及其類似物對微生物的抑制機(jī)理一般為降解細(xì)胞壁，破壞細(xì)胞膜，內(nèi)容物外漏，抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死[21]。因此，細(xì)胞膜通透性增大，進(jìn)而改變胞內(nèi)外細(xì)胞正常代謝，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

圖3 TSDB和DATS處理后細(xì)胞凋亡情況Fig.3 Apoptosis of cells treated with TSDB and DATS

3 結(jié)論

TSDB對金黃色葡萄球菌SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，TSDB影響細(xì)菌蛋白質(zhì)代謝，可能促進(jìn)代謝過程中蛋白質(zhì)的降解；有機(jī)酸代謝實驗發(fā)現(xiàn)，TSDB對金黃色葡萄球菌作用10 h后，胞內(nèi)檸檬酸、草酸和蘋果酸含量明顯減少，表明此時的有機(jī)酸正常代謝受到影響；綜上可知，TSDB主要是破壞細(xì)胞膜，擾亂了細(xì)胞的正常代謝，破壞蛋白質(zhì)合成、有機(jī)酸代謝，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，這一研究的發(fā)現(xiàn)為TSDB成為一種新型食品防腐劑提供理論支持。

[1] Herman-Antosiewicz A, Powolny A A, Singh S V.Molecular targets of cancer chemoprevention by garlic-derived organosulfides [J]. Acta Pharmacol. Sin., 2007,28(9): 1355-1364

[2] Ross Z M, Gara E A O, Hill D J, et al. Antimicrobial properties of garlic oil against human enteric bacteria:evaluation of methodologies and comparisons with garlic oil sulfides and garlic powder [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(1): 475-480

[3] ?oli? M, Savi? M. Garlic Extracts Stimulate Proliferation of Rat Lymphocytes in Vitro by Increasing IL-2 and IL-4 Production [J]. Immunopharmacology & Immunotoxicology,2000, 22(1): 163-81

[4] Ruddock P S, Liao M, Foster B C, et al. Garlic natural health products exhibit variable constituent levels and antimicrobial activity against neisseria gonorrhoeae, staphylococcus aureus and enterococcus faecalis[J]. Phytother. Res., 2005,19(4): 327-334

[5] Yun H, Ban J O, Park K, et al. Potential therapeutic effects of functionally active compounds isolated from garlic [J].Pharmacology & Therapeutics, 2014, 142(2): 183-195

[6] Li X, Li C, Xiang Z, et al. Allicin ameliorates cardiac hypertrophy [J]. Cardiovasc. Drugs Ther., 2012, 26(6):457-465

[7] 李偉才.金鄉(xiāng)大蒜功能性食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在的問題及對策[J].財經(jīng)界:學(xué)術(shù)版,2016,9:30-31

LI Wei-cai. Problems and Countermeasures of garlic functional food industry development in Jinxiang [J].Financial Community: Academic Edition, 2016, 9: 30-31

[8] Yoshida H, Katsuzaki H, Ohta R, et al. Antimicrobial activity of the thiosulfinates isolated from oil-macerated garlic extract[J]. Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 1999, 63(3):591-594

[9] Ren F, He X, Deng L, et al. Synthesis and Antibacterial Activity of 1,3-Diallyltrisulfane Derivatives [J]. Bull. Korean Chem. Soc., 2009, 30(3): 687-690

[10] Kim J W, Huh J E, Kyung S H, et al. Antimicrobial activity of Alk(en)yl sulfides found in essential oils of garlic and onion [J]. Food Sci. Biotechnol., 2004, 13(2): 235-239

[11] 徐宗凱,林青青,周夢瑩.三種李斯特菌菌體蛋白提取方法的比較[J].生命科學(xué)研究,2015,19(1):29-33

XU Zong-kai, LIN Qing-qing, ZHOU Meng-ying.Comparison of three methods for extraction of non-secreted proteins from listeria [J]. Life Science Research, 2015, 19(1):29-33

[12] 肖香,王瑤,姜松,等.大蒜乙醇提取物對幾種腐敗菌的抑制作用[J].現(xiàn)代食品科技,2013,29(12):2894-2900

XIAO Xiang, WANG Yao, JIANG Song, et al. Antibacterial mechanism of garlic extract against specific spoilage organisms [J]. Modern Food Science and Technology, 2013,29(12): 2894-2900

[13] Aksakal. Analysis of whole cell protein profiles of Salmonella serovars isolated from chicken, turkey and sheep faeces by SDS-PAGE [J]. Vet Med-Czech, 2010: 259-263

[14] Ankri S, Mirelman D. Antimicrobial properties of allicin from garlic [J]. Microbes and Infection, 1999, 1(2): 125-129

[15] Rma S, Aa Z, Ah E N, et al. Biochemical studies on Culex pipiens (L.) (Diptera: Culicidae) exposed to Allium sativum,Citrus limon and Bacillus thuringiensis israelensis with reference to assessment of the biosafety on albino mice [J].Global Veterinaria, 2010, 4: 22-23

[16] 張緯,孫曉明,徐建設(shè),等.檸檬提取物對耐藥金黃色葡萄球菌[J].中國病原生物學(xué)雜志,2009,4(9):652-655

ZHANG Wei, SUN Xiao-ming, XU Jian-she, et al. Study of a lemon extrac'ts mechanism of inhibition of drug-resistant Staphylococcus aureus [J]. Journal of Pathogen Biology,2009, 4(9): 652-655

[17] 劉毅,徐維家,李妍.利用抗生素對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的影響進(jìn)行菌株區(qū)分[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2009,21(4):332-334

LIU Yi, XU Wei-jia, LI Yan. Identification of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa by antibiotic perturbation[J]. Chinese Journal of Microecology, 2009, 21(4): 332-334

[18] Angert E R, Losick R M. Propagation by sporulation in the guinea pig symbiont Metabacterium polyspora [J]. Proc. Natl.Acad. Sci. U S A, 1998, 95(17): 10218-10223

[19] 宋衛(wèi)國.大蒜提取液有效成分抑菌活性及其作用機(jī)理研究[D].泰安:東農(nóng)業(yè)大學(xué),2004

SONG Wei-guo. The antimicrobial mechanism of inhibitory components in garlic extract [D]. Tai’an: Shandong Agricultural University, 2004

[20] Wu T, Chen N. Investigating the chemical constituent and the suppressive effects of alliin hydrolysate on E.coli [J]. Natural Product Research, 2017: 1-4

[21] Booyens J, Thantsha M S. Fourier transform infra-red spectroscopy and flow cytometric assessment of the antibacterial mechanism of action of aqueous extract of garlic(Allium sativum) against selected probiotic Bifidobacterium strains [J]. BMC Complement Altern. Med., 2014, 14: 289