白扁豆多糖對神經(jīng)細(xì)胞缺氧性凋亡的保護(hù)機(jī)制

張賢益，李文娟，鐘 亮，潘 猛，湯小芳，姚于飛*

白扁豆又名扁豆，系豆科植物扁豆的成熟干燥種子，原產(chǎn)于印度、印度尼西亞等地，在漢、晉時(shí)期引入我國[1]。白扁豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值高、味甘性溫、生理活性強(qiáng)、作用范圍廣，其中碳水化合物含量高達(dá)57%[2]，含有蛋白質(zhì)、脂肪、微量的鈣、磷、鐵及多種維生素等重要的生理活性物質(zhì)，對食欲低下、胸悶胃虛、醉酒嘔吐等癥狀均具有良好的防治效果，在抗菌、抗腫瘤、抗氧化等方面均有重要的生理作用。從張廣智等[3]的研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧/復(fù)氧（anoxia/reoxygenation，A/R）除造成腦神經(jīng)細(xì)胞死亡之外，還會造成細(xì)胞主動凋亡[4]，此過程會受到相應(yīng)基因的表達(dá)與調(diào)節(jié)[5]。為了研究這種作用，參考神經(jīng)細(xì)胞的體內(nèi)生存環(huán)境，提供適宜的生長條件，實(shí)際模擬腦部A/R過程[6]，以建立大腦神經(jīng)細(xì)胞A/R應(yīng)激性損傷模型，根據(jù)A/R模型探究白扁豆多糖（dolichos bean seed polysaccharide，DBSP）對神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制[7]。相關(guān)研究證明細(xì)胞凋亡過程中相關(guān)基因的表達(dá)受DBSP提取物的影響，A/R損傷導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡受到抑制[8]，因此DBSP對神經(jīng)細(xì)胞的A/R應(yīng)激性損傷具有保護(hù)作用。為進(jìn)一步研究DBSP對神經(jīng)細(xì)胞缺氧性凋亡的保護(hù)機(jī)制，通過培養(yǎng)原代胎鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞[9]，建立A/R模型，即先用含糖培養(yǎng)液培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，在氮?dú)?、氧氣以及二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行缺氧處理，最后灌注復(fù)氧[10]，加入DBSP處理A/R損傷的胎鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞，與正常對照組比較細(xì)胞活性以及凋亡水平，同時(shí)使用流式細(xì)胞儀檢測相應(yīng)乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、線粒體膜電位及Ca2＋相對濃度的變化，來探究DBSP對體外培養(yǎng)的A/R損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制[11]，并根據(jù)阻斷劑組（LY294002＋DBSP＋A/R）研究PI3K-Akt信號通路對DBSP的神經(jīng)保護(hù)產(chǎn)生的介導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級SD大鼠6 只，體質(zhì)量（200±20）g，購自江西中醫(yī)藥大學(xué)動物科技中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（贛）2006-0001，動物合格證號：SCXK（贛）2005-0001，雌雄比例以1∶2合籠，共2 籠，合籠后于每天早晨觀察鼠況，若出現(xiàn)陰道栓則表明雌鼠受孕，孕16～18 d的胎鼠用作原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞。

DMEM 美國Thermo Fisher公司；特級馬血清北京索萊寶科技有限公司；DBSP 中國科學(xué)院成都生物研究所；胎牛血清 杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶 美國Amresco公司；Annexin V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）試劑盒 美國BD公司；噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 普博欣生物工程有限公司；Fluo-3/AM 美國Biotium公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3111型二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher公司；090-135.001型倒置顯微鏡 德國Leica公司；EPICSXL型流式細(xì)胞儀、Allegra-64R型離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；YQX-2型厭氧培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)器廠；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 胎鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)

取受孕第16～18天的SD大鼠，用體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛1.5 mL注入受孕大鼠的腹腔使其麻醉[12]，再用乙醇消毒[13]，用高壓蒸汽消毒的眼科剪沿兩耳連線剪開裂口，后以矢狀縫縱向剪口，彎鑷分離顱骨，沿顱縫T形剪口使大腦皮層暴露，取全腦置于預(yù)冷D-Hank’s液。在放大鏡下，用顯微剪和彎鑷分離全腦中的大腦皮質(zhì)并剪碎，收集大腦皮層約1 mm3的細(xì)小碎塊，用質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL胰酶在37 ℃的條件下消化0.5 h左右，DMEM液終止消化，后用移液槍轉(zhuǎn)入離心管，設(shè)置1 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀出來的細(xì)胞加以重懸。以2×106cells/孔、2×105cells/孔接種于6 孔或 96 孔培養(yǎng)板中，差速貼壁培養(yǎng)4 h后[14]，吸去培養(yǎng)基，加入NB培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，3 d后半量換液。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理方法

空白對照組：3 d細(xì)胞更換培養(yǎng)基后，于培養(yǎng)箱中再孵育2 d，在第5天加入復(fù)氧液，放置二氧化碳培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2、95%空氣）3 h，更換復(fù)氧液后繼續(xù)培養(yǎng)2 h。

A/R組：建立A/R損傷模型，細(xì)胞更換培養(yǎng)基后，換上模擬缺氧液，缺氧密閉容器置換成以95% N2、5% CO2持續(xù)通氣的環(huán)境（37 ℃），把細(xì)胞置于此缺氧密閉容器內(nèi)3 h，處理結(jié)束后取出培養(yǎng)板，換上模擬復(fù)氧液，缺氧密閉容器置換成以95% O2、5% CO2持續(xù)通氣的環(huán)境（37 ℃），把細(xì)胞置于此缺氧密閉容器內(nèi)，復(fù)氧培養(yǎng)2 h[15]。

DBSP＋A/R組：根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[16]，本實(shí)驗(yàn)選擇1.0 mg/mL作為DBSP的作用質(zhì)量濃度，在缺氧處理前加入1.0 mg/mL DBSP，其他同A/R組且全程給予DBSP。

LY294002＋DBSP＋A/R組（LY＋DBSP＋A/R組）：即在DBSP＋A/R處理組中加入PI3K-Akt信號通路抑制劑LY294002（20 μmol/L）后，培養(yǎng)細(xì)胞0.5 h，其他與DBSP＋A/R組相同。

1.3.3 檢測指標(biāo)

神經(jīng)細(xì)胞活性檢測：于96 孔培養(yǎng)板細(xì)胞中每孔加入20 μL 5 g/mL的MTT溶液，在5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄每孔的上清液[17]，每孔加150 μL裂解液二甲基亞砜溶解，振蕩10 min后于酶聯(lián)免疫檢測儀中測定490 nm波長處的各孔光密度值。細(xì)胞活性測定工作原理即一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶的形成量與細(xì)胞數(shù)成正比，光密度值越大則細(xì)胞活性越強(qiáng)。

細(xì)胞LDH的測定：實(shí)驗(yàn)處理后各組分別取孵育液200 μL，送往南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測，使用生化自動分析儀測定LDH。

細(xì)胞凋亡的測定：棄6 孔培養(yǎng)板培養(yǎng)上清液，用1.25 mg/mL胰酶進(jìn)行消化[18]，然后使用完全培養(yǎng)基終止消化，收集神經(jīng)細(xì)胞于離心管，設(shè)置2 000 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)液后收集沉淀，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細(xì)胞2 次，加結(jié)合緩沖液100 μL進(jìn)行懸浮，加入AnnexinV-FITC 5 μL標(biāo)記，最后加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）5 μL標(biāo)記染色，混勻，在室溫下進(jìn)行避光反應(yīng)10 min，再加入結(jié)合緩沖液400 μL，立即使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。其中，在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上[19]，左上限（FITC-/PI＋）對應(yīng)機(jī)械損傷所致死亡的細(xì)胞，左下限（FITC-/PI-）對應(yīng)活細(xì)胞，右上限（FITC＋/PI＋）對應(yīng)晚期凋亡細(xì)胞[20]，右下限對應(yīng)早期凋亡細(xì)胞（FITC＋/PI－），此實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用右下限的早期凋亡細(xì)胞數(shù)據(jù)。

Ca2＋相對濃度的測定：用20 μmol/L Fluo-3/AM分子探針來裝載細(xì)胞，用標(biāo)準(zhǔn)Tyrode溶液在37 ℃條件下反應(yīng)50 min，1 000×g離心收集細(xì)胞，10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸重懸，上樣，在流式細(xì)胞儀中檢測[21]，以Fluo-3/AM的熒光強(qiáng)度表示Ca2＋相對濃度。

細(xì)胞ROS相對含量的測定：收集神經(jīng)細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)約2×106個(gè)），3 000 r/min離心10 min，PBS清洗2 次后以0.5 mL DCFH-DA溶液（20 μmol/L）重懸。37 ℃孵育20 min，3 000 r/min離心3 min，棄上清液，PBS洗2 次細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀中檢測細(xì)胞內(nèi)2’,7’-二氯熒光素（2’,7’-dichlorofluorescein，DCF）的熒光強(qiáng)度[22]，以DCF的熒光強(qiáng)度來表示細(xì)胞內(nèi)ROS的相對含量，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)表明ROS相對含量越高。

細(xì)胞線粒體膜電位的測定：收集神經(jīng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105～5×105mL－1，1 000×g離心5 min，100 μL PBS重懸細(xì)胞，加入Rho123儲存液5 μL[23]，37 ℃孵育30 min，1 000×g離心5 min，棄上清液，500 μL PBS洗滌2 次，重懸細(xì)胞后用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞儀定量檢測[24]，設(shè)置一個(gè)陰性對照組即不加Rho123的細(xì)胞。流式細(xì)胞儀激發(fā)和發(fā)射波長分別為488 nm和530 nm，測定Rho123的熒光強(qiáng)度以表示線粒體膜電位。

Western blot法檢測蛋白質(zhì)量濃度：神經(jīng)細(xì)胞棄去上清液，繼而用預(yù)冷PBS除去殘留的培養(yǎng)基；6 孔板以80 μL/孔添加細(xì)胞裂解液、60 mm培養(yǎng)皿以300 μL/塊添加細(xì)胞裂解液（50 mmol/L Tris（pH 8.0）、150 mmol/L NaCl、1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）脫氧膽酸鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉、1%乙基苯基聚乙二醇、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、10 μg/mL胰蛋白酶抑制劑、10 μg/mL亮抑酶酞）。4 ℃孵育20 min后，將細(xì)胞及其碎片連同裂解液集中一側(cè)，繼續(xù)4 ℃孵育40 min，4 ℃、12 000×g離心5 min；收集上清液，即為本實(shí)驗(yàn)制備的蛋白樣本；將上清液一部分用來測蛋白質(zhì)量濃度外，其余用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或置于-80 ℃冰箱儲備。制備12%分離膠和5%積層膠，取等量蛋白上樣，電泳。電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)移，取出聚偏二氟乙烯膜，封閉2 h，結(jié)合一抗：磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）（一抗稀釋1 000 倍）和總蛋白激酶B（total protein kinase B，T-Akt）（一抗稀釋300 倍），4 ℃過夜或室溫平搖3 h。TBST緩沖液清洗膜上殘余一抗。結(jié)合二抗：將二抗稀釋2 000 倍后溶于封閉液中，室溫平搖2 h后，用TBST緩沖液清洗膜上殘余二抗；ECL檢測、曝光、顯影、定影[25]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 DBSP對神經(jīng)細(xì)胞活力的影響

表1 DBSP對神經(jīng)細(xì)胞活力的影響Table 1 Effect of DBSP on the viability of neurons

如表1所示，與對照組相比，A/R組中神經(jīng)細(xì)胞活力由1.270下降到0.850，極顯著下降，表明神經(jīng)細(xì)胞A/R損傷明顯。與A/R組相比，DBSP＋A/R中神經(jīng)細(xì)胞活力由0.850

上升到1.120，極顯著增加，表明DBSP對神經(jīng)細(xì)胞A/R損傷具有明顯的保護(hù)作用。

2.2 DBSP對神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放的影響

表2 DBSP對神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放的影響Table 2 Effect of DBSP on the release of LDH from nerve cells

如表2所示，與對照組相比，A/R組中LDH的釋放由17.21 U/L上升到27.52 U/L，極顯著增加，表明神經(jīng)細(xì)胞損傷。與A/R組相比，DBSP＋A/R組中LDH的釋放水平由27.52 U/L下降到17.33 U/L，極顯著下降，表明DBSP對受A/R損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

2.3 DBSP對神經(jīng)細(xì)胞Ca2＋相對濃度的影響

如圖1所示，與對照組相比，A/R組中神經(jīng)細(xì)胞Ca2＋相對濃度由19.30上升到194.91，極顯著增加。而DBSP＋A/R組與A/R組相比，細(xì)胞中的Ca2＋相對濃度由194.91下降至22.37，極顯著降低，表明DBSP可抑制A/R介導(dǎo)的Ca2＋相對濃度增加。

圖1 DBSP對神經(jīng)細(xì)胞Ca2＋相對濃度的影響Fig. 1 Effect of DBSP on neuronal Ca2+ relative concentration

2.4 DBSP對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

DBSP對神經(jīng)細(xì)胞凋亡影響如圖2所示，與對照組相比，A/R組中細(xì)胞凋亡率由5.03%增至46.68%，細(xì)胞凋亡率極顯著增加，表明A/R可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。而與A/R組相比，DBSP＋A/R組細(xì)胞凋亡率由46.68%下降至18.17%，表明DBSP處理神經(jīng)細(xì)胞后，A/R介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡顯著減少。

圖2 各實(shí)驗(yàn)分組對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響Fig. 2 Effect of DBSP on neuronal apoptosis

2.5 DBSP對神經(jīng)細(xì)胞ROS相對含量的影響

圖3 各實(shí)驗(yàn)組對胎鼠神經(jīng)細(xì)胞ROS相對含量的影響Fig. 3 Effect of DBSP on ROS of nerve cells from fetal rats

如圖3所示，與對照組相比，A/R組中神經(jīng)細(xì)胞ROS相對含量由94.69上升至154.88，極顯著增加，而DBSP＋A/R組與A/R組相比，細(xì)胞中的ROS相對含量由154.88下降至110.76，極明顯減少，表明DBSP可抑制A/R介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞ROS相對含量的增加。

2.6 DBSP對神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位的影響

圖4 各實(shí)驗(yàn)分組對胎鼠神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig. 4 Effect of DBSP on mitochondrial membrane potential in nerve cells from fetal rats

如圖4所示，與對照組相比，A/R組中神經(jīng)細(xì)胞的線粒體膜電位由138.81下降至91.73，極明顯降低，表明神經(jīng)細(xì)胞受A/R損傷，與A/R組相比，DBSP+A/R組中線粒體膜電位由91.73上升至126.84，極顯著增加。結(jié)果表明DBSP對A/R介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

2.7 DBSP對神經(jīng)細(xì)胞中T-Akt和p-Akt的蛋白表達(dá)影響

圖5 DBSP對神經(jīng)細(xì)胞中T-Akt和p-Akt的蛋白表達(dá)影響Fig. 5 Effect of DBSP on the expression of T-Akt and p-Akt protein in nerve cells

應(yīng)用PI3K-Akt信號通路抑制劑LY294002，研究神經(jīng)細(xì)胞中p-Akt和T-Akt的蛋白表達(dá)。結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，各組之間T-Akt的蛋白表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）。神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)DBSP處理后，與A/R組相比，p-Akt蛋白表達(dá)上調(diào)，給予PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻斷劑LY294002后抑制了DBSP介導(dǎo)的p-Akt蛋白表達(dá)。

3 討 論

神經(jīng)細(xì)胞是組成神經(jīng)系統(tǒng)的基本功能單位，腦部血流正常供應(yīng)才能保障其正常代謝活動，當(dāng)腦缺血時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞將發(fā)生壞死和凋亡[26]。由于大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞對缺氧復(fù)氧環(huán)境敏感，本研究通過體外培養(yǎng)胎鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞，模擬體內(nèi)環(huán)境，來探究外源物質(zhì)DBSP對胎鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。選取培養(yǎng)時(shí)間為16～18 d胎鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞作為原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞建立A/R損傷模型。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A/R處理大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞后，其細(xì)胞活性降低，神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加，LDH和ROS釋放量增加，表明A/R導(dǎo)致了神經(jīng)細(xì)胞損傷。給予A/R損傷的神經(jīng)細(xì)胞DBSP后，能抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和LDH、ROS的釋放，提高了神經(jīng)細(xì)胞的存活率，表明DBSP對神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

研究表明，細(xì)胞凋亡過程中，先出現(xiàn)線粒體膜電位的下降，再發(fā)生胞膜磷脂酰絲氨酸由內(nèi)而外的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致某些細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3被激活等變化。線粒體膜電位的下降可作為細(xì)胞凋亡的早期表現(xiàn)，且當(dāng)發(fā)生膜電位下降時(shí)，細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)，因此線粒體膜電位下降也是細(xì)胞凋亡的特征表現(xiàn)。當(dāng)發(fā)生A/R誘導(dǎo)時(shí)，線粒體通透性發(fā)生改變[27]，非特異性增加，基質(zhì)內(nèi)流入大量具有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，內(nèi)膜兩側(cè)離子梯度發(fā)生改變，線粒體膜電位崩潰，引起線粒體內(nèi)大量的正離子如Ca2＋外流等一系列變化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中利用流式細(xì)胞儀來檢測Rho123的熒光強(qiáng)度，定量神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位變化[28]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A/R組線粒體膜電位極顯著降低（P＜0.01），促進(jìn)細(xì)胞凋亡，DBSP能抑制A/R介導(dǎo)的線粒體膜電位下降。與對照組相比，A/R組中神經(jīng)細(xì)胞Ca2＋相對濃度由19.30上升到194.91，極顯著增加（P＜0.01），表明A/R介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷與Ca2＋相對濃度的大量增加有關(guān)，而DBSP＋A/R組與A/R組相比，細(xì)胞中的Ca2＋相對濃度由194.91下降至22.37，極顯著降低（P＜0.01），表明DBSP可顯著抑制A/R介導(dǎo)的Ca2＋相對濃度增加，促進(jìn)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

研究表明，PI3K-Akt信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[29]，該通路的激活在細(xì)胞最終存活中起關(guān)鍵性作用。既有抗細(xì)胞凋亡作用，又可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其中以抗細(xì)胞凋亡為主[30]。根據(jù)LY294002對PI3-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用，實(shí)驗(yàn)中使用LY294002處理神經(jīng)細(xì)胞，與DBSP＋A/R組相比，LY＋DBSP＋A/R組細(xì)胞活性以及線粒體膜電位顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，LDH釋放水平、ROS相對含量、Ca2＋相對濃度均顯著升高（P＜0.05），表明受到LY294002的阻斷作用，DBSP＋A/R預(yù)處理組對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的保護(hù)作用被削弱，實(shí)驗(yàn)證明DBSP＋A/R預(yù)處理組轉(zhuǎn)導(dǎo)PI3K-Akt信號通路對受A/R損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

綜上討論可知，DBSP可顯著抑制A/R介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷，導(dǎo)致LDH的釋放水平、ROS相對含量、Ca2＋相對濃度和細(xì)胞凋亡降低，線粒體膜電位和細(xì)胞活性顯著增加，即DBSP對A/R損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。通過PI3K-Akt通路抑制劑LY294002阻斷DBSP對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用得出，PI3K-Akt信號通路介導(dǎo)了DBSP的神經(jīng)保護(hù)作用。

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