榛仁免疫活性肽分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

王 鵬，王明爽，劉春雷，方 麗，王 輯，劉秀奇，閔偉紅*

榛子（Corylus heterophylla Fisch.）為樺木科榛屬植物的果實，含油脂、蛋白質(zhì)、碳水化合物、不飽和脂肪酸、纖維等多種營養(yǎng)成分[1]。榛仁中蛋白質(zhì)含量約占20%，氨基酸比例均衡，可滿足成年人對各種氨基酸的需要[2-3]。生物活性肽是蛋白質(zhì)中天然氨基酸以不同組成和排列方式構(gòu)成的從二肽到復雜的線性或環(huán)形的分子質(zhì)量不同的肽類總稱，是源于蛋白質(zhì)的多功能化合物[4]。目前，對榛仁蛋白質(zhì)開發(fā)利用主要集中于蛋白質(zhì)提取及肽的制備工藝等方面，對于其生物活性研究較少，而利用酶水解蛋白質(zhì)獲得的多肽具有多種生理活性，例如促進人體生長發(fā)育[5]、降低膽固醇[6]、抑菌[7]、降低高血壓[8]、調(diào)節(jié)免疫功能[9]等。

免疫系統(tǒng)是疾病預防的第一道防線，人們不健康的生活方式、飲食等皆可導致免疫力下降從而引發(fā)各種疾病。免疫活性肽是通過酶水解獲得具有免疫調(diào)節(jié)作用的肽段，一般為小分子物質(zhì)，不具有免疫原性，進入機體后不能誘發(fā)免疫排斥反應，且分子質(zhì)量在2 000 Da以下[10]。免疫活性肽能增強巨噬細胞吞噬功能和促進淋巴細胞增殖等，提高機體抵抗入侵病原體的能力[11-12]。目前，免疫活性肽主要研究酪蛋白[13]、小麥蛋白[14]、大豆蛋白[15]、大米蛋白[16]等。免疫活性肽以分子質(zhì)量小、活性和穩(wěn)定性強、生物活性高的優(yōu)勢，已經(jīng)引起人們的重視。食源性免疫活性肽跟傳統(tǒng)藥物相比無毒副作用，人們通過食用免疫活性肽來提高自身免疫力，日漸成為主流趨勢[17]。王明爽等[18]以水解度為指標，用堿性蛋白酶制備榛仁水解肽，發(fā)現(xiàn)水解度為38.08%的榛仁水解肽能提高小鼠免疫調(diào)節(jié)功能。Ren Dayong等[19]利用超濾將榛仁水解肽分成3 個組分，短期喂養(yǎng)小鼠，發(fā)現(xiàn)低分子質(zhì)量榛仁水解肽有免疫調(diào)節(jié)作用。

本研究在確定分子質(zhì)量小于3 kDa的多肽具有較好免疫調(diào)節(jié)活性的基礎(chǔ)上，通過凝膠色譜、反相高效液相色譜（reversed-phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）和飛行質(zhì)譜對其進行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，并對獲得的六肽進行驗證，為榛仁免疫活性肽的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂榛仁粕購買于長白山地區(qū)；榛仁分離蛋白酶解后經(jīng)超濾獲得的分子質(zhì)量小于3 kDa組分，經(jīng)凍干獲得粉狀物。

噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazd-2-yl)-2,5-diphenylentrazolium bromide，MTT）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、伴刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）、Sephadex G-25、Sephadex G-15 美國Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國Gibco公司；小鼠腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）和白介素-6（interleukin-6，IL-6）的酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 美國Research and Development公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1B-50型冷凍干燥機 北京博醫(yī)康儀器有限公司；RSA224S型分析天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司；DBS全自動部分收集器 上海嘉鵬科技有限公司；BT-100恒流泵、HD-21-88紫外檢測器 上海琪特分析儀器有限公司；CB150型CO2培養(yǎng)箱 德國BINDER公司；AE31倒置顯微鏡 麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；1200型快速分離液相色譜系統(tǒng) 美國Agilent公司；SPECTRA-MAX190型酶標儀 美國Molecular Devices公司；Q Exactive四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀美國Thermo Fisher Scientiベc公司。

1.3 方法

1.3.1 Sephadex G-25凝膠層析

將分子質(zhì)量3 kDa肽粉配成35 mg/mL溶液，過膜后用Sephadex G-25進行分離。洗脫液為蒸餾水，洗脫流速0.6 mL/min，上樣量3 mL，紫外檢測波長280 nm。收集各組分，濃縮、凍干。

1.3.2 Sephadex G-15凝膠層析

將Sephadex G-25得到的2 個組分利用Sephadex G-15進一步分離純化。洗脫液為蒸餾水，洗脫流速0.6 mL/min，樣品質(zhì)量濃度35 mg/mL，上樣量3 mL，于280 nm波長處檢測。收集各組分，濃縮、凍干備用。

1.3.3 不同組分對小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌細胞因子的影響

1.3.3.1 不同組分對小鼠巨噬細胞RAW264.7的毒性

細胞的分組及處理：RAW264.7巨噬細胞調(diào)整密度為4×105個/mL，每孔100 μL接種于96 孔培養(yǎng)板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，用不同質(zhì)量濃度樣品刺激。空白組：培養(yǎng)液；LPS組：加入終質(zhì)量濃度10 mg/L LPS；樣品組：加入終質(zhì)量濃度分別為10、50、100 mg/L的樣品；LPS＋樣品組：LPS終質(zhì)量濃度10 mg/L＋同樣品組。

MTT法測定細胞活力：上述各處理組細胞孵育24 h后，每孔加入20 μL的5 mg/mL MTT，在相同條件下繼續(xù)孵育4 h，于1 000×g離心10 min，棄去孔內(nèi)液體，加入100 μL DMSO，振蕩10 min。酶標儀測定OD570nm值。

1.3.3.2 不同組分對RAW264.7巨噬細胞分泌TNF-α和IL-6細胞因子的影響

細胞分組同1.3.3.1節(jié)，按試劑盒說明書采用ELISA法測定TNF-α和IL-6含量。

1.3.4 RP-HPLC分析

將免疫活性較好的組分凍干收集，經(jīng)RP-HPLC分離純化。樣品質(zhì)量濃度10 mg/mL，上樣量40 μL，色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長220 nm。流動相A：0.1%（質(zhì)量分數(shù)，下同）三氟乙酸水溶液，流動相B：含0.1%三氟乙酸的乙腈。洗脫梯度：0～30 min，95%～75% A（線性梯度）；30～40 min，75% A（等量洗脫）；40～60 min，95% A（線性梯度）。將分離得到的組分收集，驗證其為單一峰，大量分離收集凍干。

1.3.5 ESI MS/MS鑒定

電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（electrospray tandem mass spectrometer，ESI MS/MS）條件：采用電噴霧正離子掃描模式；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～750；鞘氣為N2，壓力為40 au；輔助氣為N2，壓力為5 au；噴霧壓力為4.5 kV；傳輸毛細管溫度350 ℃；二級質(zhì)譜碰撞電壓15 eV。

1.3.6 榛仁免疫活性肽的合成

采用標準的固相化學合成方法，合成多肽，其純度為99.52%。由北京中科亞光生物科技有限公司合成。

1.3.7 細胞毒性實驗

細胞的分組及處理：空白組：培養(yǎng)液；LPS組：加入終質(zhì)量濃度1 μg/mL LPS；樣品組：加入終濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L的樣品。MTT法測定細胞活力方法同1.3.3.1節(jié)。

1.3.8 小鼠脾淋巴細胞增殖實驗

[20]制備細胞懸液，小鼠脫頸處死，小鼠脾臟用無菌注射器芯擠壓研磨，并用1640培養(yǎng)液沖洗篩網(wǎng)，200 目尼龍網(wǎng)過濾到EP管中，制成細胞懸液。1 800 r/min離心6 min，棄上清液。細胞沉淀中加入紅細胞裂解液，靜置5 min。1 800 r/min離心6 min，棄上清液。加入1640培養(yǎng)液（10%胎牛血清），吹打均勻，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為2×106個/mL。向每個孔內(nèi)加入100 μL淋巴細胞懸浮液，再加100 μL樣品，5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)72 h。刺激組樣品與10 μL ConA（終質(zhì)量濃度5 μg/mL）同時加入。結(jié)束前4 h，向每孔中加20 μL 5 mg/mL MTT。培養(yǎng)結(jié)束后，棄掉細胞液，向每孔中加100 μL DMSO，顯色10 min。酶標儀測定OD570nm值。按式（1）計算淋巴細胞增殖率。

1.3.9 PEDEFR對小鼠RAW264.7巨噬細胞吞噬中性紅功能的影響

根據(jù)蘇娣等[21]實驗方法測定小鼠RAW264.7巨噬細胞的吞噬中性紅能力，酶標儀測定OD540nm值。按式（2）計算中性紅吞噬率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 Sephadex G-25分離

圖1 Sephadex G-25葡聚糖凝膠層析圖譜Fig. 1 Sephadex G-25 chromatogram

由圖1可知，分子質(zhì)量小于3 k D a的組分經(jīng)Sephadex G-25分離后得到A1、A2和A3，共3 個組分。A1組分樣品太少，不足以進行后續(xù)分析，故對A2和A3兩個組分進一步分離純化。

2.2 Sephadex G-15分離

圖2 組分A2的Sephadex G-15分離圖譜Fig. 2 Chromatogram of A2 separated on a column of Sephadex G-15

圖3 組分A3 Sephadex G-15分離圖譜Fig. 3 Chromatogram of A3 separated on a column of Sephadex G-15

圖2中A2組分經(jīng)Sephadex G-15分離，得到B1、B2和B3，共3 個組分，圖3中A3組分經(jīng)分離后得到B4、B5、B6和B7，共4 個組分。收集凍干，測定其免疫活性。

2.3 Sephadex G-15凝膠層析組分細胞毒理性

MTT法檢測原理為活細胞中的氧化還原酶使MTT還原為不溶性物質(zhì)甲瓚沉淀于細胞中，是一種廣泛應用于檢測細胞增殖、生存能力和藥物毒性的方法[22]。圖4結(jié)果顯示，與LPS相比，B5、B6、B7組分單獨處理RAW264.7巨噬細胞后在一定質(zhì)量濃度下能顯著提高細胞活性，其他組分對細胞活性影響不顯著（P＞0.05）。由圖5可知，與空白組和LPS組相比，B1～B7組分，在不同質(zhì)量濃度下經(jīng)LPS共同刺激RAW264.7巨噬細胞后，細胞活性沒有顯著差異（P＞0.05）。說明樣品在質(zhì)量濃度為10、50、100 mg/L時對細胞沒有明顯毒性，選此質(zhì)量濃度進行后續(xù)實驗。

圖4 不同組分對小鼠RAW264.7巨噬細胞活性影響Fig. 4 Effects of different peptide fractions on the phagocytosis of RAW264.7 cells

圖5 不同組分與LPS共同作用對小鼠RAW264.7巨噬細胞活性影響Fig. 5 Effects of different peptide fractions combined with LPS on the phagocytosis of RAW264.7 cells

2.4 Sephadex G-15凝膠層析組分對體外LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6的影響

表1 不同組分對小鼠RAW264.7巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6的影響（n＝3）Table 1 Effects of peptide fractions on the production of TNF-α and IL-6 in RAW264.7 cells (n= 3)

TNF-α是由活化的巨噬細胞分泌的關(guān)鍵促炎因子，它對機體的免疫功能和炎癥反應發(fā)揮重要作用[23]。由表1可知，與空白組相比，各組分細胞因子TNF-α的分泌量隨著質(zhì)量濃度的增加而降低。與LPS組相比，除B6組外，各組分在高質(zhì)量濃度極顯著地抑制巨噬細胞分泌的TNF-α的產(chǎn)生（P＜0.01）。研究發(fā)現(xiàn)，其他蛋白水解物也有類似的效果，如杏仁水解蛋白和紫貽貝水解蛋白能有效抑制TNF-α的產(chǎn)生，抑制率分別為64.53%、58.90%[24-25]。

IL-6是多功能炎癥細胞因子，它通過參與炎癥反應發(fā)揮免疫功能[26]。由表1可知，與LPS組相比，B1、B5、B6組分對LPS活化后的巨噬細胞分泌的IL-6含量均有極顯著地抑制作用（P＜0.01）；B2、B3、B4組分在100 mg/L時對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞產(chǎn)生IL-6分泌量有極顯著地降低作用（P＜0.01）；而B7組分在100 mg/L時，對IL-6的分泌量有顯著地降低作用（P＜0.05）。結(jié)果表明，B1、B5、B6組分在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)能極顯著抑制IL-6的產(chǎn)生（P＜0.01），進而調(diào)節(jié)機理免疫功能。在其他文獻中也有植物蛋白對IL-6的產(chǎn)生有抑制作用的報道，Toopcham等[27]發(fā)現(xiàn)豌豆水解物比豌豆蛋白能更顯著抑制IL-6的產(chǎn)生。

由以上得出，B1組分免疫活性較好，對其進行RPHPLC分離純化。

2.5 榛仁免疫活性肽的RP-HPLC分離與ESI MS/MS鑒定

圖6 C4組分的RP-HPLC圖譜Fig. 6 RP-HPLC analysis of fraction C4

圖7 C4組分一級質(zhì)譜圖Fig. 7 Mass spectrum of fraction C4

圖6為組分B1經(jīng)RP-HPLC分離后，得到C1、C2、C3和C4，共4 個組分。將C4收集后，經(jīng)一級質(zhì)譜（圖7）和二級質(zhì)譜（圖8）鑒定獲得多肽氨基酸序列。根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果和肽段序列可信度及構(gòu)效關(guān)系篩選出1 個多肽，分子質(zhì)量為791.82 Da，氨基酸序列Pro-Glu-Asp-Glu-Phe-Arg。

圖8 PEDEFR的二級質(zhì)譜圖Fig. 8 Tandem mass spectrum of PEDEFR

2.6 PEDEFR對小鼠RAW264.7巨噬細胞增殖能力和吞噬能力的影響

圖9 PEDEFR對小鼠RAW264.7巨噬細胞增殖能力和吞噬能力的影響Fig. 9 Effect of PEDEFR on the proliferation and phagocytosis of RAW264.7 cells

由圖9可知，與LPS組相比，PEDEFR在該濃度范圍內(nèi)對細胞存活率無顯著性差異（P＞0.05），說明PEDEFR對細胞無毒害作用，因此選擇12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L進行下一步實驗。

巨噬細胞通過直接吞噬和細胞內(nèi)殺傷病原體參與機體免疫反應，其吞噬能力與機體免疫應答能力密切相關(guān)[28-29]。由圖9可知，與空白組相比，PEDEFR在50 μmol/L和100 μmol/L時可以極顯著促進巨噬細胞吞噬中性紅（P＜0.01），且表現(xiàn)為濃度依賴關(guān)系。這與Yoshikawa等[30]從大米清蛋白酶解物中獲得的Gly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Leu-Arg類似，免疫活性可能是由于疏水性氨基酸占比較大。Yang Ruiyue等[31]從馬哈魚蛋白水解多肽發(fā)現(xiàn)其能促進巨噬細胞增殖和促進淋巴增殖，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)多肽中富含Glu、Asp、Lys和Leu。其中疏水性氨基酸和堿性氨基酸所占比例較大，與PEDEFR氨基酸組成類似。

2.7 PEDEFR對脾淋巴細胞增殖能力的影響

由圖10A可知，與100 μmol/L PEDEFR相比，50 μmol/L對淋巴細胞增殖率的影響無顯著性差異（P＞0.05），與低濃度（＜50 μmol/L）相比差異極顯著（P＜0.01）。各個濃度PEDEFR對淋巴細胞增殖均有促進作用，并呈濃度依賴性，在100 μmol/L時，增殖率達到44.21%。由圖10B可知，與100 μmol/L PEDEFR和ConA共同作用相比，50 μmol/L對淋巴細胞增殖率的影響無顯著性差異（P＞0.05），與低濃度（＜50 μmol/L）相比差異極顯著（P＜0.01），在100 μmol/L時增殖率達到53.22%。在ConA刺激下淋巴細胞增殖能力顯著提高（P＜0.01）。結(jié)果表明，PEDEFR能刺激淋巴細胞增殖，并呈一定濃度依賴性，且高濃度比低濃度效果明顯。與對淋巴細胞增殖率為35.92%的相同濃度鱈魚肽Asn-Gly-Met-Thr-Tyr相比，增殖作用明顯[20]。Sütas等[32]對K-酪蛋白酶解后分離出肽段Phe-Phe-Ser-Asp-Lys，在10 μg/mL時能顯著促進淋巴細胞增殖（P＜0.01），該肽段中疏水性氨基氮和堿性氨基酸所占比例為60%。Cian等[33]用肽鏈內(nèi)切酶和肽鏈外切酶將海藻酶解得到酶解物Phorphyra columbina（PcRH），其中富含Asp、Ala和Glu，能促進大鼠淋巴細胞增殖。

圖10 PEDEFR對脾淋巴細胞增殖能力的影響Fig. 10 Effect of PEDEFR on the proliferation of spleen lymphocytes

3 結(jié) 論

本研究中，從榛仁分子質(zhì)量小于3 kDa的水解肽中得到免疫活性肽Pro-Glu-Asp-Glu-Phe-Arg（PEDEFR），分子質(zhì)量為791.82 Da，這與報道的免疫活性肽分子質(zhì)量小于2 000 Da結(jié)果相符。研究利用小鼠細胞進行體外免疫活性實驗，結(jié)果表明，PEDEFR具有良好的細胞吞噬能力，在濃度50～100 μmol/L時，隨著濃度的升高，促進巨噬細胞吞噬中性紅能力升高。這與馬哈魚蛋白水解肽所報道的結(jié)果類似，其氨基酸組成都含有氨基酸Glu、Asp。而大米清蛋白酶解物中含有與PEDEFR相同的氨基酸Pro、Arg。由此推測，巨噬細胞吞噬中性紅能力可能與氨基酸組成存在一定聯(lián)系。利用小鼠脾細胞進行脾淋巴細胞增殖實驗，實驗表明經(jīng)PEDEFR處理的脾細胞，其細胞增殖率達到44.21%，在ConA共同作用下增殖率達到53.22%，與鱈魚來源的免疫活性肽Asn-Gly-Met-Thr-Tyr相比，其促進淋巴細胞增殖效果更好。

綜上所述，PEDEFR可以提高巨噬細胞吞噬能力和促進ConA誘導的淋巴細胞增殖，從而提高小鼠細胞免疫活性。PEDEFR在細胞水平有良好的免疫活性，為榛仁免疫活性肽研究提供一定參考依據(jù)。

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