小麥蛋白對櫻桃酒的澄清效果

李娟娟，張麗珍,*，呂國濤，趙宇瑛，張勁松，王 楚，牛 宇

櫻桃，作為落葉果樹中成熟較早的水果，享有“早春第一果”的美譽。櫻桃果酒營養(yǎng)豐富，含有酚類、花色苷、黃酮等多種營養(yǎng)成分，具有促進血液循環(huán)、抗氧化、健腦益氣、抗病毒等多種生理功效[1-3]。酚類化合物對于櫻桃酒的澀味和苦味的強弱具有很大的影響，可能會影響櫻桃酒的感官品質(zhì)和穩(wěn)定性，花青素是天然色素，主要影響酒體的色澤[4-8]。櫻桃果酒在其加工、運輸和貯藏過程中常常引發(fā)渾濁、褐變和沉淀等問題，這對櫻桃酒的感官品質(zhì)具有重大的影響[9]。有研究證明紅葡萄酒的渾濁主要是由于單寧酸和蛋白質(zhì)結(jié)合形成了大分子聚合物，對葡萄酒的澄清度、感官品質(zhì)有著重大的影響[10]。

目前在果酒加工中常用的下膠原料主要有皂土、殼聚糖、明膠、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP）和羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose sodium，CMC）等，但它們都存在一些缺點[11]。比如：當皂土用量超過一定范圍后，澄清效果好但酒體明顯淡薄[12]；殼聚糖對酚類物質(zhì)的吸附作用和對金屬離子的螯合作用，造成酒液澀味較輕、色澤較淺[13-14]；明膠、蛋清等動物蛋白對于人類的身體健康存在安全風險[15]。Granato等[16]研究結(jié)果表明小麥、豌豆、大豆等植物源蛋白應(yīng)用于葡萄酒的澄清中不僅可以降低酒體的濁度、保持酒體的穩(wěn)定性，而且具有安全、無毒、成本低等優(yōu)點。

小麥蛋白中含谷蛋白、鹽溶蛋白和醇溶蛋白，其中醇溶蛋白不溶于水，但溶于一定比例的乙醇溶液。為避免發(fā)生醇溶蛋白在酒體中析出而產(chǎn)生沉淀的現(xiàn)象，本研究將小麥蛋白經(jīng)脫醇溶蛋白后制備小麥澄清蛋白，通過添加小麥澄清蛋白的方法澄清櫻桃酒。測定櫻桃酒澄清前后理化性質(zhì)和穩(wěn)定性的變化，并進一步與明膠、PVPP、CMC 3 種澄清劑的澄清效果相比，來分析小麥澄清蛋白的澄清效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

櫻桃（品種‘紅瑪瑙’）采收于2016年6月15日，山西省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所提供；釀酒酵母 天津科技大學；小麥面粉 平陸縣晴嵐制粉有限公司；槲皮素（標準品，純度≥98%） 北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司；沒食子酸（標準品） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；福林-酚試劑 北京索萊寶科技有限公司；單寧酸、明膠、醋酸鈉、KCl、鹽酸、四氫呋喃（99%）、乙醇（95%）、硼氫化鈉、AlCl3、Na2CO3、氯醌、乙酸、香草醛、甲醇、NaOH、正丙醇、2-巰基乙醇均為分析純；實驗中所用的水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

ME 204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；Infinite M200 PRO全波長多功能微孔板檢測儀 帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；SGZ-B系列便攜式濁度計 上海悅豐儀器儀表有限公司；PAL-1手持糖度計 北京陽光億事達貿(mào)易有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 實驗指標的測定

濁度采用濁度儀測定；總糖質(zhì)量分數(shù)采用手持糖度計檢測；總酸質(zhì)量濃度采用指示劑法測定，以酒石酸表示；pH值采用酸度計檢測；總酚質(zhì)量濃度采用福林-酚法[17-18]測定；色價值采用分光光度計測定；花色苷質(zhì)量濃度采用pH示差法[19]測定；黃酮質(zhì)量濃度采用硼氫化鈉/氯醌法[20-21]測定；乙醇體積分數(shù)采用酒精計測定；單寧酸質(zhì)量濃度采用Folin-Denis分光光度法測定。

1.3.2 小麥澄清蛋白和櫻桃酒的制備

1.3.2.1 小麥澄清蛋白的制備

選擇優(yōu)質(zhì)小麥面粉按料液比1∶5（m/V，下同）加正己烷進行脫脂脫色，室溫振蕩10 min，在4℃條件下7 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，重復(fù)2 次。再按料液比1∶5加入0.5 mol/L NaCl溶液，搖勻后在4℃條件下5 000 r/min離心10 min，棄掉上清液。然后按料液比1∶7加入醇溶蛋白提取液，搖勻，4 ℃、9 000 r/min離心12 min，棄掉上清液。將所得沉淀于-35 ℃冰箱中預(yù)冷2 h后置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥8 h，所得白色固體粉末即為小麥澄清蛋白。準確稱取2.0 g小麥澄清蛋白溶于100 mL超純水中，備用。

1.3.2.2 櫻桃酒的制備

采用釀酒酵母 AS2399進行發(fā)酵，參照呂國濤等[22]的方法進行制備。

1.3.3 渾濁成因分析

將單寧酸用0.02 mol/L（pH 3.7）磷酸鹽緩沖液配成20 mg/L單寧酸溶液，與5～125 mg/L小麥澄清蛋白溶液建立蛋白質(zhì)-多酚模擬體系[23-24]。將不同質(zhì)量濃度的小麥澄清蛋白溶液與單寧酸溶液混合，在渦漩混合器上混合1 min，25 ℃恒溫水浴保溫1、4、14、24、36、60、128、168 h，分別測其濁度，3 次重復(fù)并求平均值。用櫻桃酒代替單寧酸溶液，分別加入5、10、20、40、50、60、80、100、125 mg/L小麥澄清蛋白，在渦漩混合器上混合1 min，25℃水浴保溫168 h，并檢測櫻桃酒澄清前、后的單寧酸質(zhì)量濃度。

1.3.4 小麥澄清蛋白用量對櫻桃酒濁度的影響

添加小麥澄清蛋白至櫻桃酒中使其質(zhì)量濃度分別為0、20、30、40、50、60、70 mg/L，混勻靜置180 min后測其濁度。

1.3.5 攪拌速率對櫻桃酒濁度的影響

櫻桃酒中添加一定量的小麥澄清蛋白后，分別用700、800、900、1 000、1 100、1 200 r/min的速率攪拌，攪拌時間均為150 min，攪拌結(jié)束靜置180 min后測定櫻桃酒的濁度。

1.3.6 攪拌時間對櫻桃酒濁度的影響

櫻桃酒中添加一定量的小麥澄清蛋白后，分別攪拌45、60、90、120、150、180 min，攪拌速率均為800 r/min，攪拌結(jié)束靜置180 min后測定櫻桃酒的濁度。

1.3.7 不同澄清劑澄清效果的比較

添加小麥澄清蛋白、明膠、PVPP、CMC至櫻桃酒中使其終質(zhì)量濃度分別為50、300、300、200 mg/L， 混勻后分別在靜置3、8、17、29、77、101、139、168 h后測其濁度，以不添加澄清劑作為空白組。

1.3.8 不同澄清劑對櫻桃酒品質(zhì)的影響

添加小麥澄清蛋白、明膠、PVPP、CMC至櫻桃酒中使其終質(zhì)量濃度分別為50、300、300、200 mg/L，混勻后分別再靜置168 h后測其總糖質(zhì)量分數(shù)、總酸質(zhì)量濃度、pH值、色價值（櫻桃酒在420、520、620 nm波長處的吸光度之和）、總酚質(zhì)量濃度、花色苷質(zhì)量濃度、黃酮質(zhì)量濃度和乙醇體積分數(shù)，以不添加澄清劑作為空白組。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有處理均設(shè)置至少3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0軟件進行方差分析，并用Duncan法進行兩兩比較分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥澄清蛋白的制備

小麥澄清蛋白得率為8 0%，其中總酚含量為21.12 mg/g，總黃酮含量為13.49 μg/g。

2.2 渾濁成因分析

圖1 單寧酸與不同質(zhì)量濃度的小麥澄清蛋白在不同時間下的濁度Fig. 1 Temporal change in turbidity of wheat proteins at different concentrations with tannic acid

由圖1可知，隨著小麥澄清蛋白質(zhì)量濃度的增加，模擬體系的濁度呈先增加后減少的趨勢，在小麥蛋白質(zhì)量濃度為80 mg/L時，即小麥蛋白和單寧酸溶液濃度比為4∶1，濁度最大。說明當?shù)鞍踪|(zhì)和單寧酸溶液以一定的比例結(jié)合時，二者結(jié)合的聚合物最大，濁度最大；相反，當二者比例失調(diào)時，二者形成的聚合物減少，濁度下降，沉淀也減少。由此可知，蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)的比例對櫻桃酒渾濁的形成具有重要的影響。

圖2 櫻桃酒在不同質(zhì)量濃度小麥澄清蛋白處理后單寧酸的質(zhì)量濃度Fig. 2 Effect of GFWPI concentration on tannin concentration of cherry wine

由圖2可知，櫻桃酒中單寧酸質(zhì)量濃度隨著小麥澄清蛋白質(zhì)量濃度的變化而變化。未用小麥澄清蛋白處理的櫻桃酒中，單寧酸質(zhì)量濃度最高為4.31 mg/mL。加入60 mg/L的小麥澄清蛋白后酒體中單寧酸質(zhì)量濃度最低，為3.25 mg/mL，這是因為在小麥澄清蛋白質(zhì)量濃度為60 mg/L時，單寧酸與小麥澄清蛋白形成的大分子聚合物最多，致使酒體濁度最大，酒體中游離的單寧酸最少。說明用小麥澄清蛋白處理櫻桃酒后，酒體中的單寧酸與小麥澄清蛋白以一定的比例結(jié)合，形成大量沉淀使酒體渾濁，單寧酸質(zhì)量濃度降低。

2.3 小麥澄清蛋白用量對櫻桃酒澄清效果的影響

圖3 不同質(zhì)量濃度的小麥澄清蛋白對澄清效果的影響Fig. 3 Effect of GFWPI concentration on turbidity of cherry wine

櫻桃酒在添加不同質(zhì)量濃度的小麥澄清蛋白，靜置180 min后，其澄清效果見圖3。與未添加小麥澄清蛋白相比，添加不同質(zhì)量濃度小麥澄清蛋白均可以降低櫻桃酒的濁度，說明小麥澄清蛋白是一種有效的澄清劑。添加小麥澄清蛋白質(zhì)量濃度在0～40 mg/L時，櫻桃酒的濁度緩慢降低，在50 mg/L時櫻桃酒濁度顯著下降，而在50～70 mg/L內(nèi)其濁度又緩慢升高，說明隨著小麥澄清蛋白質(zhì)量濃度的變化，櫻桃酒的濁度也隨之變化。當小麥澄清蛋白質(zhì)量濃度為50 mg/L時，櫻桃酒的濁度最低。因此，小麥澄清蛋白的最佳用量為50 mg/L。

2.4 攪拌速率對櫻桃酒澄清效果的影響

圖4 攪拌速率對澄清效果的影響Fig. 4 Effect of stirring rate on turbidity of cherry wine

由圖4可知，當攪拌速率在700～800 r/min變化時，濁度急劇降低，當攪拌速率為900 r/min時，濁度最低，而當攪拌速率在900～1 200 r/min間變化時，濁度緩慢上升。這是因為攪拌速率為900 r/min時，酚酸和蛋白質(zhì)分子間的碰撞機會增加，使二者結(jié)合成大分子物質(zhì)而沉降，此時櫻桃酒的濁度最低，澄清效果最好。而當攪拌速率分別為800、900 r/min時，其濁度變化不大。因此，在保證節(jié)約能源和良好澄清效果的前提下，最佳攪拌速率可選擇800 r/min。

2.5 攪拌時間對櫻桃酒澄清效果的影響

圖5 攪拌時間對櫻桃酒濁度的影響Fig. 5 Effect of stirring time on turbidity of cherry wine

由圖5可知，攪拌時間在40～60 min，濁度緩慢降低，在60～120 min濁度急劇下降，當攪拌時間為120 min時，其濁度最低，而攪拌時間在120～180 min時，濁度又緩慢升高。說明攪拌120 min后，可以增大酚酸和蛋白質(zhì)分子間碰撞結(jié)合的幾率，使大分子物質(zhì)結(jié)合形成混合物，使酒體渾濁，濁度升高，此時澄清效果最好；而當超過一定時間時，分子間碰撞的幾率減少使結(jié)合的大分子物質(zhì)減少，濁度升高。因此，最佳攪拌時間為120 min。

2.6 不同澄清劑澄清效果的比較

由圖6可知，在0～29 h，4 種澄清劑的澄清速率均非?？欤? 種澄清劑的澄清速率：小麥澄清蛋白＞PVPP＞明膠＞CMC。在29～168 h，4 種澄清劑的澄清速率均下降，其濁度在緩慢降低最終達到穩(wěn)定。在同一時間內(nèi)，經(jīng)過小麥澄清蛋白處理的櫻桃酒的濁度均低于其他3 種澄清劑處理后的濁度。此外，在29 h時，經(jīng)過小麥蛋白處理的櫻桃酒的濁度先于其他3 種澄清劑達到10 NTU，在139 h時率先達到最低濁度2.07 NTU。Simonato等[25]研究了玉米蛋白和明膠對紅酒的澄清效果的影響，其測定的玉米蛋白的澄清效果比明膠好，與本實驗中小麥澄清蛋白的澄清效果優(yōu)于明膠保持一致。因此，與PVPP、明膠、CMC 3 種澄清劑相比，小麥澄清蛋白有著澄清速率快、時間短、澄清效果好的明顯優(yōu)勢。

圖6 不同澄清劑處理后的櫻桃酒在不同靜置時間內(nèi)濁度的變化Fig. 6 Temporal change in turbidity of ベned cherry wine

2.7 不同澄清劑對櫻桃酒品質(zhì)的比較

表1 不同澄清劑處理后櫻桃果酒指標的變化Table 1 Comparison of physicochemical properties of cherry wine treated with different clarifying agents

用小麥澄清蛋白、PVPP、明膠、CMC 4 種澄清劑處理櫻桃酒，靜置168 h后理化和穩(wěn)定性相關(guān)指標見表1。櫻桃酒用4 種澄清劑處理后，乙醇體積分數(shù)差異不顯著（P＞0.05），花色苷質(zhì)量濃度差異顯著；用CMC處理櫻桃酒后的pH值與用小麥澄清蛋白和空白組差異不顯著，與PVPP、明膠處理之間差異顯著；用明膠、PVPP作澄清劑，二者總酸質(zhì)量濃度差異不顯著，但與用CMC、小麥澄清蛋白、空白組差異顯著；小麥澄清蛋白處理櫻桃酒后總酚質(zhì)量濃度與空白組差異不顯著，但與明膠、CMC、PVPP作澄清劑相比差異顯著；明膠處理櫻桃酒后的色價值與空白組差異不顯著，但與小麥澄清蛋白、CMC、PVPP作澄清劑相比差異顯著；用PVPP作澄清劑，與空白組和小麥澄清蛋白、明膠、CMC作澄清劑相比，黃酮質(zhì)量濃度存在顯著差異。由表1還可得出，乙醇體積分數(shù)與pH值均無顯著變化；總糖質(zhì)量分數(shù)和總酸質(zhì)量濃度與空白組相比，差異顯著。用明膠作澄清劑，櫻桃酒中總酚減少量最多，減少35.37 mg/L；用PVPP作澄清劑，色價值降低最高，降低0.30；用CMC作澄清劑，花色苷質(zhì)量濃度減少最多，減少0.49 mg/L。用50 mg/L的小麥澄清蛋白處理櫻桃酒后，其總酚質(zhì)量濃度與澄清前相比，不存在顯著性差異（P＞0.05），主要是因為小麥澄清蛋白與單寧酸相互作用形成沉淀使總酚質(zhì)量濃度減少，而加入的小麥澄清蛋白中含有少量酚酸物質(zhì)，使得酒體中總酚質(zhì)量濃度變化無顯著差異（P＞0.05）。用50 mg/L的小麥澄清蛋白處理的櫻桃酒中，黃酮質(zhì)量濃度略微增加，這是由于櫻桃酒在貯存期間黃酮類物質(zhì)會發(fā)生輔色作用、氧化、聚合等多種復(fù)雜反應(yīng)[26]，而加入的小麥澄清蛋白中含有少量黃酮，最終導(dǎo)致黃酮質(zhì)量濃度小幅度增加。

3 討 論

本實驗通過建立小麥澄清蛋白-單寧酸模擬體系的致濁成因?qū)嶒?，發(fā)現(xiàn)當二者以濃度比4∶1存在時可形成大分子聚合物，形成沉淀使酒體濁度降低從而達到澄清櫻桃酒的目的。這與黃惠華等[27]提出啤酒、白酒、果汁渾濁的主要原因是蛋白質(zhì)與多酚的相互作用一致；喬翠紅等[28]研究發(fā)現(xiàn)蛋白與多酚以一定比例存在時可導(dǎo)致酒體渾濁；Siebert等[29]研究的啤酒渾濁的主要原因是由于酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合成大分子物質(zhì)，導(dǎo)致酒體渾濁的結(jié)論保持一致。櫻桃酒渾濁主要是由于酒體中多酚類化合物和蛋白質(zhì)按一定比例結(jié)合成大分子物質(zhì)，形成了沉淀。

本實驗對櫻桃酒進行澄清處理后，發(fā)現(xiàn)當小麥澄清蛋白質(zhì)量濃度為50 mg/L時，酒體的濁度最低，為2.07 NTU，濁度降低了71.64%（空白組處理后濁度為7.30 NTU），澄清效果較優(yōu)。Granato等[16]分別利用扁豆蛋白、豌豆蛋白、大豆蛋白、谷朊蛋白處理葡萄酒，其酒體的濁度分別降低了16%、18%、26%、28%。小麥澄清蛋白處理櫻桃酒后，對其pH值、乙醇體積分數(shù)的影響較小。用50 mg/L的小麥澄清蛋白處理櫻桃酒后，其總酚質(zhì)量濃度與澄清前相比，減少了0.79 mg/L，主要是因為小麥澄清蛋白與單寧酸相互作用形成沉淀使總酚質(zhì)量濃度減少，而加入的小麥澄清蛋白中也含有酚酸物質(zhì)，最終導(dǎo)致總酚質(zhì)量濃度變化不大。屈慧鴿[30]研究了小麥谷朊蛋白對霞多麗葡萄汁的澄清效果，其測定的葡萄汁總酚含量在澄清后降低了18.2%。本實驗中總酚質(zhì)量濃度降低不足1%，原因可能是葡萄汁和櫻桃酒中酚類物質(zhì)的種類不同。

小麥澄清蛋白處理櫻桃酒的最佳條件為：小麥澄清蛋白的用量為50 mg/L，攪拌速率為800 r/min，攪拌時間為120 min。與明膠、PVPP、CMC 3 種澄清劑相比，發(fā)現(xiàn)櫻桃酒在29 h時經(jīng)過小麥澄清蛋白處理后，濁度先于其他3 種澄清劑達到10 NTU，在139 h率先達到最低濁度2.07 NTU。Guerrero等[10]用從葡萄皮和蘋果皮提取的纖維素處理紅酒，靜置17 d后，其濁度在0～3 NTU變動，與本實驗中相比，小麥澄清蛋白的澄清效果較優(yōu)，澄清速率較快，所用時間較短。

綜上所述，將制備的小麥澄清蛋白作為一種果酒澄清劑，不僅安全、無毒、成本低、來源廣，而且澄清速率快、效果好、時間短，且可最大程度地保持櫻桃酒的品質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，可廣泛用于櫻桃酒的工業(yè)生產(chǎn)和貯藏中。

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