迷迭香提取物與NaCl協(xié)同改善肌原纖維蛋白凝膠特性

賈 娜，謝振峰，李儒仁*，邵俊花，劉登勇，劉?；?/p>

肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）屬于鹽溶性蛋白，是肌肉蛋白質(zhì)的主要組分，其主要功能特性是能夠熱誘導(dǎo)形成凝膠，從而賦予肉制品尤其是肉糜制品良好的質(zhì)地與口感。溶解度與MP的乳化凝膠特性緊密相關(guān)。在一定離子強度范圍內(nèi)，溶解度隨離子強度的增加而增加，因此，在肉制品加工中通常加入NaCl以提高離子強度，同時通過斬拌和混合來提高MP的溶解度。有研究表明，一定離子強度范圍內(nèi)，隨著離子強度的增加，豬肉MP的凝膠強度增大[1]。NaCl濃度為0.6 mol/L時，MP的溶解度較高，能夠形成規(guī)則有序的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而在低濃度NaCl條件下，大部分MP處于未溶解狀態(tài)，不能形成穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)[2]。

香辛料是肉制品加工中的主要輔料，香辛料的使用一方面可以賦予產(chǎn)品一定的風味，另一方面還能起到抗氧化、抑菌等作用。目前，香辛料提取物在肉制品抑菌、抗氧化方面的研究報道較多。將迷迭香提取物和香蜂花提取物應(yīng)用于熟豬肉糜制品，可以顯著降低硫代巴比妥酸值和己醛含量，說明二者起到了抑制脂肪氧化的作用[3-4]。作為肉制品加工中兩種主要的輔料，NaCl和香辛料都會對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性產(chǎn)生一定的影響；但是，二者究竟如何協(xié)同影響MP的結(jié)構(gòu)和功能特性，進而影響肉糜制品的品質(zhì)，尚不完全清楚。本研究旨在制備含不同濃度NaCl的豬肉MP與迷迭香提取物的混合物，通過測定巰基含量、內(nèi)源熒光強度、流變特性、凝膠強度、保水性，以探討NaCl濃度和迷迭香提取物二者共同對MP結(jié)構(gòu)和凝膠特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三元豬背最長肌購自錦州大潤發(fā)超市；迷迭香購自當?shù)厮幏俊?/p>

氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙醇、磷酸鈉、氯化鎂、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）等均為國產(chǎn)分析純；Tris 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-200高速萬能粉碎機 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；THZ-100B恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科學儀器有限公司；ALPHA 1-2LD plus冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；JYS-A900絞肉機 九陽股份有限公司；T25數(shù)顯型均質(zhì)機、RCT基本型磁力攪拌器 德國IKA集團；PL602-L電子天平 上海速展計量儀器有限公司；970CRT熒光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；TGL-20M臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；TA-XT Plus型質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro Systems公司；DHR-1流變儀 美國TA儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 迷迭香提取物的制備

參照Zhang Xue等[5]的方法并做適當修改。迷迭香洗凈瀝干，放置45 ℃干燥箱中烘干，用高速萬能粉碎機粉碎，過40 目篩備用。取50 g粉末于1 000 mL帶塞的錐形瓶中，加入體積分數(shù)為95%的乙醇400 mL，塞緊瓶塞，置于恒溫培養(yǎng)搖床，55 ℃、110 r/min提取12 h，過濾，濾渣加入200 mL 95%的乙醇重提12 h后過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮2 h（55 ℃、0.08 MPa），濃縮液在-50 ℃條件下真空冷凍干燥，真空度為7 Pa。所得提取物在-20 ℃保存?zhèn)溆茫缘闾崛÷?1.28%、含水率5%）。

1.3.2 提取MP與制備樣品

參照Liu Gang等[6]的方法并略作修改。稱取約500 g左右的豬肉，破碎并加入4 倍體積的提取液（10 mmol/L Na3PO4、0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EDTA，pH 7.0），勻漿60 s，3 500 r/min冷凍離心15 min，取沉淀重復(fù)上述步驟兩次，最后所得沉淀加入4 倍體積0.1 mol/L NaCl溶液，按上述離心條件洗滌沉淀3 次，最后一次離心前用4 層紗布過濾，然后用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0，所得MP于4 ℃冷藏備用。以牛血清白蛋白為標準品，利用雙縮脲法測定MP含量。

配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL和40 mg/mL的MP溶液，分別加入0.01 g/g pro的迷迭香提取物，再向混合物中添加NaCl，使其終濃度分別為0.00、0.15、0.45、0.60 mol/L。配制好MP混合溶液于4 ℃冷藏過夜（12 h），同時以不添加迷迭香提取物的MP為對照，用于后續(xù)各項指標的測定。

1.3.3 巰基質(zhì)量摩爾濃度的測定

參照di Simplicio等[7]的方法并略作改進，取上述5 mg/mL的MP溶液1 mL，加8 mL Tris-甘氨酸溶液溶解，均質(zhì)后冷凍10 000 r/min離心15 min，除去不溶性蛋白并取上清液4.5 mL，加入0.5 mL 10 mmol/L Ellman試劑，搖勻靜置30 min后，在412 nm波長處測吸光度，以磷酸鹽緩沖溶液為對照。巰基質(zhì)量摩爾濃度的計算采用摩爾消光系數(shù)法，所得巰基質(zhì)量摩爾濃度以μmol/g pro表示，計算如式（1）所示。

式中：A為吸光度；ε為摩爾消光系數(shù)（13 600 L/（mol·cm））；D為稀釋倍數(shù)。

1.3.4 內(nèi)源熒光強度的測定

依據(jù)李學鵬等[8]的方法并適當修改。準確量取0.5 mL 5 mg/mL的MP溶液，用pH 7.0的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至0.1 mg/mL，磁力攪拌2 h，10 000 r/min冷凍離心30 min，用熒光分光光度計測定。參數(shù)設(shè)置：激發(fā)波長為295 nm，波長掃描范圍為300～400 nm，掃描速率為12 000 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm，靈敏度為3。

1.3.5 MP凝膠的制備

取按照1.3.2節(jié)處理好的40 mg/mL的MP溶液15 mL，置于稱量瓶中，密封，放置70 ℃恒溫水浴鍋中，持續(xù)水浴加熱30 min，隨后自來水冷卻30 min，凝膠樣品貯存在2～4 ℃的冰箱中備用。測定前將MP凝膠在室溫下放置20 min。

1.3.6 凝膠強度的測定

采用TA-XT Plus型質(zhì)構(gòu)分析儀進行測定。將待測樣品與稱量瓶置于平臺，測定參數(shù)為：探頭型號選擇P/0.5，下壓距離為凝膠高度的50%，觸發(fā)力為5 g，測試前速率2 mm/s，測試速率1 mm/s，測試后速率2 mm/s。

1.3.7 保水性的測定

參照Kocher等[9]的方法并適當修改。稱取5 g凝膠樣品，置于15 mL離心管中，稱質(zhì)量記為m2/g，隨后于3 000×g冷凍離心15 min，除去水分后再次稱質(zhì)量，記為m1/g，離心管質(zhì)量記為m0/g，保水性按式（2）進行計算。

1.3.8 動態(tài)流變特性的測定

取一定量制備好的MP溶液，采用流變儀測定，選用50 mm平板測試，將不同處理條件下的MP乳液均勻涂布于測試平臺，消除氣泡并涂膜硅油密封，測試參數(shù)如下：頻率為0.1 Hz，應(yīng)變2%，夾縫間距為0.5 mm，起始溫度20 ℃，升溫速率1 ℃/min，終止溫度80 ℃，在該參數(shù)下測定儲能模量（G’）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl濃度和迷迭香提取物對MP結(jié)構(gòu)的影響

圖1 NaCl濃度對內(nèi)源熒光強度的影響Fig. 1 Effect of NaCl concentration and rosemary extract on intrinsicぼuorescence intensity of myoベbrillar proteins

蛋白質(zhì)在天然狀態(tài)下有特定的空間結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)中的色氨酸大量埋藏于內(nèi)部的疏水環(huán)境，色氨酸內(nèi)源熒光強度較高，熒光發(fā)射波長較短；但是，在部分解折疊情況下，蛋白質(zhì)熒光強度降低，發(fā)射波長發(fā)生紅移[10]。由圖1可以看出，添加迷迭香提取物組與對照組的內(nèi)源熒光強度隨NaCl濃度的增加并未呈現(xiàn)規(guī)律性的變化，具體原因有待進一步研究；而當NaCl濃度為0.45 mol/L時，與對照組相比，添加迷迭香提取物組色氨酸發(fā)射波長由332 nm紅移至334 nm，內(nèi)源熒光強度下降。說明加入迷迭香提取物后MP中的部分色氨酸暴露于極性環(huán)境中，由此造成三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其特定空間結(jié)構(gòu)部分解折疊，色氨酸內(nèi)源熒光強度下降有可能來自于肌球蛋白桿狀尾部的部分解螺旋[11]，也有可能來自于肌球蛋白頭部的結(jié)構(gòu)變化（桿狀尾部對肌球蛋白分子熒光強度的貢獻只占總量的27%）[12-13]，迷迭香提取物引起的MP三級結(jié)構(gòu)改變究竟來自于肌球蛋白的頭部還是桿狀尾部，需要進一步證實。此外，迷迭香提取物中的多酚、萜類[14]還有可能通過“屏蔽效應(yīng)”影響MP的內(nèi)源熒光強度，這種效應(yīng)可以通過“手和手套”模型來解釋（蛋白中部分疏水基團形成“手套”，而多酚通過氫鍵等與蛋白結(jié)合形成“手”，可能是這種屏蔽效應(yīng)導(dǎo)致熒光強度下降[15]），該“屏蔽效應(yīng)”還有可能體現(xiàn)在迷迭香提取物中的酚類物質(zhì)等與蛋白結(jié)合，吸附于蛋白質(zhì)表面，可能對蛋白質(zhì)起一定保護作用，導(dǎo)致熒光強度降低[16]。

2.2 NaCl濃度和迷迭香提取物對巰基質(zhì)量摩爾濃度的影響

圖2 NaCl濃度和迷迭香提取物對巰基質(zhì)量摩爾濃度的影響Fig. 2 Effect of NaCl concentration and rosemany extract on sulfhydryl group content

巰基是MP中重要的活性基團，易被氧化形成二硫鍵，引起蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)、聚合，進而影響蛋白質(zhì)的功能特性[17]。從圖2可以看出，當NaCl濃度從0.15 mol/L增加至0.60 mol/L時，加或不加迷迭香提取物的MP的巰基質(zhì)量摩爾濃度變化不顯著（P＞0.05），說明增加離子強度對MP巰基質(zhì)量摩爾濃度無顯著影響。當NaCl濃度一定時，與對照組相比，加入迷迭香提取物導(dǎo)致巰基質(zhì)量摩爾濃度顯著降低（P＜0.05）。這可能是由于迷迭香提取物中主要成分為鼠尾草酚和鼠尾草酸，二者均含有一個能與巰基結(jié)合的位點，因此使得巰基含量下降[18-19]。Prodpran等[20]研究多酚對魚肉MP總巰基含量的影響時，也得到了類似結(jié)果，即酚類化合物導(dǎo)致總巰基含量降低，可能是由于巰基和酚羥基之間相互作用形成更穩(wěn)定的構(gòu)象。此外，高濃度的綠茶多酚也能與MP巰基通過共價交聯(lián)形成巰基-醌加成物，阻礙蛋白質(zhì)之間形成穩(wěn)定的二硫鍵[21]。

2.3 NaCl濃度和迷迭香提取物對凝膠強度的影響

圖3 NaCl濃度和迷迭香提取物對凝膠強度的影響Fig. 3 Effect of NaCl concentration and rosemary extract on gel strength

從圖3可以看出，NaCl濃度在0.00～0.15 mol/L范圍內(nèi)，MP＋迷迭香組和MP組的凝膠強度變化不顯著（P＞0.05），而當NaCl濃度從0.15 mol/L增加至0.60 mol/L時，兩組的凝膠強度均顯著增加（P＜0.05）。這是由于一定范圍內(nèi)隨著NaCl濃度的增加，MP與NaCl離子互作形成離子基團雙電子層，降低MP分子之間的靜電相互作用，增加MP分子之間的斥力，水化作用增強，從而改善凝膠特性[22-23]。此外，MP分子之間斥力的增加，導(dǎo)致MP膨脹，持水力增大，這與保水性的結(jié)果一致[24]。當NaCl濃度為0.00、0.15 mol/L時，MP＋迷迭香組的凝膠強度與對照組無顯著差異（P＞0.05），其主要原因可能在于MP凝膠特性的充分發(fā)揮需要提供足夠的溶解度，NaCl濃度較低時（0.00、0.15 mol/L），MP的溶解度較差。高溶解度狀態(tài)下（0.45、0.60 mol/L）迷迭香提取物可以提高MP的凝膠強度，但在不同NaCl濃度條件下呈現(xiàn)出不同的結(jié)果，NaCl濃度為0.45 mol/L時，MP＋迷迭香組的凝膠強度顯著高于MP組（P＜0.05），這可能是由于該條件下，迷迭香提取物中含有的多酚類物質(zhì)很容易形成鄰苯醌或鄰苯半醌，該物質(zhì)與蛋白中的巰基、氨基等基團發(fā)生親核加成反應(yīng)，使蛋白和酚之間形成C—N或C—S共價鍵[25-28]。NaCl濃度為0.60 mol/L時，MP＋迷迭香組的凝膠強度高于MP組，但差異不顯著（P＞0.05），離子強度的增加可能阻礙了部分蛋白-多酚共價鍵的形成，可見，迷迭香提取物對凝膠強度的顯著增效作用依賴于特定NaCl濃度，具體原因有待進一步研究。

2.4 NaCl濃度和迷迭香提取物對凝膠保水性的影響

圖4 NaCl濃度和迷迭香提取物對保水性的影響Fig. 4 Effect of NaCl concentration and rosemary extract on waterholding capacity

從圖4可以看出，當NaCl濃度從0.00 mol/L增加至0.15 mol/L時，MP＋迷迭香組和MP組的保水性沒有顯著變化（P＞0.05）；隨著NaCl濃度繼續(xù)增加至0.45 mol/L時，兩組的保水性均呈顯著增加趨勢（P＜0.05）；當NaCl濃度繼續(xù)增加至0.60 mol/L時，MP組的保水性依舊顯著增加（P＜0.05），而MP＋迷迭香組增加不顯著（P＞0.05）。保留肉品內(nèi)部的水分有兩個必要條件，首先肉中含有水分存在的空間，其次含有維持水分的作用力。有研究證實，水分在肉中的存留，主要依賴于水分子和蛋白之間的相互作用，如氫鍵、毛細管作用力、色散力等[29]。MP作為肉中的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，為肉中的水分提供空間；蛋白所帶的凈負電荷形成強有力的吸附中心，為保留水分提供作用力。添加適量的NaCl可以顯著提高離子強度，有效改善MP的凝膠能力，使其形成均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，同時隨著離子強度增加，MP所帶凈負電荷增加；蛋白與蛋白分子之間以及蛋白與水之間的作用增強，使得蛋白空間內(nèi)持水能力增加，保水性能增強[30-31]。MP＋迷迭香組和對照組相比，NaCl濃度為0.45 mol/L時，MP＋迷迭香組的保水性顯著高于MP組（P＜0.05），其他NaCl濃度下差異不顯著（P＞0.05）。一定離子強度下，添加一定量的迷迭香提取物能夠與MP相互作用，影響蛋白分子間以及蛋白與水之間的作用，使凝膠形成能力增強，從而對持水能力起一定促進作用。此外，酚與蛋白之間的相互作用能夠減小蛋白聚合物鏈間的空隙，從而使凝膠結(jié)構(gòu)增強，持水能力增加[32]。

2.5 NaCl濃度和迷迭香提取物對MP凝膠流變特性的影響

流變特性作為MP凝膠的重要特性，能夠反映凝膠的品質(zhì)。儲能模量（G’）反映MP凝膠的彈性特征，G’越高，表明形成凝膠的能力越強[2]。從圖5可以看出，當NaCl濃度為0.00、0.15 mol/L時，MP＋迷迭香組和MP組的G’均未呈現(xiàn)典型的“幾”字形曲線，表明在該條件下，MP未能形成穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)。這是由于低離子強度下，MP未能充分溶解，導(dǎo)致凝膠形成能力弱，G’較低。當NaCl濃度為0.45、0.60 mol/L時，G’從40 ℃開始逐漸增加，到46 ℃時達到峰值，這是由于該區(qū)間內(nèi)肌球蛋白頭部的α-螺旋結(jié)構(gòu)開始解旋，頭部交聯(lián)，開始形成凝膠；隨后G’從46 ℃開始下降，是由于肌球蛋白尾部變性展開，蛋白穩(wěn)定性降低，黏彈性降低；從50 ℃開始，G’一直呈上升趨勢，主要是因為大多數(shù)肌球蛋白分子可能已經(jīng)展開，成為隨機線圈結(jié)構(gòu)，增強了蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)，從而產(chǎn)生一個穩(wěn)定且不可逆的凝膠結(jié)構(gòu)[33-34]。一定NaCl濃度下，尤其當NaCl濃度為0.45 mol/L時，MP＋迷迭香組的G’高于未加提取物的MP組，這可能是由于添加的迷迭香提取物與MP相互作用后產(chǎn)生更多結(jié)合位點，形成酰胺鍵，增大了蛋白與酚的交聯(lián)密度，導(dǎo)致彈性和黏性增強[35-36]。

圖5 NaCl濃度和迷迭香提取物對MP儲能模量的影響Fig. 5 Effect of NaCl concentration and rosemary extract on storage modulus of myoベbrillar proteins

3 結(jié) 論

依賴于特定NaCl濃度（0.45 mol/L），迷迭香提取物可以有效“彌補”減鹽對MP凝膠特性的不利影響。提取物中含有的酚酸、萜類等組分改變了肌球蛋白的三級結(jié)構(gòu)，這種有利的部分解螺旋狀態(tài)可以在減鹽條件下有效改善MP的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這是減鹽后凝膠強度、儲能模量和保水性沒有顯著下降的重要原因。研究結(jié)果可為尋找新型NaCl替代物提供一定的理論依據(jù)。

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