畢赤酵母Gpn12異戊烯基轉(zhuǎn)移酶NovQ催化合成MK-3

吳錫華，李哲敏，劉會，王鵬，王麗，方雪，孫小雯，倪文楓，楊強，鄭之明，趙根海

1 中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院 技術(shù)生物與農(nóng)業(yè)工程研究所 強磁場與離子束物理生物學重點實驗室，安徽 合肥 230031

2 中國科學技術(shù)大學 研究生院，安徽 合肥 230027

維生素K(Vitamin K，VK) 是一族含有共同化學結(jié)構(gòu)2-甲基-1,4-萘醌環(huán)的物質(zhì)統(tǒng)稱。根據(jù)萘醌環(huán)3’位置連接側(cè)鏈化學結(jié)構(gòu)的不同又分為不同的類別。天然存在的維生素K包括K1(Phylloquinone，PK) 和 K2(Menaquinone，MK)，后又人工合成了K3等。在動物體內(nèi)，維生素K1和維生素K3只有轉(zhuǎn)化為維生素K2才具有生物活性[1-2]。圖1顯示了維生素 K1、K2及 K3的化學結(jié)構(gòu)。維生素 K2依據(jù)側(cè)鏈異戊烯單元個數(shù)n的不同[3-5]，可分為14種，通常以MK-n表示，例如，n為3時稱之為MK-3。

圖1 維生素K1、K2和K3 (從左到右) 的化學結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of vitamin K1, K2 and K3(from left to right).

維生素 K2傳統(tǒng)生理功能主要體現(xiàn)在促進凝血酶原的產(chǎn)生和增加骨鈣素的合成[6-7]。新近發(fā)現(xiàn)維生素 K2在降低肝硬化轉(zhuǎn)化為肝癌的風險等方面，也有明顯作用[8]。維生素K2可以采用化學合成法和微生物發(fā)酵法制備，化學法存在高能耗、高污染、副產(chǎn)物多和生物活性低等問題。而微生物法制備維生素K2條件溫和、污染少、能耗低，產(chǎn)品本身來源于生物，具有高生物活性和高生物相容性。

目前報道生產(chǎn)維生素 K2的菌株主要有黃桿菌 (Flavobacteriumsp.，產(chǎn)MK-4)[9-12]和枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis natto，產(chǎn)MK-7)[13-17]。維生素K2在生物合成時，關(guān)鍵的萘醌母環(huán)異戊烯基化是由異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化完成的。novQ基因來源于球狀鏈霉菌Streptomycessp.和雪白鏈霉菌Streptomyces niveus，其產(chǎn)物NovQ是一種異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，主要參與合成新生霉素的環(huán)A結(jié)構(gòu)。NovQ底物專一性不強，能催化多種萘醌、氫醌、酚類等化合物的異戊烯基化反應[18-19]。

巴斯德畢赤酵母作為一種成熟高效的基因工程蛋白表達系統(tǒng)，具有操作簡單、培養(yǎng)方便、生長速度快、蛋白表達量高、成本低廉的優(yōu)點[20-21]。作者實驗室開展了采用畢赤酵母合成MK-3的研究工作[22]。以來源于雪白鏈霉菌的novQ基因利用pPIC9載體在GS115畢赤酵母中實現(xiàn)了異源表達和優(yōu)化，并證實了其能使畢赤酵母合成維生素K2，主要是 MK-3；雖然使用的是分泌型載體，然而在實驗中發(fā)現(xiàn)重組畢赤酵母Gpn12在胞內(nèi)產(chǎn)MK-3具有較大潛力，本研究在此基礎(chǔ)上確定重組畢赤酵母全細胞催化合成MK-3的關(guān)鍵因素，優(yōu)化催化條件，為該菌的進一步擴大生產(chǎn)提供一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

重組巴斯德畢赤酵母Pichia pastorisGpn12由本實驗室保存[22]。

1.1.2 主要試劑

維生素K2(MK-4)標品購自Sigma公司；甲萘醌、異戊烯醇等為國產(chǎn)分析純試劑；色譜級甲醇和二氯甲烷購自上海生工。蛋白提取緩沖液：NaCl 0.5 mol/L，氨基丁三醇0.2 mol/L，pH 7.4。無硫酸銨酵母無氨基酸氮源(YNB)10×母液：用蒸餾水配成3.4%溶液，0.22 μm濾膜過濾除菌后現(xiàn)用。生物素500×母液：蒸餾水配成 0.02%溶液，0.22 μm 濾膜過濾除菌備用。顯影劑：0.1 mol/L Tis-HCl緩沖液(pH 8.5)，0.2 mmol/L對羥基苯丙烯酸，1.25 mmol/L 3-氨基苯二甲酰肼，需要時現(xiàn)加0.024%過氧化氫。

1.1.3 培養(yǎng)基

MGY培養(yǎng)基：甘油1%，硫酸銨 1%，YNB 0.34%，生物素0.000 04%；BMMY培養(yǎng)基：酵母粉 1%，YNB 0.34%，生物素 4×10–5%，蛋白胨 1%，0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液 (pH 6.0)，甲醇0.5%–3%，硫酸銨1%；MD固體培養(yǎng)基：YNB 0.34%，硫酸銨1%，生物素0.000 04%，葡萄糖2%，瓊脂2%；BMY培養(yǎng)基：酵母粉1%，蛋白胨2%，0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液 (pH 8.0)，YNB 0.34%，硫酸銨1%，生物素0.000 04%；高密度發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉1%，蛋白胨2%，甘油4%，0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液 (pH 8.0)，YNB 0.34%，硫酸銨1%，生物素0.000 04%。

1.1.4 主要儀器設備

G154TW 高壓蒸汽滅菌鍋，致微儀器有限公司；BSA124S萬分天平，賽多利斯公司；數(shù)顯PHS-25型pH計，上海雷磁儀器廠；J2-HS冷凍離心機，貝克曼庫爾特公司；HZ200L恒溫搖床，瑞華儀器設備有限公司；Essential LC-6高效液相色譜儀，島津公司。

1.2 方法

1.2.1 重組畢赤酵母Gpn12搖瓶培養(yǎng)

活化：28 ℃下在MD固體培養(yǎng)基上劃線，靜置培養(yǎng)至生長出明顯菌落。挑取單菌落接種到含MGY培養(yǎng)基的三角瓶(25 mL/250 mL)中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)36 h。

誘導：按10%接種量，接種到含MGY培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)36 h后，1 800 r/min離心5 min后，棄上清，用同體積BMMY重懸，同樣條件培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。

1.2.2 甲醇誘導對重組畢赤酵母 Gpn12 NovQ 表達優(yōu)化

前期探究了初始pH、誘導溫度和誘導時間對表達優(yōu)化的影響[25]。其對照組條件為 pH 6.0、28 ℃、72 h、3%甲醇，本文在此條件下，繼續(xù)考察甲醇添加量(0.5%–3.0%)對NovQ表達的影響。并將最優(yōu)甲醇添加量結(jié)果用于前期研究獲得的優(yōu)化后條件 (pH 8.0、25 ℃、96 h、3%甲醇)。NovQ蛋白半定量以NovQ表達最高的條件為100%，并設定為對照組。

1.2.3 30 L細胞催化劑制備

見前期研究文獻[22]。

1.2.4 NovQ異戊烯基轉(zhuǎn)移酶半定量

畢赤酵母采用冷凍研磨法破碎[23]：取酵母培養(yǎng)物5 mL離心去除上清，用生理鹽水洗滌3次，加入3 mL蛋白提取緩沖液于–20 ℃預凍1 h后，轉(zhuǎn)至預凍過的研缽中，加入3 g石英砂研磨10 min。

蛋白提?。恨D(zhuǎn)移酵母勻漿至25 mL離心管中，用2 mL蛋白緩沖液洗滌研缽，也并入離心管中。60 ℃水浴30 min，然后13 000 r/min離心5 min，上清轉(zhuǎn)移到新離心管，加入 50 μL去氧膽酸溶液(2%)，混勻后，4 ℃放置30 min；加入500 μL飽和三氯乙酸溶液，混勻后，4 ℃靜置6 h，13 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清；沉淀加4 ℃丙酮5 mL重懸洗滌，13 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清，重復3次；通風櫥中吹干后，加入1 mL去離子水溶解，即得含NovQ異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的胞內(nèi)蛋白。

蛋白檢測半定量：使用蛋白印跡技術(shù)對 NovQ進行檢測，Anti-6×his Tag鼠單抗為一抗，Goat Anti-Mouse IgG H&L為二抗。根據(jù)顯色強度，對目標蛋白進行半定量。

1.2.5 重組畢赤酵母Gpn12全細胞催化合成MK-3條件單因素優(yōu)化及響應面優(yōu)化

全細胞催化對照組：發(fā)酵培養(yǎng)物10%裝液量于250 mL三角瓶中，加入甲萘醌200 mg/L、異戊烯醇2 mL/L、甲醇2%、表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) 0.5%，在pH 7.5、28 ℃、200 r/min條件下催化24 h，離心收集菌體，冷凍干燥后甲醇萃取，檢測MK-3產(chǎn)量?？疾靻我蛩貫椋?) 初始 pH 4.5–8.5，梯度為 1；2) 催化溫度 20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃；3) 催化時間 0、12、24、36、48 h；4) 甲醇添加量0、1%、2%、3%、4%；5) 甲萘醌添加量 0、50、100、200、300、400 mg/L；6) 異戊烯醇添加量0、0.5、1、2、3、4 mL/L；7) CTAB添加量0、0.2%、0.5%、0.8%、1.0%；其他條件同對照組。在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)高點附近單因素方差分析選出具有顯著影響的因素(P<0.05)進行Box-Behnken實驗優(yōu)化。

1.2.6 畢赤酵母30 L發(fā)酵罐催化合成MK-3

在 30 L 發(fā)酵罐中先后考察催化時間和細胞催化劑濃度對MK-3產(chǎn)量的影響。1) 催化時間：0、12、18、24、30、36、42、48、60、72、84 h；2) 細胞催化劑濃度：100、140、180、220、260 g/L。畢赤酵母培養(yǎng)方法同1.2.3。

1.2.7 MK-3檢測方法

見前期研究文獻[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲醇誘導條件對Gpn12表達NovQ的影響

誘導劑對誘導型轉(zhuǎn)錄表達有直接影響，甲醇是重組畢赤酵母Gpn12的誘導劑和誘導階段的碳源。在前期實驗對照組條件下，甲醇濃度對NovQ異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的表達影響如圖2所示，NovQ表達量隨著甲醇添加量的增加而增多，當甲醇添加量超過2%時，NovQ表達量反而降低，高濃度甲醇可能影響了畢赤酵母的生長代謝進而抑制NovQ的表達。圖中3%甲醇添加量的條件與前期實驗對照組條件完全相同。

基于前期實驗優(yōu)化條件，NovQ表達的差異如圖3所示，甲醇濃度為2%時，NovQ表達量提高了36%左右。

圖 2 甲醇誘導劑添加量對 NovQ異戊烯基轉(zhuǎn)移酶表達的影響Fig. 2 Effect of methanol on the expression of NovQ prenyltransferase in shake flask fermentation.

圖3 不同甲醇誘導條件下NovQ表達結(jié)果比較 (A：前期優(yōu)化的NovQ表達；B：A基礎(chǔ)上甲醇優(yōu)化后的NovQ表達)Fig. 3 Comparison of NovQ expression results under different methanol-induced conditions. A: novQ expression of early optimization; B: novQ expression after methanol optimization based on A.

2.2 Gpn12全細胞催化合成MK-3條件優(yōu)化

2.2.1 初始pH對MK-3產(chǎn)量影響

在活細胞催化實驗中，pH同時影響著酶活性和細胞狀態(tài)。初始pH對MK-3產(chǎn)量影響如圖4所示，在pH 5.5–8.5范圍，隨著pH上升，MK-3產(chǎn)量增加；到pH 7.5時，MK-3達到高點，之后MK-3產(chǎn)量隨pH上升反而降低。

2.2.2 催化溫度對MK-3產(chǎn)量影響

溫度是影響酶催化反應的重要因素之一。如圖4所示，催化溫度28 ℃以下時，MK-3產(chǎn)量隨溫度升高而降低，28 ℃時MK-3產(chǎn)量僅為75 mg/L左右。隨著催化溫度升高至32 ℃，MK-3產(chǎn)量達到88 mg/L左右，與20 ℃催化時MK-3產(chǎn)量大致相當。在BRENDA酶數(shù)據(jù)庫中查到，NovQ異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.5.1.111) 最適溫度是30 ℃。結(jié)合實驗結(jié)果，選定了與NovQ最適溫度較為接近且MK-3產(chǎn)量較高的32 ℃作為下一步探索條件。

2.2.3 催化時間對MK-3產(chǎn)量影響

活細胞催化時間對 MK-3產(chǎn)量的影響如圖 4所示，MK-3產(chǎn)量在催化進行12 h達到高點，之后無明顯上升。時間過長時，細胞活力降低，合成速率低于分解速率，導致MK-3產(chǎn)量下降。36、48 h數(shù)據(jù)波動可能與液體蒸發(fā)有一定關(guān)系。

2.2.4 甲醇添加量對MK-3產(chǎn)量影響

如圖5所示，甲醇添加量在2%以下時，MK-3產(chǎn)量呈微小上升趨勢，而后隨著甲醇添加量上升，MK-3產(chǎn)量略微下降。維生素 K2類化合物生物合成中異戊烯基焦磷酸合成需要能量，甲醇是催化過程中畢赤酵母的碳源和誘導劑，但其添加量對于MK-3產(chǎn)量的影響不明顯。

圖4 初始pH、催化溫度和時間對MK-3產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effect of initial pH, catalytic temperature and time on MK-3 production.

圖5 甲醇、甲萘醌、異戊烯醇和CTAB對MK-3產(chǎn)量的影響Fig. 5 Effect of methanol, menadione, isopentenol and CTAB on MK-3 production.

2.2.5 甲萘醌對MK-3產(chǎn)量的影響

重組畢赤酵母 Gpn12通過芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶NovQ催化萘醌環(huán)異戊烯基化。維生素K2類化合物前體甲萘醌對 MK-3產(chǎn)量的影響如圖 5所示，MK-3產(chǎn)量隨著甲萘醌添加量上升基本呈現(xiàn)上升趨勢，當甲萘醌添加量達300 mg/L時達到高點，隨后呈下降趨勢。

2.2.6 異戊烯醇對MK-3產(chǎn)量的影響

Gpn12能自身通過復雜不明確的過程轉(zhuǎn)化異戊烯醇合成寡聚異戊二烯[24]，作為MK-n(n<4)的R基側(cè)鏈。異戊烯醇對MK-3的影響如圖5所示，在其添加量達到3 mL/L時，MK-3產(chǎn)量達到高點。

2.2.7 CTAB對MK-3產(chǎn)量的影響

表面活性劑CTAB對MK-3產(chǎn)量影響如圖5所示，隨著CTAB添加量增加，MK-3產(chǎn)量上升，在CTAB達到0.8%后不再增加?？赡茉蚴窃贑TAB達到臨界膠束濃度之前，在水中呈單分子狀態(tài)，不形成膠團，濃度上升可加大對細胞膜磷脂分子層的破壞，提高細胞膜的通透性，使前體進入細胞中，促進MK-3的合成；而隨著濃度達到臨界膠束濃度，繼續(xù)增加濃度只會形成膠團，憎水基團隱藏在膠團內(nèi)核，不具備繼續(xù)增加細胞膜通透性的作用。

2.2.8 響應面優(yōu)化

在單因素結(jié)果高點附近進行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)溫度、甲萘醌添加量、催化時間具有顯著影響(P<0.05)，對這3個顯著因素繼續(xù)進行響應面分析。表1所示為響應面設計實驗因素水平和編碼。

根據(jù)Design-Expert進行Box-Behnken設計，以MK-3產(chǎn)量為響應值，溫度(A)、甲萘醌添加量(B)、催化時間(C)為自變量，進行三因素三水平實驗。實驗設計及結(jié)果如表2所示。

表1 響應面設計實驗因素水平及編碼Table 1 Experimental level and coding of response surface design

表2 響應面設計及MK-3產(chǎn)量Table 2 Response surface design and MK-3 production

得到回歸方程為：

由表3方差分析結(jié)果可知，模型擬合程度極顯著(P<0.001)，R2=0.987 8，表明模型與實際擬合良好；Adj-R2=97.22%，表明模型對MK-3產(chǎn)量變化可以很好解釋；失擬不顯著(P=0.767 8)，表明模型不需要添加項，與實驗擬合較好。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

用 Design-Expert預測 MK-3在三因素–1到 1水平內(nèi)最大值為96.475 mg/L。對應溫度為31.6 ℃，甲萘醌添加量為295.59 mg/L，催化時間為15.87 h。三個平行實驗驗證 MK-3產(chǎn)量為 98.29、99.39、97.73 mg/L，平均產(chǎn)量為98.47 mg/L，與MK-3最大預估值相對誤差為2.07%。

2.3 畢赤酵母30 L發(fā)酵罐催化結(jié)果分析

2.3.1 催化時間對MK-3產(chǎn)量的影響

畢赤酵母于發(fā)酵罐中培養(yǎng)誘導之后，在攪拌速率500 r/min、pH 7.5、溫度31.6 ℃、甲醇2%、CTAB 0.8%、異戊烯醇3 mL/L、甲萘醌295.6 mg/L催化條件下，催化時間對MK-3的影響如圖6所示。催化開始，MK-3含量迅速增加，在24 h達到高點，之后呈下降趨勢。在相同時間內(nèi)，發(fā)酵罐中產(chǎn)物積累快于搖瓶中積累，高點產(chǎn)量提高，時間延后?？赡茉蚴窃诎l(fā)酵罐中，pH、溶氧等條件維持穩(wěn)定，細胞活力保持較長時間，利于MK-3合成。

2.3.2 細胞催化劑濃度對MK-3產(chǎn)量的影響

催化時間24 h、其他同2.3.1催化條件下，畢赤酵母細胞催化劑濃度對MK-3的影響如圖6所示。隨著細胞催化劑濃度升高，MK-3產(chǎn)量呈上升趨勢，在細胞催化劑濃度 220 g/L時達到高點189.67 mg/L，隨后不再繼續(xù)升高?？赡茉蚴羌毎呋瘎┰谝欢ǚ秶鷥?nèi)濃度升高有利于 MK-3的合成，但是濃度過高會使細胞生存環(huán)境惡化，不利于細胞活力的維持。

圖6 催化時間和細胞催化劑濃度對發(fā)酵罐中MK-3產(chǎn)量的影響Fig. 6 Effect of catalytic time and cell catalyst concentration on MK-3 production in fermenter.

3 結(jié)論

重組畢赤酵母 Gpn12能異源表達異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因novQ，并催化 MK-3的合成。在 NovQ表達上，本研究對甲醇添加量進行探究，發(fā)現(xiàn)在2%甲醇添加量時，NovQ表達比之前的研究提高了36%左右。在MK-3合成條件優(yōu)化方面，在搖瓶中探究了催化時間、催化溫度和甲醇添加量等 7個因素對 MK-3產(chǎn)量的影響，并對單因素方差分析篩選出的初始pH、催化溫度和甲萘醌添加量3個因素進行了響應面優(yōu)化，最終優(yōu)化后條件為初始pH 7.5、催化溫度31.6 ℃、甲醇添加量2%、甲萘醌295.59 mg/L、異戊烯醇3 mL/L、催化時間15.87 h和CTAB 0.8%，此時MK-3產(chǎn)量達到98.47 mg/L，比優(yōu)化前提高了 35%；30 L發(fā)酵罐中催化合成MK-3，發(fā)現(xiàn)在細胞催化劑初始濃度220 g/L和催化時間24 h時，MK-3產(chǎn)量達到189.67 mg/L，比前期研究結(jié)果提高了1倍以上，表明高濃度細胞催化明顯提高產(chǎn)量，有利于提高設備利用，提升生產(chǎn)強度。鑒于目前畢赤酵母表達和發(fā)酵的成熟工藝，本研究可顯著推進異戊烯基轉(zhuǎn)移酶 NovQ產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及應用進程。

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