家蠶保幼激素結(jié)合蛋白Bmtol基因的克隆及功能分析

何石寶，殷婭茹，鄭茜，郭東東，辛佳，朱勇

西南大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715

家蠶是一種鱗翅目昆蟲的模式生物，又是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，在我國擁有相當(dāng)長的飼養(yǎng)歷史。同時(shí)，家蠶又屬于變態(tài)發(fā)育昆蟲，在整個(gè)生活發(fā)育史中要經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹、成蟲4個(gè)階段，從幼蟲到成蟲的生長、發(fā)育等過程主要受到保幼激素 (Juvenile hormone，JH) 和蛻皮激素(20-hydroxyecdysone，20E) 的調(diào)控[1]。家蠶激素(保幼激素、蛻皮激素等)的合成分泌器官、生物合成途徑及對生長發(fā)育調(diào)控等的研究，是20世紀(jì)內(nèi)分泌學(xué)和昆蟲發(fā)育生物學(xué)研究的典范[2]。而保幼激素結(jié)合蛋白 (Juvenile hormone binding protein，JHBP) 是 JH在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和發(fā)揮功能的載體，是Takeout/JHBP蛋白家族的一個(gè)總稱[3-5]。

Takeout (TO) 蛋白是昆蟲獨(dú)有的一類蛋白家族，又稱保幼激素結(jié)合蛋白 (Juvenile hormone binding protein，JHBP)。Sarov-Blat L 等[6]首先在果蠅Drosophila melanogaster中被鑒定到該蛋白并命名DmTO。to基因家族是昆蟲在長期進(jìn)化過程中形成的，為其獨(dú)有的一個(gè)大的基因家族，其編碼的蛋白為分泌蛋白，序列長度為250個(gè)氨基酸左右，多數(shù)成員在N端有一段18–23個(gè)氨基酸殘基的信號肽[6-10]。而且TO/JHBP蛋白家族的多數(shù)成員在N端都有2個(gè)相當(dāng)保守的Cys殘基，參與二硫鍵的形成，且對配體結(jié)合能力也非常重要[6-11]，但配體種類還未有明確報(bào)道。Hamiaux等[12]利用硫的單波長反常衍射 (Sulfur-single wavelength anomalous diffraction，S-SAD) 技術(shù)首次報(bào)道了雄性蘋淺褐卷蛾Epiphyas postvittana中EpTO1的晶體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含 4個(gè) α螺旋和5個(gè)β折疊，Cys8和Cys15形成一個(gè)二硫鍵，連接于 N末端和 α1螺旋的第一個(gè)彎曲，并認(rèn)為該部位是TO蛋白與配體結(jié)合的核心部位。2013年，F(xiàn)ujimoto等[13]利用硒代蛋氨酸的單波長反常衍射技術(shù)對家蠶 JHBP的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，并構(gòu)建了晶體模型，發(fā)現(xiàn)與其他昆蟲 TO蛋白家族的結(jié)構(gòu)極其相似。在物種中TO和Takeout-like (TOL) 都屬于TO/JHBP蛋白家族家族成員，它們之間都有相同保守的結(jié)構(gòu)域。

to基因在昆蟲體內(nèi)的表達(dá)也具有組織特異性，比如，Sarov-Blat等[6]利用原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)to基因主要在果蠅的前胃和嗉囊中有高量表達(dá)，在腦和觸角中也有表達(dá)。Dauwalder等[8]通過原位雜交發(fā)現(xiàn)to在雌果蠅的頭部和脂肪體中沒有出現(xiàn)，只在雄果蠅的頭部和脂肪體中分布。Du等[9]通過原位雜交發(fā)現(xiàn)在煙草天蛾Manduca sexta5齡2 d幼蟲的頭部、胸及腹部表皮中表達(dá)，而其他組織中均沒有被檢測到。Justice等[14]在研究岡比亞按蚊Anopheles gambiae時(shí)發(fā)現(xiàn)TOL蛋白主要在觸角中表達(dá)。Bohbot和 Vogt在埃及伊蚊Aedes aegypti雄性的觸角中分離出to基因[15]。Fujikawa等[10]通過蛋白印跡發(fā)現(xiàn) TOL蛋白在黑花蠅Phormia regina的觸角和下唇須中高表達(dá)，而在其他組織中沒有檢測到。Saito等[16]在家蠶中鑒定了幾種to家族基因，并通過 Northern雜交發(fā)現(xiàn)Bman-0128、Bman-0147、Bman-0921、Bmbrp-1649和Bmbrp-2095主要在脂肪體中表達(dá)，Bman-0128、Bmbrp-2095和Bmbrp-1649在中腸和絲腺中表達(dá)，Bmbrp-1649還在表皮中有表達(dá)。Hagai等[17]在意大利蜜蜂Apis mellifera腹部和頭部檢測到有to表達(dá)，而在其他組織中沒有檢測到。Jordan等[18]從雄性蘋淺褐卷蛾中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)TO蛋白家族成員。而Schwinghammer等[19]發(fā)現(xiàn)TO蛋白在美洲散白蟻Reticulitermes flavipes的工蟻、兵蟻及若蟲的多個(gè)組織中也均有表達(dá)。

目前，TO/JHBP蛋白在果蠅中的功能研究得比較透徹，其功能研究主要在化學(xué)感受器 (如觸角、下唇須等) 和營養(yǎng)組織 (如脂肪體、前胃等)。Sarov-Blat等[6]在果蠅中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新to基因與果蠅取食行為的節(jié)律調(diào)控有關(guān)，隨后，So等[7]也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的果蠅生物鐘調(diào)控輸出基因。Meunier等[20]在果蠅中發(fā)現(xiàn)，Dmto編碼了一種類似于JHBP的TO蛋白，通過它可以提高果蠅饑餓時(shí)味覺系統(tǒng)對糖分的敏感性，從而增加取食量，進(jìn)而調(diào)節(jié)果蠅體內(nèi)的營養(yǎng)平衡。Dauwalder等[8]研究中發(fā)現(xiàn) TO/JHBP蛋白只在雄果蠅的頭部和脂肪體表達(dá)，卻不在雌果蠅的頭部和脂肪體中表達(dá)，他們還發(fā)現(xiàn)，TO受體細(xì)胞性別決定通路中2種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，分別為fruitless(fru) 和doublesex(dsx)，調(diào)控與性別特異性功能相關(guān)的多種調(diào)控因子，故TO/JHBP蛋白主要通過對性別信號進(jìn)行加工整合，進(jìn)而影響雄性的求偶行為。Du等[9]發(fā)現(xiàn)煙草天蛾的to/JHBP基因家族可以維持表皮細(xì)胞中JH的含量，同時(shí)也受到JH和營養(yǎng)狀況的調(diào)控。Bohbot等[15]在埃及伊蚊的觸角中發(fā)現(xiàn)TO蛋白高量表達(dá)，可推測TO蛋白對宿主、食物或信息素氣味分子有化學(xué)感應(yīng)。在黑花蠅中通過免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明 TOL蛋白主要分布于輔助細(xì)胞的細(xì)胞膜周圍和唇瓣味覺感受器的淋巴液中，這表明了 TOL蛋白也可能對昆蟲的感受系統(tǒng)有調(diào)控作用[10]。Hagai等[17]在意大利蜜蜂的研究中發(fā)現(xiàn)TO蛋白的表達(dá)受到發(fā)育相關(guān)因子JH調(diào)控。Bauer等[21]發(fā)現(xiàn)如果TO的表達(dá)量增多，會延長果蠅的壽命。那么Bmtol基因在家蠶頭部、表皮和精巢中的表達(dá)是否也參與生物節(jié)律、取食活動、性別分化和求偶行為等調(diào)控？這些問題都需要回答。

本研究篩選并鑒定得到了一個(gè)新的保幼激素結(jié)合蛋白Bmtol基因，并對Bmtol基因進(jìn)行原核表達(dá)、蛋白純化和制備抗體，同時(shí)對該蛋白進(jìn)行表達(dá)情況分析及免疫組化分析，以期為進(jìn)一步研究在其家蠶頭部和精巢中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用的家蠶品種大造由西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院家蠶育種實(shí)驗(yàn)室提供。幼蟲在 (25±1) ℃、相對濕度70%、自然光照條件下桑葉飼養(yǎng)。分別對供試家蠶從收蟻至化蛾各時(shí)期和5齡3 d各組織進(jìn)行取材，置于–80 ℃保存。

取正常生長且健康的5齡起蠶90頭，隨機(jī)分成3組，第1組飼喂不作任何處理的新鮮桑葉；第2組為實(shí)驗(yàn)組添食0.1 mg/L JHA浸泡的新鮮桑葉，每天分別添食1次，連續(xù)處理3 d，其他為正常桑葉飼喂；第3組為對照組添食0.1 mg/L丙酮溶液浸泡的新鮮桑葉，每天分別添食1次，連續(xù)處理3 d，其他為正常桑葉飼喂；然后在第5天開始取材，用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定。

BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金公司；pMD19-T vector克隆載體、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等購自TaKaRa公司；pET28a表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；IPTG、Ampicilline、X-Gal、Kanamycin購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；Ni-NTA親和層析介質(zhì)和引物購自南京金斯瑞公司；瓊脂糖購自 Invitrogen公司；酵母粉、蛋白胨購自O(shè)XOID公司；JHA (苯氧威) 購自Sigma公司；其他未標(biāo)明試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 Bmtol基因克隆與鑒定

從SilkDB和NCBI中獲取家蠶Bmtol基因的芯片數(shù)據(jù)，找出相對應(yīng)芯片號與基因之間的對應(yīng)關(guān)系，查找基因并整理基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，初步對Bmtol基因的表達(dá)情況進(jìn)行預(yù)測。同時(shí)又通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線BLAST軟件檢索找到一條與家蠶數(shù)據(jù)庫相似基因的預(yù)測序列，并沒有前人報(bào)道和克隆該基因的編碼序列，故初步判定為新基因。故對編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，引物序列見表 1，以大造5齡3 d整蠶的RNA為模板，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一條鏈，并用內(nèi)參基因BmActin3進(jìn)行檢測，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性 35 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；再在72 ℃進(jìn)行終延伸10 min，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)染色后觀察確認(rèn)滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。以總cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 50 s，反應(yīng) 30 個(gè)循環(huán)；再在72 ℃進(jìn)行終延伸10 min，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)染色后觀察并進(jìn)行膠回收。將目的片段連接到 pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌中，通過菌液PCR篩選陽性克隆菌，送至華大基因進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.3 Bmtol基因的組織和時(shí)期表達(dá)特征分析

將研缽和研棒洗凈用160 ℃高溫烘4–6 h。研磨前用液氮預(yù)冷研缽和研棒，分別將5齡3 d的家蠶各組織和收蟻到化蛾各時(shí)期的材料放入研缽中，并在液氮中研磨成粉末，此過程中要反復(fù)添加液氮，避免其完全揮發(fā)。利用 Trizol試劑(TaKaRa) 提取家蠶各組織和各時(shí)期的總 RNA，并利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，合成cDNA第一鏈。利用表1中的內(nèi)參引物，以家蠶5齡3 d幼蟲各組織器官和各時(shí)期的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性35 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；再在72 ℃進(jìn)行終延伸10 min，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)染色后觀察確認(rèn)滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。對檢測后的cDNA模板表達(dá)特征分析，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；再在72 ℃進(jìn)行終延伸10 min，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色觀察。

1.4 Bmtol基因的原核表達(dá)、蛋白純化及抗體制備

對BmTOL序列進(jìn)行信號肽和跨膜分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有一段信號肽序列，沒有跨膜區(qū)，故對非信號肽區(qū)域設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物，見表 1。以家蠶大造5齡3 d整蠶cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同1.2。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增和膠回收，克隆到pMD19-T載體上 (命名為pMD19-Bmtol)，轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌中，通過菌液PCR篩選出陽性克隆菌，送至華大基因進(jìn)行測序驗(yàn)證。將pET28a質(zhì)粒載體與pMD19-Bmtol重組質(zhì)粒用BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，并回收雙酶切產(chǎn)物，構(gòu)建 pET28a-Bmtol重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，并進(jìn)行測序驗(yàn)證。同時(shí)轉(zhuǎn)化 pET28a質(zhì)粒作為原核表達(dá)的對照。將重組質(zhì)粒pET28a-Bmtol和空載體pET28a轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌在 IPTG終濃度為 0.4 mmol/L的 28 ℃和37 ℃條件培養(yǎng)，間隔2 h取一次樣，收集菌體，用PBS重懸，經(jīng)12% SDS-PAGE檢測。同時(shí)又對其在不同IPTG終濃度的條件下誘導(dǎo)8 h，分析蛋白表達(dá)情況和對重組蛋白進(jìn)行可溶性分析，最后綜合上述表達(dá)條件的優(yōu)化，確定最佳表達(dá)條件為28 ℃、IPTG終濃度為0.4 mmol/L、誘導(dǎo)8 h。并進(jìn)行大量表達(dá)，利用 Ni-NTA親和層析進(jìn)行重組蛋白純化，用不同溶度的咪唑洗脫重組蛋白，并對重組蛋白進(jìn)行透析和濃縮，最后送至重慶澤恒生物技術(shù)有限公司進(jìn)行多克隆抗體制備。

表1 本研究所用引物Table1 Primers used in this study

1.5 Western blotting檢測和免疫組化

在液氮中研磨家蠶5齡3 d的頭部、表皮、脂肪體、中腸、絲腺、馬氏管、血淋巴、精巢和卵巢等組織，研磨后的粉末用蛋白裂解液溶解提取總蛋白，并用Bradford法測定總蛋白濃度。將總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，以α-tubulin為內(nèi)參，根據(jù)蛋白濃度計(jì)算上樣量。再進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、一抗二抗孵育、顯色和曝光處理，步驟如下：

1) 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜正面 (朝向凝膠的面為正面) 朝上，用 TBST溶液清洗后，浸泡在封閉液中，室溫?fù)u蕩3 h或4 ℃恒溫封閉過夜；2) 一抗孵育：將PVDF膜從封閉液中取出，放入一抗稀釋液 (α-tubulin抗體為1∶10 000，一抗以1∶20 000) 中，37 ℃孵育1 h或4 ℃孵育過夜，用 TBST 洗膜 3–4 次，10–15 min/次；3) 二抗孵育：BmTOL為羊抗兔，內(nèi)參為羊抗鼠，稀釋比例為1∶30 000，37 ℃孵育1 h后，用TBST洗膜3–4次，15 min/次；4) ECL顯色：將ECL顯色液A液和B液按等比例 (1∶1) 混勻，注意避光，現(xiàn)配現(xiàn)用；將配好的ECL顯色液加入到PVDF膜上，并保證顯色液覆蓋整個(gè)PVDF膜，避光顯色3–5 min；5) 曝光：顯色完畢后，在化學(xué)發(fā)光成像儀上進(jìn)行曝光處理，曝光時(shí)間30–50 s，觀察并保存圖片。

選取5齡3 d的家蠶頭部組織用4% (W/V) 多聚甲醛4 ℃固定24 h，然后進(jìn)行脫水，用石蠟包埋。將石蠟包埋的組織進(jìn)行切片、攤片和烤片處理。然后進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，步驟如下：

1) 脫蠟處理：二甲苯Ⅰ (10–15 min)→二甲苯Ⅱ(10–15 min)→100%酒精Ⅰ (5 min)→100%酒精Ⅱ(5 min)→95%酒精Ⅰ (3 min)→95%酒精Ⅱ (3 min)→90%酒精 (2 min)→80%酒精 (2 min)→70%酒精(2 min)→ddH2O (10 min)；

2) 滅活：用 3%去離子水孵育或 10% H2O2室溫/溫箱孵育10–15 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，用PBS溶液沖洗5 min×3次；

3) 抗原修復(fù)：0.01 μL檸檬酸緩沖液 (pH 0.6)連同容器一起放入水浴鍋中加熱10 min，期間用溫度計(jì)測溫，待抗原修復(fù)液溫度達(dá)到有效溫度(68–70 ℃) 后，將切片放入持續(xù)40 min，取出恢復(fù)至室溫，微波修復(fù)10 min，防止緩沖液干涸暴露組織。用PBS溶液沖洗5 min×3次；

4) 滴加內(nèi)源性堿性磷酸酶阻斷劑，室溫孵育10–15 min，以阻斷內(nèi)源性堿性磷酸酶的活性。用PBS溶液沖洗5 min×3次；

5) 滴加封閉液，37 ℃孵育 20–30 min 或 4 ℃過夜孵育，甩去多余液體，勿洗；

6) 滴加一抗 (1∶2 000) 覆蓋組織，并將切片置于濕盒中，37 ℃溫箱孵育2–3 h或4 ℃過夜，次日取出后溫箱孵育 1 h。陰性對照組滴加 PBS緩沖液。用PBS溶液沖洗5 min×3次；

7) 滴加AP標(biāo)記的二抗IgG，在37 ℃溫箱孵育30–60 min。用PBS溶液沖洗5 min×3次；

8) 滴加BCIP/NBT顯色劑進(jìn)行顯色，室溫顯色3–30 min，在顯微鏡下觀察顯色情況，蒸餾水沖洗；

9) 脫水透明：70%酒精 (2 min)→80%酒精(2 min) →90%酒精 (2 min)→95%酒精Ⅰ (5 min)→95%酒精Ⅱ (3 min)→100%酒精Ⅰ (5 min)→100%酒精Ⅱ (5 min)→二甲苯Ⅰ (15 min)→二甲苯Ⅱ (15 min)；

10) 封片：用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶保幼激素結(jié)合蛋白Bmtol基因的克隆與鑒定

以大造5齡3 d家蠶表皮組織的cDNA為模板，用Bmtol基因的引物對Bmtol基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測與分析PCR產(chǎn)物的片段大小，電泳結(jié)果顯示有特異性條帶(圖 1)。并對該特異性 PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，連接轉(zhuǎn)化，挑選出陽性克隆菌進(jìn)行測序，確定該片段大小。

圖1 Bmtol基因的PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplification of Bmtol gene. M: DL2000 DNA marker; 1, 2: PCR amplification of Bmtol gene.

2.2 家蠶保幼激素結(jié)合蛋白Bmtol基因的序列分析

對Bmtol基因進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)與NCBI上的預(yù)測序列基本一致，得到的 cDNA序列長度為 810 bp(GenBank登錄號：KY681053)，其中 ORF為 759 bp，包含 6個(gè)外顯子，5個(gè)內(nèi)含子，編碼的氨基酸序列為252個(gè)氨基酸，發(fā)現(xiàn)該蛋白序列第1–23氨基酸為信號肽。利用protparam軟件對該基因編碼的蛋白進(jìn)行預(yù)測分析，其理論分子量為27.72 kDa，等電點(diǎn)為6.16。

2.3 家蠶保幼激素結(jié)合蛋白BmTOL多序列比對

從 NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得埃及伊蚊、家蠶、果蠅、蘋果褐卷蛾、棉鈴蟲、斑點(diǎn)木蝶、柑橘鳳蝶等物種的 TO的氨基酸序列，將這些序列與家蠶BmTOL蛋白進(jìn)行多序列比對，在比對中與這些昆蟲的總相似度為34.54%。家蠶BmTOL蛋白是一種JHBP蛋白，是TO/JHBP家族的一員，在序列比對中發(fā)現(xiàn)，在N端含有兩個(gè)保守的Cys殘基，這兩個(gè)Cys殘基參與二硫鍵的形成，連接于N末端和α1螺旋的第一個(gè)彎曲，是TO蛋白結(jié)合配體的核心部位 (圖2)。

2.4 Bmtol基因的組織和時(shí)期表達(dá)特征分析

利用RT-PCR對家蠶5齡3 d各組織Bmtol基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)主要在頭部有高量表達(dá)，其次在表皮和精巢表達(dá)量也較高，而其他組織的表達(dá)量很低或沒有 (圖3)。同時(shí)，對Bmtol基因在各時(shí)期的表達(dá)情況進(jìn)行 RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)主要在每個(gè)時(shí)期的起蠶時(shí)表達(dá)量較高，從5齡3 d到化蛹7 dBmtol基因表達(dá)量都比較低，到化蛾后又開始上調(diào) (圖4)。

2.5 Bmtol基因的原核表達(dá)、蛋白純化及抗體制備

圖2 昆蟲TO蛋白多序列比對結(jié)果Fig. 2 Multiple sequence slignment results of TO proteins in insects. Aa: Aedes aegypti; Bm: Bombyx mori; Ep:Epiphyas postvittana; Ha: Helicoverpa armigera; Pa: Pararge aegeria; Dm: Drosophila melanogaster; Px: Papilio xuthus.

為了對該蛋白進(jìn)行深入研究，我們對非信號肽區(qū)域進(jìn)行克隆，并送公司測序驗(yàn)證。構(gòu)建含有該目的片段的原核表達(dá)載體，利用 BL21 (DE3)大腸桿菌對重組蛋白進(jìn)行原核表達(dá)。由于pET28a表達(dá)載體上含有 His標(biāo)簽序列，該標(biāo)簽蛋白的分子量大小約為 4 kDa，去掉信號肽的目的蛋白分子量大小約為25 kDa。對28 ℃和37 ℃在不同時(shí)間的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)重組蛋白在28 ℃和37 ℃的條件下均能表達(dá)，在28 ℃條件誘導(dǎo)8 h表達(dá)量達(dá)到最大值，在37 ℃條件下誘導(dǎo)6 h表達(dá)量達(dá)到最大值。又對重組表達(dá)菌在28 ℃和37 ℃條件下不同IPTG濃度誘導(dǎo)下的表達(dá)情況進(jìn)行分析，圖5和6顯示，在28 ℃條件下，IPTG終濃度為0.6 mmol/L時(shí)表達(dá)量最高；在37 ℃條件下，IPTG終濃度為0.4 mmol/L時(shí)表達(dá)量最高。為了確定重組蛋白在表達(dá)菌中是以什么形式表達(dá)的，對上述成功表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行可溶性分析，發(fā)現(xiàn)在37 ℃和28 ℃誘導(dǎo)條件下，目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，但也有可溶性表達(dá)，而且溫度越低越有利于可溶性蛋白的形成和表達(dá)。根據(jù)上述分析，確定一個(gè)最佳的表達(dá)蛋白的條件 (IPTG終濃度為0.6 mmol/L在28 ℃誘導(dǎo)8 h) 進(jìn)行蛋白的大量表達(dá)，并對表達(dá)的蛋白進(jìn)行 Ni-NTA親和層析和蛋白純化 (圖 7)。對純化好的重組蛋白進(jìn)行透析和濃縮，發(fā)現(xiàn)獲得了較純的重組蛋白。最后將重組蛋白送至公司制備多克隆抗體，抗體效價(jià)檢測大于500 000，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 RT-PCR分析家蠶Bmtol基因在5齡3 d各組織的表達(dá)Fig. 3 RT-PCR analysis of Bmtol gene in various tissues of 3 day in 5th instar silkworm larvae. 1: head; 2: epidermis;3: fat body; 4: midgut; 5: silk gland; 6: malpighian tube; 7: hemolymph; 8: testis; 9: ovary.

圖4 家蠶Bmtol基因各時(shí)空表達(dá)譜Fig. 4 The expression profile of Bmtol gene during whole larvae development. 1: hatching; 2: day-2 1st instar; 3: 1st instar pre-molting; 4: day-1 2nd instar; 5: day-2 2nd instar; 6: 2nd instar pre-molting; 7: day-1 3th instar; 8: day-2 3th instar; 9: 3th instar pre-molting; 10: day-1 4th instar; 11: day-2 4th instar; 12: 4th instar pre-molting; 13: day-1 5th instar;14: day-3 5th instar; 15: day-5 5th instar; 16: day-7 5th instar; 17: prepupa; 18: day-1 pupa; 19: day-3 pupa; 20: day-5 pupa; 21: day-7 pupa; 22: moth.

圖5 在28 ℃條件下不同IPTG濃度誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)Fig. 5 The aim protein expression induced at different concentrations of IPTG at 28 ℃. M: protein marker; 1:pET28(a) vector induced; 2–7: recombination expression bacterium respectively induced for 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 and 1.0 mmol/L.

圖6 在37 ℃條件下不同IPTG濃度誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)Fig. 6 The aim protein expression induced at different concentrations of IPTG at 37 ℃. M: protein marker; 1:pET28(a) vector induced; 2–7: recombination expression bacterium respectively induced for 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 and 1.0 mmol/L.

圖7 目的蛋白純化SDS-PAGE檢測Fig. 7 Purified proteins detected by SDS-PAGE. M:protein marker; 1: pET28(a) vector induced; 2: outflow liquid; 3: 10 mmol/L; 4: 50 mmol/L; 5: 100 mmol/L; 6:200 mmol/L; 7: 250 mmol/L; 8: 300 mmol/L.

2.6 Western blotting檢測和免疫組化

為檢查純化的蛋白是否為目的蛋白及抗體是否符合實(shí)驗(yàn)要求，對抗體進(jìn)行檢測，檢測發(fā)現(xiàn)抗體滿足實(shí)驗(yàn)要求，并顯示提取了目的蛋白 (圖8)。通過Western blotting在蛋白水平上對家蠶各組織中BmTOL的表達(dá)情況進(jìn)行分析，BmTOL蛋白主要在家蠶的頭部、表皮和精巢有表達(dá) (圖 9)。為了確定Bmtol在家蠶頭發(fā)揮功能的位置，我們選擇了5齡5 d的家蠶頭部，通過免疫組化技術(shù)對BmTOL蛋白在頭部組織位置進(jìn)行定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn) BmTOL蛋白主要在家蠶頭部表皮層和腦中表達(dá)，陰性對照組沒有。此外對于添食JHA處理組和丙酮對照組中，發(fā)現(xiàn) BmTOL蛋白表達(dá)量有所上調(diào)，但差異不是很顯著 (圖10)。

3 討論

家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物，研究其保幼激素結(jié)合蛋白在家蠶體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制，可以為其他昆蟲的研究提供理論依據(jù)和參考價(jià)值。本研究通過SilkDB和NCBI數(shù)據(jù)庫篩選并鑒定到了一個(gè)新的Bmtol基因。通過 RT-PCR和 Western blotting分別對5齡3 d的組織mRNA和蛋白 表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bmtol基因無論在核酸還是蛋白水平上都是在頭部高量表達(dá)，其次是表皮和精巢中。并對從收蟻到化蛾的各時(shí)期進(jìn)行了 RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)在幼蟲期的各起蠶時(shí)高量表達(dá)，另外在 5齡至蛹期Bmtol基因的表達(dá)水平一直都很低，但是化蛾后表達(dá)量又突然上調(diào)。推測Bmtol基因可能參與生物節(jié)律、攝食活動、發(fā)育等方面的調(diào)控。此外該基因除了參與幼蟲期的發(fā)育調(diào)控外，可能還在化蛾后參與其他方面的調(diào)控 (如性信息調(diào)控、求偶行為等)。

圖8 重組蛋白的Western blotting檢測Fig. 8 Western blotting analysis of recombinant proteins. 1,3: purified protein of concentrated; 2,4:purified protein of non-concentrated; 5: supernatant protein; 6: pET28(a) vector.

圖9 Western blotting檢測分析家蠶BmTOL蛋白在各組織的表達(dá)Fig. 9 Western blotting analysis of BmTOL expression in various tissues of the silkworm larvae. 1: head; 2:epidermis; 3: fat body; 4: midgut; 5: silk gland; 6:malpighian tube; 7: hemolymph; 8: testis; 9: ovary.

圖10 BmTOL蛋白在家蠶頭部組織的免疫組化結(jié)果Fig. 10 Immunohistochemistry results of BmTOL in silkworm head. The red arrow: BmTOL. Red arrow are the positive results of TO protein.

前人的研究表明，在果蠅中to基因參與取食行為和生物節(jié)律調(diào)控[6-7]。Meunier等[20]在果蠅中發(fā)現(xiàn)，通過Dmto編碼的TO蛋白，可以提高果蠅饑餓時(shí)味覺系統(tǒng)對糖分的敏感性，從而增加取食量，進(jìn)而調(diào)節(jié)果蠅體內(nèi)的營養(yǎng)平衡。Dauwalder等[8]研究發(fā)現(xiàn)TO/JHBP蛋白只在雄果蠅的頭部和脂肪體表達(dá)，卻不在雌果蠅的頭部和脂肪體中表達(dá)。他們還發(fā)現(xiàn)，TO受體細(xì)胞性別決定通路中2種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，分別為fruitless(fru) 和doublesex(dsx)，調(diào)控與性別特異性功能相關(guān)的多種調(diào)控因子，同時(shí)to基因的表達(dá)又能間接調(diào)控Fru的作用；此外，在求偶和交配過程中，果蠅頭部會分泌TO蛋白來影響雄性的行為，故TO/JHBP蛋白主要通過對性別信號進(jìn)行加工整合，進(jìn)而影響雄性的求偶行為。Bauer等[21]發(fā)現(xiàn)TO的表達(dá)量增多會延長果蠅的壽命。to/JHBP基因家族可以維持煙草天蛾表皮細(xì)胞中JH的含量，同時(shí)又受到JH和營養(yǎng)狀況的調(diào)控[9]。在黑花蠅的研究中發(fā)現(xiàn)TOL蛋白主要分布于輔助細(xì)胞的細(xì)胞膜周圍和唇瓣味覺感受器的淋巴液中，對昆蟲的感受系統(tǒng)有調(diào)控作用[10]。

Saito等[16]在家蠶中鑒定了幾個(gè)to家族基因，通過Northern雜交發(fā)現(xiàn)Bman-0128、Bman-0147、Bman-0921、Bmbrp-1649和Bmbrp-2095主要在脂肪體中表達(dá)，Bman-0128、Bmbrp-2095和Bmbrp-1649在中腸和絲腺中表達(dá)，Bmbrp-1649還在表皮中有表達(dá)，但并未對其進(jìn)一步深入探究。本研究結(jié)果表明，Bmtol基因主要在家蠶的頭部、表皮和精巢中表達(dá)，且在頭部高量表達(dá)，說明該基因主要在頭部發(fā)揮功能。JH在昆蟲的生長發(fā)育過程中起到一個(gè)開關(guān)的作用，而TO/JHBP間接調(diào)控昆蟲的生長發(fā)育，在胚胎發(fā)育過程中如果有新的 JHBP合成，那么組織的敏感性也會發(fā)生一定的變化，在胚胎期就能決定不同細(xì)胞對JH的應(yīng)答類型[22]。此外，對于Bmtol基因與家蠶體內(nèi)該家族其他基因在組織中的表達(dá)存在差異，說明該家族的基因并不具有功能一致性，可能該家族基因在不同組織中具有不同的功能，對此需要實(shí)驗(yàn)加以證明。

本研究通過SilkDB和NCBI數(shù)據(jù)庫篩選并鑒定到了一個(gè)新的Bmtol基因，對該蛋白基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)并制備了多克隆抗體，通過組織和時(shí)期表達(dá)分析及免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白只在頭部高量表達(dá)，其次在表皮和精巢中，其他組織表達(dá)量很低或沒有。在幼蟲期的各起蠶時(shí)高量表達(dá)，在5齡至蛹期Bmtol基因的表達(dá)水平一直都很低，但是化蛾后表達(dá)量又突然上調(diào)。推測Bmtol基因可能參與生物節(jié)律、攝食活動、發(fā)育等方面的調(diào)控，還可能在化蛾后參與其他方面的調(diào)控(如性信息調(diào)控、求偶行為等)，但需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)對此推測進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)通過添食JHA處理，免疫組化分析發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)量有所上調(diào)，但不是很顯著，可能激素處理對其作用效果不是太明顯，對此可以再從饑餓誘導(dǎo)、生物節(jié)律等方面進(jìn)行進(jìn)一步功能探究。此外，由于Bmtol基因在家蠶的表皮和精巢中也有表達(dá)，在家蠶幼蟲期和化蛾時(shí)高量表達(dá)，故也可以從這些方面再進(jìn)行其功能的研究，以探究其在家蠶體內(nèi)的分子調(diào)控機(jī)制，為更好地應(yīng)用于蠶絲產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

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