棘胸蛙抗菌肽Spinosan-C的串聯(lián)表達(dá)與活性檢測(cè)

劉悅，詹忠根，朱兵，鄭榮泉，程宏毅，聶作明

1 浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310018

2 浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018

3 浙江師范大學(xué) 生態(tài)研究所，浙江 金華 321004

棘胸蛙Paa spinosa，又名石蛙，在長(zhǎng)江以南地區(qū)廣泛分布，其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，具有清涼滋補(bǔ)、健肝胃、防癌抗癌等多種功效，兼具美食和藥用價(jià)值，素有“百蛙之王”的美名。為滿足人民生活的需要，20世紀(jì) 80年代福建、江西等地開始嘗試馴養(yǎng)棘胸蛙，之后安徽、江蘇、湖北、浙江、云南、貴州、廣西等省陸續(xù)有人工養(yǎng)殖棘胸蛙的報(bào)道。近年來(lái)，在科技人員的幫助下，有的企業(yè)實(shí)現(xiàn)了人工育種、育苗，嘗試工廠化養(yǎng)殖，逐漸走上規(guī)?；?、科技化的道路，取得了不錯(cuò)的效益。但因野生棘胸蛙常年棲息于水質(zhì)清澈的山澗、溪流中，活動(dòng)范圍較大，而人工養(yǎng)殖時(shí)飼養(yǎng)密度變大，加上水質(zhì)變化等影響，常受水霉病、紅腿病、爛皮等多種疾病的困擾，給棘胸蛙養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響著棘胸蛙養(yǎng)殖的可持續(xù)性發(fā)展。

為預(yù)防和控制病害的發(fā)生，養(yǎng)殖戶不得不大量使用抗生素藥物。盡管抗生素的主導(dǎo)地位短期內(nèi)不會(huì)動(dòng)搖，但隨著病原菌抗藥性問題的日趨嚴(yán)重，越來(lái)越多的科學(xué)家把目光轉(zhuǎn)移到抗菌肽新藥的研發(fā)上?？咕?(Antimicrobial peptides) 廣泛分布于動(dòng)、植物體內(nèi)[1]，通常在μmol/L級(jí)即具有抗菌能力[2-3]，是最有前途的傳統(tǒng)抗生素替代品，已成為國(guó)際學(xué)術(shù)研究的活躍領(lǐng)域之一[4-5]。

而蛙類是生物活性肽的巨大儲(chǔ)備庫(kù)，其皮膚分泌物中即含有多種抗菌肽，自1970年從歐洲鈴蟾皮膚分泌物中分離到第一個(gè)具有溶血功能的抗菌肽后，目前已從鈴蟾屬Bombina、肛褶蛙屬Kassina、雨濱蛙屬Litoria、葉泡蛙屬Phyllomedusa、多指節(jié)蟾屬Pseudis、蛙屬Rana、耳腺蟾屬Uperoleia、爪蟾屬Xenopus和棘蛙屬Q(mào)uasipaa等蛙類的皮膚分泌物中分離到分別屬于Brevinin-1、Esculentin-1、Esculentin-2、Temporin、Ranalexin、Ranatuerin-1、Ranatuerin-2、Plaustrin、Brevinin-2、Tigerinin、Japonicin、Nigrocin 和Melittin等13個(gè)家族的抗菌肽[6-7]。

為提高棘胸蛙的疾病防治能力，前期已從棘胸蛙皮膚中克隆得到 4條抗菌肽序列[8]，本研究為克服抗菌肽易被蛋白酶降解及對(duì)宿主大腸桿菌的殺傷作用，進(jìn)一步提高大腸桿菌系統(tǒng)的表達(dá)能力，以棘胸蛙抗菌肽Spinosan-C為研究對(duì)象，探討利用大腸桿菌系統(tǒng)高效表達(dá) 8倍串聯(lián)的8×Spinosan-C重組蛋白，經(jīng)甲酸切割后得到具有抑菌活性的Spinosan-C抗菌肽單體，以期為抗菌肽的規(guī)?；苽浜彤a(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

棘胸蛙采集于浙江省蘭溪市，約 1.5齡，體重約40?60 g。將采集的棘胸蛙用雙毀髓法處死后取新鮮蛙皮立即至液氮凍存，于?70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Rosetta為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品。原核表達(dá)載體pET-28a、大腸桿菌 TG1菌株和枯草芽孢桿菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。dNTPs和 rTaq等 PCR試劑為TaKaRa公司產(chǎn)品；瓊脂糖、甲酸、十二烷基磺酸鈉購(gòu)自德國(guó) Boehringer Mannheim公司；卡那霉素、N,N?-甲叉雙丙烯酰胺、異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG) 為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；蛋白胨和酵母提取物購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR回收試劑盒購(gòu)自 Axygen公司；棘胸蛙Spinosan-C抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)品由上海吉爾生化有限公司合成。

1.2 棘胸蛙抗菌肽Spinosan-C的序列分析

應(yīng)用 DNASTAR 軟件對(duì)抗菌肽基因Spinosan-C進(jìn)行開放閱讀框和編碼氨基酸序列分析，確定抗菌肽的氨基酸序列。將得到的抗菌肽序列通過(guò)BLAST在線分析程序 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 查找 GenBank中的其他相似性序列，確定棘胸蛙Spinosan-C抗菌肽的同源序列。應(yīng)用 BioEdit軟件中的 ClusterW 程序?qū)pinosan-C及其同源序列進(jìn)行多序列比較。通過(guò)CD-Search檢索保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù) CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，確定Spinosan-C含有的保守結(jié)構(gòu)域和成熟肽。

1.3 抗菌肽 Spinosan-C基因的串聯(lián)表達(dá)與串聯(lián)重組蛋白的切割

1.3.1 串聯(lián)抗菌肽基因的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)抗菌肽Spinosan-C基因編碼框和大腸桿菌密碼子偏好性設(shè)計(jì) 8倍串聯(lián)的抗菌肽基因8×Spinosan-C，為方便融合蛋白切割和表達(dá)載體構(gòu)建，在每個(gè)抗菌肽基因單體之間插入編碼蛋白甲酸切割位點(diǎn)，在5'和3'末端引入EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，并加入了導(dǎo)肽 pho A。序列由蘇州金維智生物有限公司合成，裝入到pUC-18載體上。

1.3.2 串聯(lián)抗菌肽重組表達(dá)載體的構(gòu)建

利用EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切含有 8×Spinosan-C基因的重組載體和 pET-28a原核表達(dá)載體，純化回收8×Spinosan-C基因片段和pET-28a雙酶切片段，連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有卡那霉素的 LB培養(yǎng)基平板，挑選陽(yáng)性菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，PCR和雙酶切鑒定重組菌，鑒定為陽(yáng)性的重組菌送上海生工生物有限公司進(jìn)一步測(cè)序鑒定。

1.3.3 串聯(lián)抗菌肽融合蛋白的原核表達(dá)、純化和切割

將測(cè)序鑒定和理論序列相符的陽(yáng)性重組菌按1%的接種量接種LB液態(tài)培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)6 h，然后加入IPTG誘導(dǎo)劑 (終濃度為2 nmol/L)，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜。4 500 r/min離心30 min收集菌體，用超純水清洗，12 000 r/min離心10 min收集菌體，重復(fù)3 次。將所得菌體用裂解液重懸后冰浴條件下超聲波破碎，12 000 r/min離心10 min，分別取沉淀 (包涵體) 和上清液留樣。包涵體用PBS清洗3次，用8 mol/L的尿素溶液重懸，30 ℃、200 r/min振蕩至懸液澄清。離心后取上清液用鎳柱進(jìn)行融合蛋白的純化 (如重組蛋白不掛鎳柱則采用蛋白割膠純化)，用 50–250 mmol/L的咪唑濃度梯度進(jìn)行洗脫，SDS-PAGE檢測(cè)各個(gè)階段蛋白樣品。將純化后的蛋白進(jìn)行透析，然后冷凍干燥，最后利用甲酸進(jìn)行化學(xué)切割。切割甲酸濃度為40%，切割溫度37 ℃，切割時(shí)間36 h。切割后的樣品直接凍干，隨后加無(wú)菌水溶解后再次凍干，重復(fù)3次，盡可能去除樣品中的甲酸。最后一次樣品用PBS溶解，溶解后的抗菌肽單體采用Trisin-SDS-PAGE檢測(cè)。

1.4 抗菌肽切割單體抑菌效果的鑒定

1.4.1 培養(yǎng)平板的制備

在滅菌后的平板中倒入1%瓊脂作為下層培養(yǎng)基，待下層培養(yǎng)基凝固后，將滅菌后的LB 培養(yǎng)基冷卻至65 ℃左右，加入1 mL培養(yǎng)過(guò)夜的大腸桿菌TG1菌液混勻，然后加至預(yù)先準(zhǔn)備的下層培養(yǎng)基上，待培養(yǎng)基凝固后，即制成革蘭氏陰性菌抑菌試驗(yàn)培養(yǎng)平板。以同樣的方法，用枯草芽孢桿菌制得革蘭式陽(yáng)性菌抑菌平板。

1.4.2 杯碟法檢測(cè)抗菌肽單體的抑菌效果

抗菌肽的抑菌效果采用杯碟法進(jìn)行檢測(cè)。在每個(gè)培養(yǎng)平板上擺放5個(gè)牛津杯，并標(biāo)記數(shù)字1、2、3、4、5。1 號(hào)牛津杯加入 10 mg/mL 氨芐青霉素，2號(hào)牛津杯加入陽(yáng)性對(duì)照抗菌肽moricin樣品 (定量至1 mmol/L)，3號(hào)牛津杯加入人工合成的本研究目標(biāo)抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)品 (濃度為1 mmol/L)，4號(hào)牛津杯加入制備的抗菌肽樣品，5號(hào)加入PBS作為陰性對(duì)照。樣品加滿整個(gè)牛津杯，以不外溢為準(zhǔn)，37 ℃培養(yǎng)12 h。根據(jù)抑菌圈的直徑，判斷樣品的抗菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 棘胸蛙抗菌肽 Spinosan-C基因的序列分析

Spinosan-C基因的 ORF框及其編碼的氨基酸序列如圖 1A所示，該基因編碼的抗菌肽前體肽長(zhǎng)度為 72 aa。經(jīng) Blast分析發(fā)現(xiàn)，Spinosan-C前體肽和高山倭蛙Nanorana parkeri的多個(gè)抗菌肽前體如Temporin-H (GenBank登錄號(hào)：XP_018423642.1)、Parkerin (GenBank登錄號(hào)：ACX47914.1)、Japonicin-1NPa (GenBank登錄號(hào)：ACX47912.1)和Japonicin-1NPb (GenBank登錄號(hào)：ACX47913.1)具有較高同源性，其相似性分別為 60%、61%、58%和70%；同時(shí)和倭蛙Nanoranapleskei抗菌肽Pleskein-1 (GenBank登錄號(hào)：AIU99932.1)、Pleskein-2 (GenBank登錄號(hào)：AIU99931.1)和Pleskein-3 (GenBank登錄號(hào)：AIU99930.1) 的前體肽也具有較高同源性，其相似性分別為76%、55%和73%。進(jìn)一步分析表明，這些抗菌肽N端具有較高保守性，如圖 1B所示，經(jīng)保守結(jié)構(gòu)域分析表明，這些抗菌肽N端結(jié)構(gòu)域?yàn)橥茴惼つw活性肽結(jié)構(gòu)域 FSAP_sig_propep。蛙類皮膚活性肽(Frog skin active peptide，F(xiàn)SAP) 家族成員在N端存在結(jié)構(gòu)域FSAP_sig_propep (pfam03032)，該結(jié)構(gòu)域位于FSAP前體的N末端，包含信號(hào)肽和前肽，但不包含肽的活性部分，該結(jié)構(gòu)域 N末端較為保守，1?8位一致性氨基酸保守序列為MFTLKKSL。去除抗菌肽前體序列的 FSAP_sig_propep結(jié)構(gòu)域片段，即可獲得抗菌肽的成熟活性抗菌肽片段，如圖 2B所示，Spinosan-C抗菌肽的成熟肽為SGEKRDLSMMRKAGSNIVCGLNGLC，長(zhǎng)度為25 aa。

圖1 棘胸蛙抗菌肽Spinosan-C基因的序列分析Fig. 1 Sequence analysis of Spinosan-C gene from Paaspinosa. (A) Open reading frame and deduced amino acid sequence of Spinosan-C gene. (B) Multi-alignment of Spinosan-C precursor and its homologs. Temporin-H, Parkerin,Japonicin-1Npa and Japonicin-1NPb are from Nanoranaparkeri, and Pleskein-1, Pleskein-2 and Pleskein-3 are from Nanoranapleskei. The N terminal region is the frog active peptide conserved domain FSAP_sig_propep, containing Signal peptide domain and Propeptide domain. The C terminal region contains the mature antimicrobial peptide.

2.2 棘胸蛙抗菌肽 Spinosan-C的串聯(lián)表達(dá)與純化

2.2.1 Spinosan-C基因8倍串聯(lián)片段的設(shè)計(jì)

根據(jù)上述分析獲得的Spinosan-C成熟肽氨基酸序列，采用串聯(lián)表達(dá)的方法進(jìn)行抗菌肽的原核表達(dá)。去掉信號(hào)肽和前肽序列后，編碼Spinosan-C成熟肽的核酸序列為：5?-AGCGGAGAGAAA AGAGACTTGTCGATGATGAGGAAAGCGGGATC AAATATAGTGTGTGGACTAAATGGGTTGTGT)-3?。為了提高原核表達(dá)效率，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性設(shè)計(jì)的編碼序列變?yōu)椋?5?-AGCGGAGAGAA ACGUGACTTGTCAATGATGCGUAAAGCGGGA TCAAATATCGTGTGTGGACTGAATGGGTTGTG T-3?)。設(shè)計(jì)框架為：EcoR Ⅰ+phoA+8×(甲酸位點(diǎn)+抗菌肽)+Hind Ⅲ位點(diǎn)，即在5?和3?末端分別引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn) (5?-GAATTC-3?) 和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn) (5?-AAGCTT-3?)，串聯(lián)的抗菌肽單體之間插入蛋白甲酸切割位點(diǎn) (5?-GACCG-3?)，同時(shí)還加入了導(dǎo)肽 phoA(5?-ATGAAACAAAGCACTATTGC ACTGGCACTCTTATCGTTACTGTTTACCCCTG TGACAAAAGCC-3?)。

2.2.2 Spinosan-C抗菌肽的串聯(lián)表達(dá)與純化

將設(shè)計(jì)的8×Spinosan-C基因合成后克隆至大腸桿菌原核表達(dá)載體 pET-28a，構(gòu)建抗菌肽的重組串聯(lián)表達(dá)載體 pET-28a-8×Spinosan-C。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切獲得一條大小為750 bp左右的條帶 (圖2)，和理論大小一致 (726 bp)，雙酶切鑒定的重組載體進(jìn)一步測(cè)序鑒定，序列也和理論一致。表明已成功構(gòu)建了表達(dá)8×Spinosan-C串聯(lián)基因的原核表達(dá)載體，可用于后續(xù)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

測(cè)序鑒定正確的重組菌通過(guò) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(圖 3)，與陰性對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，IPTG誘導(dǎo)的重組菌在28 kDa左右有明顯的特異性條帶，與理論分子量一致(phoA+8倍串聯(lián)抗菌肽分子量大小為25.2 kDa，HIS標(biāo)簽約3 kDa，共28.2 kDa)，表明融合蛋白已經(jīng)得到高效表達(dá)，并且8×Spinosan-C在包涵體中的含量比上清液中高 (圖 3A)。利用鎳柱親和層析對(duì)包涵體中目的蛋白進(jìn)行純化失敗后改用割膠方法純化目的蛋白獲得成功 (圖3B)。

圖 2 重組串聯(lián)表達(dá)載體 pET-28a-8×Spinosan-C 的PCR鑒定和酶切鑒定Fig. 2 Identification of the recombinant expression vector pET-28a-8×Spinosan-C by PCR and double restriction enzyme. M: DL2000 marker; 1: identification by PCR; 2: identification by double restriction enzyme.

圖3 抗菌肽串聯(lián)重組蛋白8×Spinosan-C的表達(dá)與純化Fig. 3 Expression and purification of tandem recombinant protein 8×Spinosan-C. (A) Expression of 8×Spinosan-C. M: protein molecular marker; 1:Escherichia coli Rosetta before inducing; 2: Escherichia coli Rosetta after inducing; 3: recombinant bacteria after inducing; 4: recombinant bacteria before induced; 5:precipitation of recombinant bacteria after ultrasonic disruption; 6: the washing solution of recombinant inclusion body. (B) Purification of tandem recombinant protein 8×Spinosan-C.

2.2.3 串聯(lián)抗菌肽8×Spinosan-C的甲酸切割

純化后的重組蛋白采用 40%的甲酸切割獲得Spinosan-C抗菌肽單體，經(jīng)Trisin-SDS-PAGE分析(圖4)，切割出的抗菌肽單體大小在10 kDa左右，與理論分子量相比偏大 (理論分子量大小為3.3 kDa)，這可能與該抗菌肽的偏堿性 (pI 8.88)有關(guān)，但切割的抗菌肽單體和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品相比，分子量大小一致，表明已成功切割獲得Spinosan-C抗菌肽單體。

2.2.4 Spinosan-C切割單體樣品的抑菌效果檢測(cè)

利用杯蝶法檢測(cè)切割Spinosan-C單體的抑菌效果，以氨芐青霉素作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果顯示，根據(jù)抑菌圈的透明程度和抑菌圈大小來(lái)看，不論是化學(xué)合成的Spinosan-C單體，還是本實(shí)驗(yàn)制備的Spinosan-C單體，均對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸標(biāo)桿菌的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用 (圖 5A，5B)，可見，通過(guò)串聯(lián)表達(dá)后切割獲得Spinosan-C抗菌肽的方法是可行的。

3 討論

抗菌肽是兩棲類動(dòng)物抵御有害病原體入侵的第一道防線[9-11]，兩棲類動(dòng)物皮膚抗菌肽大多是堿性多肽，容易與酸性生物膜的層狀排列脂類雙分子層相結(jié)合，依靠?jī)捎H的α-螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)形成跨膜的離子通道，在不損傷正常細(xì)胞的前提下對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒和癌細(xì)胞有抑殺作用[12-13]，而且在低濃度條件下仍具有較強(qiáng)的活性，具備很大的開發(fā)利用潛力[14]。由于天然抗菌肽資源有限，分離純化工藝復(fù)雜且具有細(xì)胞毒性、半衰期短、抗菌譜過(guò)寬和對(duì)蛋白酶敏感等方面的缺陷[15]，難以滿足進(jìn)一步研究和應(yīng)用的需要，而采用化學(xué)方法合成多肽的步驟復(fù)雜，一時(shí)難以有效降低成本，致使目前可應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的產(chǎn)品比較少。但隨著抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能的破譯以及基因工程等批量生產(chǎn)手段的出現(xiàn)，因其操作簡(jiǎn)便、生產(chǎn)成本較低等特點(diǎn)，非常適用于未來(lái)的規(guī)?；a(chǎn)，有望使抗菌肽成為防治水產(chǎn)養(yǎng)殖主要病害的新型藥物[16-17]。

圖 4 Tricine-SDS-PAGE檢測(cè) 8×Spinosan-C 的化學(xué)切割Fig. 4 Chemical cleavage of 8×Spinosan-C tandem recombinant proteindetected by Tricine-SDS-PAGE. M:protein molecular marker; 1: Spinosan-C monomer; 2:Spinosan-C standard sample by chemical synthesis.

圖5 Spinosan-C單體的抑菌效果檢測(cè)Fig. 5 The bacteriostatic efficacy of Spinosan-C monomer. (A) Bacteriostatic test on Bacillus subtilis. (B)Bacteriostatic test on Escherichia coli. 1: ampicillin; 2: positive controlmoricin; 3: Spinosan-C standard sample by chemical synthesis; 4: prepared Spinosan-C monomer; 5: negative control PBS.

利用基因工程方法表達(dá)抗菌肽已在酵母、昆蟲、大腸桿菌等多種異源宿主中獲得成功[18]。目前，大腸桿菌是應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)，雖然該系統(tǒng)的翻譯后加工修飾體系、表達(dá)產(chǎn)物的生物活性不及酵母表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，但對(duì)于抗菌肽這種小分子量的短肽，通常不需要過(guò)多的翻譯后加工修飾，非常適合能在短時(shí)間內(nèi)高水平表達(dá)、發(fā)酵條件易于掌控和表達(dá)成本低的大腸桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)[19-21]。本研究以前期從棘胸蛙皮膚中克隆到的抗菌肽 Spinosan-C為研究對(duì)象[8]，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中通過(guò)串聯(lián)方式獲得了抗菌肽的高效表達(dá)，對(duì)純化的串聯(lián)重組蛋白8×Spinosan-C進(jìn)行甲酸切割后得到純度較高的Spinosan-C抗菌肽單體。該方法成功解決抗菌肽易被蛋白酶降解及對(duì)宿主大腸桿菌的殺傷作用[22]，進(jìn)一步提高了大腸桿菌系統(tǒng)的表達(dá)能力，且在家蠶moricin抗菌肽的表達(dá)中也得到驗(yàn)證[23]，可靠性強(qiáng)，有望為抗菌肽的規(guī)?；苽浜蛻?yīng)用提供可能。

抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，所制備的抗菌肽Spinosan-C對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌的生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用，但其抑菌能力離應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐還有一定差距，需要在后續(xù)的研究中進(jìn)一步通過(guò)改變氨基酸序列、變換輔助基團(tuán)等方法對(duì)該抗菌肽進(jìn)行分子設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)改造，以提高其抗菌能力[24-28]。

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