慢病毒介導(dǎo)CD36基因沉默細(xì)胞株的構(gòu)建及其對(duì)caveolin-1蛋白表達(dá)的影響

李敬達(dá)，余承潔，王仁軍，付常振，修志龍，劉慶平

1 大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024

2 大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 遼寧省糖脂代謝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600

近年來，動(dòng)脈粥樣硬化 (Atherosclerosis，AS)所引發(fā)的心腦血管疾病已成為導(dǎo)致人類死亡的主要原因[1-2]。脂類代謝紊亂與慢性炎癥反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程中的重要因素[1,3-4]，與其相關(guān)的主要事件包括：血管內(nèi)皮損傷、單核細(xì)胞浸潤(rùn)入內(nèi)皮下轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞、泡沫細(xì)胞的形成、脂質(zhì)沉積、血小板激活、平滑肌細(xì)胞遷移與增生等[2]，其中獨(dú)立致病因子氧化低密度脂蛋白 (Oxidized low density lipoprotein，oxLDL) 所誘發(fā)的巨噬細(xì)胞泡沫化在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了核心作用[3-7]。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的起始階段，單核細(xì)胞趨化而來的巨噬細(xì)胞能夠通過其細(xì)胞膜表面的清道夫受體CD36、SR-AI等，大量吞噬血管內(nèi)膜空間中的oxLDL，并以膽固醇酯的形式存儲(chǔ)于細(xì)胞中。隨著動(dòng)脈粥樣硬化環(huán)境的加深，巨噬細(xì)胞攝取膽固醇的速度逐漸加快，進(jìn)而引起膽固醇在細(xì)胞中的過度積累，最終導(dǎo)致了巨噬細(xì)胞的泡沫化和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[3-7]。

CD36作為巨噬細(xì)胞表面的主要清道夫受體，介導(dǎo)了約70%的oxLDL攝取作用[3-6]。研究顯示，CD36能夠特異性識(shí)別并結(jié)合oxLDL，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的MAPK (Mitogen-activated protein kinase) 信號(hào)傳導(dǎo)，激活JNK、ERK、p38蛋白激酶活性，導(dǎo)致膽固醇過量吞噬攝取以及泡沫細(xì)胞的形成[7-9]。此外，在oxLDL的作用下，CD36還可經(jīng)由蛋白激酶C (Protein kinase C，PKC) 活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)腫瘤壞死因子及白介素-6等炎癥因子的表達(dá)及釋放，最終引發(fā)血管炎癥反應(yīng)并加速了動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[10-13]。

Caveolin-1作為組成脂筏結(jié)構(gòu)的主要蛋白，密切參與了膽固醇的攝取及細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸作用[14-18]。之前的研究結(jié)果表明，在 caveolin-1基因敲除小鼠中，CD36的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，并且停留于細(xì)胞內(nèi)高爾基復(fù)合體中，不能定向作用于細(xì)胞膜，暗示caveolin-1的表達(dá)可能是CD36到達(dá)膜表面發(fā)揮攝取功能所必需的因素[19–20]。為了進(jìn)一步研究CD36在巨噬細(xì)胞泡沫化過程中的作用及其與caveolin-1的關(guān)系，本文以小鼠巨噬細(xì)胞 J774A.1為研究對(duì)象，通過慢病毒介導(dǎo)的 shRNA干擾技術(shù)構(gòu)建了穩(wěn)定的CD36基因沉默細(xì)胞株，并以此為模型分析了CD36在caveolin-1蛋白表達(dá)過程中的作用，為后續(xù)研究 CD36功能及巨噬細(xì)胞泡沫化的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

小鼠巨噬細(xì)胞 (J774A.1) 和人胚腎細(xì)胞(HEK293T，后文簡(jiǎn)稱 293T) 購(gòu)于美國(guó)組織培養(yǎng)中心；Anti-CD36 (sc-9154) 抗體購(gòu)于美國(guó)圣克魯斯公司；Anti-caveolin-1 (610407) 抗體購(gòu)于 BD生物公司；Anti-ERK1/2(A0229)、Anti-p-ERK1/2(AP0472)、Anti-JNK (A0288) 抗體購(gòu)于ABclonal公司；Anti-β-actin (ab8226)、Anti-p-JNK (ab124956)購(gòu)于 Abcam公司；人源 LDL、DiI-oxLDL及DiI-LDL購(gòu)于北京協(xié)生生物科技有限公司；FITC及HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)于KPL公司；ERK(PD98059) 及JNK (SP600125) 生物學(xué)抑制劑購(gòu)于Calbiochem 公司；psiCHECK?-Ⅱ質(zhì)粒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒及退火緩沖液購(gòu)于Promega公司；pLKO.1慢病毒shRNA表達(dá)載體、慢病毒包裝載體 psPAX2及 PMD2.G購(gòu)于Addgene公司，Lipofectamin 2000、DMEM medium及Opti-MEM medium購(gòu)于Invitrogen公司；RIPA細(xì)胞裂解液、蛋白預(yù)染marker、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒及 ECL顯色液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；JM109克隆菌，pMD 19-T simple vector，LATaq酶，DNA連接試劑盒，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NotⅠ、BamHⅠ，DNA marker DL 2000，DNA凝膠回收試劑盒，RT-PCR試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；超濾管、PVDF薄膜、Amp抗生素及常用試劑均購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；PCR引物合成及DNA測(cè)序由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠源CD36的cDNA基因克隆

根據(jù)GenBank提供的小鼠源CD36的cDNA序列，利用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。

上游引物 (引物 1)：5′-CCGCTCGAG ATGG GCTGTGATCGGAACTG-3′。

下游引物 (引物 2)：5′-ATAGTTTAGCGGCC GCGCCAGTGTATATGTAGGCTCATCC-3′。

其中引物 1中 5′端含有保護(hù)堿基 (斜體)、XhoⅠ酶切位點(diǎn) (下劃線) 以及CD36 5′端部分氨基酸編碼基因序列；引物2中5′端含有保護(hù)堿基(斜體)、NotⅠ酶切位點(diǎn) (下劃線) 以及 CD36 3′端部分氨基酸編碼基因的互補(bǔ)序列。

使用Trizol抽提法提取J774A.1細(xì)胞中的總RNA，之后通過RT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此為模板，使用引物1、2對(duì)CD36的cDNA基因序列進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 1 min；98 ℃變性 10 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后再由凝膠回收試劑盒回收目的基因，并連接至pMD19-T simple vector中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)菌，涂布于含有 Ampicillin (50 μg/mL)抗性的LB平板，獲得的菌落進(jìn)行PCR鑒定，并挑選陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank提供的小鼠CD36的cDNA序列比對(duì)，鑒定序列正確后將重組質(zhì)粒命名為pMD19-T-CD36。

1.2.2 psiCHECK-II-CD36重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將含有pMD19-T-CD36及psiCHECK?-Ⅱ質(zhì)粒的 JM109克隆菌分別擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行質(zhì)粒提取，用XhoⅠ、NotⅠ對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。切膠回收酶切產(chǎn)物CD36片段和psiCHECK?-Ⅱ載體片段。使用DNA連接試劑盒將二者按照1∶10的摩爾比，16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入 JM109感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后挑選陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，使用XhoⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定連接情況，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為psiCHECK-Ⅱ-CD36。

1.2.3 CD36-shRNA序列設(shè)計(jì)及慢病毒干擾載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中小鼠CD36基因編碼序列 (登錄號(hào)：NM 001159558)，按照RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則使用Invitrogen公司在線shRNA序列分析設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì) 5對(duì)針對(duì)目的基因的shRNA干擾序列及一對(duì)Scramble shRNA對(duì)照序列 (表 1)。之后通過 BLAST同源性搜索分析，確定干擾序列及對(duì)照序列的特異性，所設(shè)計(jì)的序列由生工生物工程 (上海) 股份有限公司負(fù)責(zé)合成。每對(duì)合成的互補(bǔ) shRNA序列溶于退火緩沖液中，沸水浴5 min后自然冷卻到室溫。之后通過DNA連接試劑盒將退火處理后帶有黏性末端的雙鏈干擾序列與經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的線性化pLKO.1慢病毒載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109，挑選陽性克隆，進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序正確后根據(jù)干擾序列靶向位點(diǎn)將重組干擾載體分別命名為 355-shRNA、393-shRNA、992-shRNA、1 325-shRNA、1 329-shRNA及scramble-shRNA。

表1 CD36的shRNA干擾序列設(shè)計(jì)Table 1 The design of shRNA sequences for CD36 gene

1.2.4 有效CD36-shRNA序列的篩選

293T細(xì)胞37 ℃、5% CO2條件下貼壁培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染前24 h，將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的293T細(xì)胞以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中。培養(yǎng)過夜后，待細(xì)胞生長(zhǎng)至 80%?90%融合度時(shí)，將 5種干擾質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒 (Scramble-shRNA) 分別與 psiCHECK-Ⅱ-CD36質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入 293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染操作方法參照 Lipofectamin 2000 transfection rengent 使用說明書。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒及多功能酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞裂解液中化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。以單獨(dú)轉(zhuǎn)染psiCHECK-Ⅱ-CD36質(zhì)粒作為陰性對(duì)照并規(guī)定干擾效率為零，計(jì)算其他shRNA的干擾效率。

1.2.5 慢病毒的包裝與純化

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜后，待細(xì)胞融合度為 80%?90%時(shí)，參照 Lipofectamin 2000 transfection rengent使用說明書將篩選得到的干擾載體及對(duì)照載體 (Scramble-shRNA) 分別與輔助包裝載體psPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染 48 h后，離心收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液。上清液經(jīng) 0.45 μm 濾膜過濾去除細(xì)胞碎片后，使用 100K孔徑的超濾管，4 000 r/min離心30 min對(duì)毒液進(jìn)行濃縮。病毒濃縮液分裝至EP管中，–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 慢病毒感染及CD36穩(wěn)定沉默細(xì)胞株的建立

J774A.1細(xì)胞37 ℃、5% CO2條件下貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中 (另外含有100 IU/mL的青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素10 mmol/L碳酸氫鈉和1 mmol/L丙酮酸鈉)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的J774A.1細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中。培養(yǎng)24 h后，棄去孔中原有培養(yǎng)基，向孔中加入1 mL含有溴化己二甲胺 (終濃度8 μg/mL)的培養(yǎng)基及100 μL CD36- shRNA病毒濃縮液 (對(duì)照細(xì)胞組中加入scramble-shRNA病毒濃縮液)。由于所選用的pLKO.1慢病毒干擾載體的骨架中含有嘌呤霉素抗性基因 (載體基因圖譜如圖2所示)，因此病毒感染 12 h后，各孔更換為含有嘌呤霉素抗性(終濃度 3 μg/mL) 的培養(yǎng)基對(duì)被感染細(xì)胞進(jìn)行篩選。此后每隔1 d更換嘌呤霉素抗性培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至 80%–90%融合度時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)瓶中，并使用嘌呤霉素抗性培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)。嘌呤霉素篩選30 d后，采用Western blotting及激光共聚焦顯微鏡對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中CD36基因沉默效果進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 Western blotting分析CD36基因沉默效果

使用RIPA裂解液分別提取三組細(xì)胞 (NCr: 野生型J774A.1細(xì)胞組；shRNACD36: CD36-shRNA慢病毒感染細(xì)胞組；SCr: Scramble-shRNA慢病毒感染細(xì)胞組) 的全蛋白，并用 BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組樣品中總蛋白濃度。以每孔80 μg的蛋白量上樣，12% SDS-PAGE膠對(duì)樣品進(jìn)行電泳分離。轉(zhuǎn)膜、封閉后，抗CD36抗體 (1∶1 000) 4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，之后室溫條件下孵育山羊抗兔的二抗稀釋液(1∶1 000) 1 h。TBST洗膜后，ECL顯色，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分析檢測(cè)結(jié)果。

1.2.8 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞膜表面 CD36基因沉默效果

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 3組細(xì)胞 (野生型J774A.1細(xì)胞組、CD36-shRNA慢病毒感染細(xì)胞組、Scramble-shRNA慢病毒感染細(xì)胞組) 分別以每皿 2.5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于激光共聚焦小皿中。培養(yǎng)過夜后，棄去原有培養(yǎng)基，向小皿中央加入200 μL含有DiI-oxLDL或DiI-LDL (終濃度為 20 μg/mL) 的新鮮培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h。PBS清洗細(xì)胞3次后，使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，并用1% gelatin與抗CD16/CD32抗體 (1∶100) 的混合液封閉細(xì)胞1 h。PBS洗3次后，加入抗 CD36抗體 (1∶100)。37 ℃孵育2 h后，使用FITC標(biāo)記的抗兔二抗 (1∶100)，37 ℃條件下孵育細(xì)胞1 h。孵育結(jié)束后PBS洗去非特異性結(jié)合的二抗，最后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.9 JNK與EKR的特異性抑制劑對(duì)caveolin-1蛋白表達(dá)的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的J774A.1細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度接種于六孔板。過夜培養(yǎng)后，使用JNK或EKR 的特異性抑制劑 SP600125 (10 μmol/L)、PD98059 (10 μmol/L) 預(yù)處理細(xì)胞 30 min，之后更換含有oxLDL (終濃度為30 μg/mL) 的新鮮培養(yǎng)基刺激細(xì)胞 12 h。Western blotting檢測(cè)抑制劑對(duì)caveolin-1蛋白表達(dá)的影響情況。

1.2.10 Western blotting檢測(cè)CD36基因沉默對(duì)caveolin-1蛋白表達(dá)的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞 (野生型J774A.1細(xì)胞組、CD36-shRNA慢病毒感染細(xì)胞組、Scramble-shRNA慢病毒感染細(xì)胞組)，以1×106個(gè)/孔的密度接種于六孔板。過夜培養(yǎng)后，將各孔中原有培養(yǎng)基更換為含有相應(yīng)濃度 oxLDL的培養(yǎng)基，進(jìn)行給藥刺激處理 (oxLDL濃度及刺激時(shí)間如結(jié)果圖中所示)。待刺激處理結(jié)束后消化收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，之后對(duì)樣品進(jìn)行 Western blotting檢測(cè)分析。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均來自至少3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差 (SE)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)兩組間比較均經(jīng)Student’s-test檢驗(yàn)，**P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠源 CD36的 cDNA基因克隆及psiCHECK-II-CD36重組表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增得到CD36的cDNA基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，其條帶大小與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中一致 (圖 1A)。將 PCR產(chǎn)物回收后連接于pMD19-T simple vector，并送交生工生物工程 (上海) 股份有限公司測(cè)序，使用Sequencher軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示目的片段無突變。

將構(gòu)建成功的 pMD19-T-CD36載體及psiCHECK-Ⅱ載體分別進(jìn)行XhoⅠ、NotⅠ雙酶切，之后將目的基因片段連接至載體酶切片段并轉(zhuǎn)化入JM109克隆菌中，涂布于Ampicillin抗性平板。挑選平板上陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取重組質(zhì)粒進(jìn)行XhoⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)酶切片段大小與預(yù)期一致 (圖1B)，證明 CD36的 cDNA基因片段已克隆至psiCHECK-Ⅱ載體中，獲得 psiCHECK-II-CD36重組表達(dá)載體。

圖1 psiCHECK-II-CD36載體的構(gòu)建Fig. 1 Construction of psiCHECK-II-CD36 vector. (A)Analysis of PCR product of CD36 by agarose gel electrophoresis. M: DL2000 marker; 1: PCR product of CD36 (1 419 bp). (B) Analysis of psiCHECK-II-CD36 vector by restriction enzyme digestion. M: DL2000 marker; 1: psiCHECK-II-CD36 plasmid; 2: digestion of psiCHECK-II-CD36 plasmid by XhoⅠ; 3: digestion of psiCHECK-II-CD36 plasmid by XhoⅠ and NotⅠ.

2.2 CD36-shRNA慢病毒干擾載體的構(gòu)建

將設(shè)計(jì)合成的干擾序列及對(duì)照序列進(jìn)行退火處理，所形成的雙鏈 DNA片段連接至含有嘌呤霉素抗性的 pLKO.1載體中 (圖 2)，并轉(zhuǎn)化入JM109菌株。挑取陽性克隆菌送至生工生物工程(上海) 股份有限公司測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果 (略)顯示插入序列無堿基突變，證明CD36-shRNA慢病毒干擾載體構(gòu)建成功。

2.3 有效CD36-shRNA序列的篩選

由于 J774A.1細(xì)胞為難轉(zhuǎn)染型細(xì)胞，因此很難通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法篩選獲得有效shRNA。為此，本文使用Promega公司的siCHECKTM系統(tǒng)對(duì)shRNA進(jìn)行篩選。該系統(tǒng)的篩選原理是：psiCHECKTM-Ⅱ載體同時(shí)含有螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶報(bào)告基因，當(dāng)目的基因插入到海腎熒光素酶基因下游多克隆位點(diǎn)時(shí)，能夠形成海腎熒光素酶基因與目的基因的融合序列。將含有目的基因的 psiCHECKTM-Ⅱ重組載體與 shRNA干擾載體共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞后，螢火蟲熒光素酶基因及融合序列得以轉(zhuǎn)錄。如果設(shè)計(jì)的shRNA為無效序列，則融合序列中海腎熒光素酶可被翻譯。如果shRNA為有效序列，則能夠啟動(dòng)干擾機(jī)制降解融合序列，導(dǎo)致融合序列中海腎熒光素酶基因無法翻譯，降低海腎熒光素酶的活性，從而達(dá)到篩選有效shRNA的目的 (有關(guān)shRNA篩選的詳細(xì)原理、方法及步驟參照Promega公司siCHECKTM vectors及 Dual-Luciferase?reporter assay system 產(chǎn)品說明書)。本文中將5條CD36-shRNA慢病毒干擾載體及對(duì)照載體分別與psiCHECK-Ⅱ-CD36質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒及多功能酶標(biāo)儀測(cè)定化學(xué)發(fā)光并計(jì)算干擾效率。結(jié)果如圖 3所示，與Blank 對(duì)照 (未經(jīng)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞) 及SCr對(duì)照 (轉(zhuǎn)染scramble-shRNA的293T細(xì)胞) 相比，1 325-shRNA干擾效果最好，CD36的mRNA表達(dá)水平降低了97%，可作為有效CD36基因沉默干擾序列。

圖2 pLKO.1載體基因圖譜Fig. 2 Map of the pLKO.1 vector.

2.4 CD36基因沉默細(xì)胞株的鑒定

使用制備好的 CD36-shRNA及 scrambleshRNA慢病毒顆粒分別感染J774A.1細(xì)胞。之后通過嘌呤霉素篩選出具有抗性的 CD36基因沉默細(xì)胞株及對(duì)照細(xì)胞株 (Scramble-shRNA)，并通過Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中CD36蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖 4A所示，與野生型 J774A.1細(xì)胞 (NCr) 及 scramble-shRNA對(duì)照細(xì)胞 (SCr)相比，CD36基因沉默細(xì)胞 (shCD36) 中CD36蛋白表達(dá)水平大幅降低。進(jìn)一步的激光共聚焦結(jié)果顯示 (圖 4B)，基因沉默細(xì)胞株細(xì)胞膜表面上的CD36 (綠色) 及結(jié)合的DiI-oxLDL (紅色) 含量較野生型J774A.1細(xì)胞及scramble- shRNA對(duì)照細(xì)胞明顯減少，并且隨著CD36的基因沉默，與CD36相結(jié)合的DiI-oxLDL (黃色) 的數(shù)量也大幅降低。上述結(jié)果表明成功構(gòu)建了具有生物學(xué)活性的CD36基因沉默巨噬細(xì)胞株。

2.5 oxLDL刺激作用對(duì) caveolin-1蛋白表達(dá)的影響

圖3 有效shRNA的篩選Fig. 3 The screening of efficient shRNA. ** P<0.01 versus the Blank control group.

圖4 CD36基因沉默效率分析Fig. 4 CD36 silencing efficiency assays. (A) The CD36 silencing efficiency assays by Western blotting (NCr: wild J774A.1 cells; SCr: scramble-shRNA infection control; shCD36: CD36-shRNA infection control, **P<0.01 versus the SCr control group). (B) The CD36 silencing efficiency assays by confocal microscopy.

Caveolin-1作為脂筏結(jié)構(gòu)中的主要蛋白，在巨噬細(xì)胞對(duì) oxLDL的攝取及細(xì)胞內(nèi)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[14-18]。研究顯示，在巨噬細(xì)胞中caveolin-1的蛋白表達(dá)受MAPK蛋白激酶家族成員 JNK及 ERK的調(diào)控[21]。本文以J774A.1巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察了oxLDL的刺激作用對(duì)巨噬細(xì)胞caveolin-1蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果如圖 5A–B所示，在不同濃度及不同時(shí)間的oxLDL刺激下，J774A.1巨噬細(xì)胞中 caveolin-1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，且上調(diào)作用呈濃度及作用時(shí)間依賴性。當(dāng)使用30 μg/mL oxLDL刺激細(xì)胞12 h后，caveolin-1的蛋白表達(dá)水平達(dá)到頂峰，較未刺激組升高3.25倍 (**P<0.01)。此外，oxLDL的刺激作用能夠明顯上調(diào)蛋白激酶JNK及ERK的磷酸化水平 (圖 6A)。進(jìn)一步的抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用SP600125 (JNK) 與PD98059 (ERK) 抑制劑預(yù)處理 J774A.1細(xì)胞能夠顯著抑制 oxLDL誘導(dǎo)的caveolin-1蛋白表達(dá)上調(diào)作用 (圖6B)。與對(duì)照組相比，SP600125組、PD98059組及聯(lián)合處理組的caveolin-1蛋白表達(dá)分別下調(diào)了60%、45%和70% (**P<0.01)。以上結(jié)果表明oxLDL能夠通過JNK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)上調(diào)caveolin-1的表達(dá)。

2.6 CD36基因沉默對(duì)caveolin-1蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步研究CD36基因沉默對(duì)caveolin-1蛋白表達(dá)的影響，我們使用30 μg/mL oxLDL分別刺激野生型J774A.1細(xì)胞 (NCr)、scramble-shRNA對(duì)照細(xì)胞 (SCr) 及 CD36沉默細(xì)胞 (shCD36)12 h。Western blotting 結(jié)果顯示 (圖 7A)，CD36的基因沉默能夠顯著性抑制 oxLDL誘導(dǎo)的caveolin-1蛋白表達(dá)。與 NCr對(duì)照組 (野生型J774A.1細(xì)胞) 及 SCr對(duì)照組 (Scramble-shRNA感染細(xì)胞) 相比，CD36基因沉默細(xì)胞中 oxLDL誘導(dǎo)的 caveolin-1蛋白表達(dá)降低了 70%(**P<0.01)。此外，使用30 μg/mL oxLDL分別刺激處理各組細(xì)胞30 min后發(fā)現(xiàn)，CD36的基因沉默能夠明顯抑制oxLDL誘導(dǎo)的MAPK蛋白激酶JNK及ERK的磷酸化作用 (圖7B)。以上結(jié)果表明，在oxLDL的刺激作用下，CD36能夠激活巨噬細(xì)胞內(nèi)MAPK蛋白激酶JNK及ERK的磷酸化，從而上調(diào)了caveolin-1的蛋白表達(dá)。

圖5 oxLDL濃度及時(shí)間梯度作用對(duì)caveolin-1蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 The dose-dependent and time-dependent effects of oxLDL in caveolin-1 protein expression. (A) The dose-dependent effect of oxLDL in caveolin-1 protein expression. (B) The time-dependent effects of oxLDL in caveolin-1 protein expression (** P<0.01 versus the untreated group).

圖6 oxLDL經(jīng)由JNK及ERK信號(hào)通路上調(diào)caveolin-1的蛋白表達(dá)Fig. 6 oxLDL upregulate caveolin-1 protein expression through the JNK/ERK-mediated signal pathway. (A) oxLDL upregulate the phosphorylation level of JNK and ERK. (B) The effects of the inhibitors for JNK and ERK in caveolin-1 protein expression (** P<0.01 versus the untreated control group).

圖7 CD36經(jīng)由JNK/ERK信號(hào)通路調(diào)控caveolin-1的蛋白表達(dá)Fig. 7 CD36 modulates the caveolin-1 protein expression through the JNK/ERK-mediated signal pathway. (A) The effect of CD36 in the oxLDL-induced caveolin-1 protein expression. (B) The effect of CD36 in the oxLDL-induced JNK and ERK phosphorylation (NCr: wild J774A.1 cells; SCr: scramble-shRNA infection control; shCD36: CD36-shRNA infection control; Blank: the CD36-shRNA infection cell without oxLDL stimulation, **P<0.01 versus the SCr control group).

3 討論

巨噬細(xì)胞的泡沫化是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的核心環(huán)節(jié)，目前認(rèn)為巨噬細(xì)胞泡沫化的主要機(jī)制包括：膽固醇攝入過多，細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)異常、膽固醇過度堆積和膽固醇流出受阻等[4-6]。清道夫受體CD36密切參與了巨噬細(xì)胞的泡沫化過程，貢獻(xiàn)了大約60%?70%的膽固醇酯聚集[3-6]。Rahaman等的研究結(jié)果顯示，CD36能夠啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，活化蛋白激酶JNK及ERK，促進(jìn)膽固醇的攝入作用[7-8]。此外，CD36還能夠通過PKC及p38等蛋白激酶激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ (Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ) 的轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)膽固醇?；D(zhuǎn)移酶 1(Acyl-CoA:cholesterol acyltransferase 1，ACAT1)及自身的蛋白表達(dá)，加速了膽固醇的脂化及積累作用，最終導(dǎo)致巨噬細(xì)胞泡沫化的形成[1,4]。綜上所述，CD36所介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，在巨噬細(xì)胞泡沫化過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

Caveolin-1作為構(gòu)成脂筏結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵蛋白，協(xié)同參與了 CD36介導(dǎo)的膽固醇攝取過程。研究發(fā)現(xiàn)，CD36受體蛋白在細(xì)胞膜表面主要定位于由caveolin-1參與組成的胞膜窖 (Caveolea) 結(jié)構(gòu)中，而caveolin-1的基因沉默能夠顯著阻止CD36由高爾基復(fù)合體向細(xì)胞膜的運(yùn)輸作用，進(jìn)而抑制了由CD36介導(dǎo)的膽固醇攝取作用及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)的發(fā)生[20,22]。同時(shí)，在 caveolin-1基因敲除小鼠中，動(dòng)脈粥樣硬化的程度明顯減弱，表明caveolin-1的表達(dá)能夠明顯促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[19]。

巨噬細(xì)胞中 caveolin-1的蛋白表達(dá)受 MPAK蛋白激酶JNK及ERK的調(diào)節(jié)[21]，而CD36能夠調(diào)節(jié) JNK與 ERK的活性，暗示 CD36受體與caveolin-1的蛋白表達(dá)可能存在著密切的調(diào)控關(guān)系。為了進(jìn)一步研究 CD36的功能及其在調(diào)控caveolin-1蛋白表達(dá)過程中的作用，我們構(gòu)建了CD36基因沉默巨噬細(xì)胞模型。由于J774A.1巨噬細(xì)胞為難轉(zhuǎn)染型細(xì)胞，因此通過普通的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)很難獲得高效穩(wěn)定的基因沉默細(xì)胞株。鑒于慢病毒系統(tǒng)在應(yīng)用過程中的優(yōu)勢(shì)，本文選擇使用慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)進(jìn)行CD36基因沉默細(xì)胞模型的構(gòu)建。首先我們?cè)O(shè)計(jì)合成了5條針對(duì)CD36的shRNA干擾序列，并將其構(gòu)建入慢病毒干擾載體中，之后使用 Promega公司的siCHECKTM系統(tǒng)篩選得到有效的 CD36-shRNA干擾序列。將慢病毒干擾載體與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，包裝得到慢病毒顆粒。慢病毒感染 J774A.1細(xì)胞后，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定的CD36基因沉默細(xì)胞株。Western blotting檢測(cè)證實(shí)CD36基因沉默細(xì)胞株中 CD36的干擾效率可達(dá)90%，進(jìn)一步的激光共聚焦結(jié)果顯示，基因沉默細(xì)胞株表面上的 CD36含量顯著減少，并且隨著CD36的基因沉默，與之相結(jié)合的DiI-oxLDL數(shù)量也大幅降低，證明構(gòu)建得到的 CD36基因沉默巨噬細(xì)胞株具有良好的生物學(xué)活性。之后我們以此為平臺(tái)研究了CD36在caveolin-1蛋白表達(dá)過程中的作用。我們的結(jié)果顯示，CD36的基因沉默顯著降低caveolin-1上游的MAPK蛋白激酶JNK及ERK的磷酸化水平，進(jìn)而抑制了caveolin-1的蛋白表達(dá)，證明CD36能夠經(jīng)由JNK及EKR信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié) caveolin-1的蛋白表達(dá)。考慮到caveolin-1在巨噬細(xì)胞泡沫化過程中的促進(jìn)作用，結(jié)合本研究的結(jié)果，我們推測(cè) CD36作為巨噬細(xì)胞表面重要的受體分子，除能夠直接參與oxLDL的攝取作用外，還可通過啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)MAPK細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)上調(diào) caveolin-1的蛋白表達(dá)，進(jìn)一步加速細(xì)胞泡沫化的進(jìn)程。本研究首次揭示了 CD36在oxLDL誘導(dǎo)的caveolin-1蛋白表達(dá)過程中的作用，為全面了解巨噬細(xì)胞脂代謝通路以及今后以此為靶點(diǎn)研究治療動(dòng)脈粥樣硬化的策略奠定了理論基礎(chǔ)。

[1]Yu XH, Fu YC, Zhang DW, et al. Foam cells in atherosclerosis. Clin Chim Acta, 2013, 424: 45–252.

[2]Weber C, Noels H. Atherosclerosis: current pathogenesis and therapeutic options. Nat Med,2011, 17(11): 1410–1422.

[3]Collot-Teixeira S, Martin J, McDermott-Roe C, et al. CD36 and macrophages in atherosclerosis.Cardiovasc Res, 2007, 75(3): 468–477.

[4]Chistiakov DA, Bobryshev YV, Orekhov AN.Macrophage-mediated cholesterol handling in atherosclerosis. J Cell Mol Med, 2016, 20(1): 17–28.

[5]Nicholson AC, Hajjar DP. CD36, oxidized LDL and PPARγ: pathological interactions in macrophages and atherosclerosis. Vasc Pharmacol, 2004, 41(4/5):139–146.

[6]Nicholson AC. Expression of CD36 in macrophages and atherosclerosis the role of lipid regulation of PPARγ signaling. Trends Cardiovasc Med, 2004,14(1): 8–12.

[7]Rahaman SO, Lennon DJ, Febbraio M, et al. A CD36-dependent signaling cascade is necessary for macrophage foam cell formation. Cell Metab, 2006,4(3): 211–221.

[8]Li WZ, Wang D, Chi Y, et al. 7-Ketocholesteryl-9-carboxynonanoate enhances the expression of ATP-binding cassette transporter A1 via CD36.Atherosclerosis, 2013, 226(1): 102–109.

[9]Feng JW, Han JH, Pearce SFA, et al. Induction of CD36 expression by oxidized LDL and IL-4 by a common signaling pathway dependent on protein kinase C and PPAR-γ. J Lipid Res, 2000, 41(5):688–696.

[10]Park YM. CD36, a scavenger receptor implicated in atherosclerosis. Exp Mol Med, 2014, 46(6): e99.

[11]Kunz A, Abe T, Hochrainer K, et al. Nuclear factor-κB activation and postischemic inflammation are suppressed in CD36-null mice after middle cerebral artery occlusion. J Neurosci, 2008, 28(7):1649–1658.

[12]Xie CH, Ng H, Nagarajan S. OxLDL or TLR2-induced cytokine response is enhanced by oxLDL-independent novel domain on mouse CD36.Immunol Lett, 2011, 137(1/2): 15–27.

[13]Zhao M, Liu YW, Wang XF, et al. Activation of the p38 MAP kinase pathway is required for foam cell formation from macrophages exposed to oxidized LDL. APMIS Acta Pathol Microbiol Immunol Scand, 2002, 110(6): 458–468.

[14]Auriac A, Willemetz A, Canonne-Hergaux F. Lipid raft-dependent endocytosis: a new route for hepcidin-mediated regulation of ferroportin in macrophages. Haematologica, 2010, 95(8): 1269–1277.

[15]Sowa G. Caveolae, caveolins, cavins, and endothelial cell function: new insights. Front Physiol, 2012, 2: 120.

[16]Frank PG, Cheung MWC, Pavlides S, et al.Caveolin-1 and regulation of cellular cholesterol homeostasis. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006, 291(2): H677–H686.

[17]Ikonen E, Parton RG. Caveolins and cellular cholesterol balance. Traffic, 2000, 1(3): 212–217.

[18]Gargalovic P, Dory L. Caveolins and macrophage lipid metabolism. J Lipid Res, 2003, 44(1): 11–21.

[19]Frank PG, Marcel YL, Connelly MA, et al.Stabilization of caveolin-1 by cellular cholesterol and scavenger receptor class B type I. Biochemistry,2002, 41(39): 11931–11940.

[20]Frank PG, Lee H, Park DS, et al. Genetic ablation of caveolin-1 confers protection against atherosclerosis.Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004, 24(1): 98–105.

[21]Wu CC, Wang SH, Kuan II, et al. OxLDL upregulates caveolin-1 expression in macrophages:role for caveolin-1 in the adhesion of oxLDL-treated macrophages to endothelium. J Cell Biochem, 2009,107(3): 460–472.

[22]Eyre NS, Cleland LG, Tandon NN, et al. Importance of the carboxyl terminus of FAT/CD36 for plasma membrane localization and function in long-chain fatty acid uptake. J Lipid Res, 2007, 48(3):528–542.