菌株Chitinophaga sp.CH-1阿拉伯糖苷酶Ara1805基因克隆與表達(dá)

趙曉艷，朱慶圣，朱 紅,2，鄢江月，吳曉玉，陳金印，王 飛，*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045；3.江西省果蔬保鮮與質(zhì)量安全創(chuàng)新中心，江西 南昌 330045)

半纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，也是地球上最豐富、最廉價的可再生資源之一，其利用價值逐漸受到人們的重視[1]。半纖維素主要是由L-阿拉伯糖和D-木糖構(gòu)成，L-阿拉伯糖殘基以單體或低聚體側(cè)枝以α-1,3或α-1,2鍵連在木糖的主鏈上[2]。半纖維素的完全降解需要多種酶的協(xié)同作用，包括β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶(Endo-β-1,4-xylanase,EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(β-1,4-xylosidase,EC3.2.1.37)、α-L-阿拉伯糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase，EC 3.2.1.55)、α-D-葡萄糖醛酸酶(α-D-glucuronidase，EC 3.2.1.139) 等[3-4]。半纖維素可作為微生物的碳源，經(jīng)分解利用可生產(chǎn)酶制劑、生物燃料、次生代謝產(chǎn)物等產(chǎn)品[5-6]。阿拉伯糖苷酶、α-D-葡萄糖醛酸酶參與半纖維素的降解過程對于低聚木糖的生產(chǎn)、廢物的生物轉(zhuǎn)化，以及食品或飼料養(yǎng)份的提高起著非常重要的作用[7]。

噬幾丁質(zhì)細(xì)菌是一類細(xì)胞細(xì)長、可以滑動并形成粘孢子的土壤細(xì)菌，因具有較強(qiáng)的幾丁質(zhì)酶活性而得名。之前歸屬于粘細(xì)菌[8]，現(xiàn)代分類學(xué)將之界定為擬桿菌門、鞘氨醇桿菌綱、鞘氨醇桿菌目、噬幾丁質(zhì)菌科、噬幾丁質(zhì)菌屬[9]。目前國內(nèi)外學(xué)者對該屬細(xì)菌的研究工作大多集中在菌株分離和鑒定上，對其功能的研究較少。前期研究中課題組分離到一株Chitinophagasp.CH-1，通過基因組草圖掃描，發(fā)現(xiàn)其中存在一個α-L-阿拉伯糖苷酶編碼序列ara1805。本文以Chitinophagasp.CH-1基因組為材料，對ara1805基因進(jìn)行克隆和重組表達(dá)，以期為開發(fā)新的阿拉伯糖苷酶資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：Chitinophagasp.CH-1，E.coliDH、E.coliBL21(DE3)均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

CaCl2，NaOH，Tris，HCl，EDTA，SDS，Tris-平衡酚，胰蛋白胨，酵母提取物，NaCl，氯仿，異戊醇，乙醇，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，所有試劑均為分析純?？捡R斯亮藍(lán)G250，牛血清蛋白，溶菌酶，蛋白酶K，IPTG，X-gal，氨芐青霉素(Amp)，卡那霉素(Km)，對硝基苯-阿拉伯呋喃糖苷購于上海生工。NdeI、XhoI限制性核酸內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA ligase、pMD19-T載體等購于TaKaRa(大連)有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒購于索萊寶科技有限公司(北京)。引物合成及核酸測序委托上海祥音生物科技有限公司。

LB培養(yǎng)基：酵母粉 5.0 g/L，胰蛋白胨 10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0～7.2。

1.2 儀器

PCR擴(kuò)增儀(BiometreT1)、Beckman臺式高速冷凍離心機(jī)(Allegra X-22R)、DYCP-31C水平核酸電泳儀等。

1.3 ara1805基因PCR擴(kuò)增

高鹽法[10]提取菌株Chitinophagasp.CH-1總DNA，以Chitinophagasp.CH-1總DNA作模板，設(shè)計(jì)引物Ara1805-F：5′-CATATGAAACGATTTGCTCTCTAT-3′(劃線部分表示NdeI酶切位點(diǎn))和Ara1805-R：5′-CTCGAGTTTGAGCTTATCCAATATTTT-3′(劃線部分表示XhoI酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系:10×Taq聚合酶反應(yīng)緩沖液5L，dNTP(20 mmol/L)4L，引物(25 pmol/L)各1L，Mg2+(25 mmol/L)4L，Chitinophagasp.CH-1總DNA(約50 ng/L)1L，TaqDNA聚合酶(5 U/L)0.5L，滅菌雙蒸水至50L。反應(yīng)條件：95 ℃變性5 min，95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.4 pMD19-T-ara1805克隆載體構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收試劑盒回收后與pMD19-T載體相連，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，挑取陽性克隆至3mL液體LB(Amp+)，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)8 h后提質(zhì)粒電泳，NdeI/XhoI雙酶切檢測[11]。雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測是否含有正確大小的插入片段。將驗(yàn)證無誤的陽性克隆菌液送上海祥音生物科技有限公司測序，將測得的ara1805基因編碼的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastp比對，下載高同源性菌株的ara1805基因編碼的氨基酸序列，用MEGA version 5.05軟件包中的Cluster W進(jìn)行同源聚類分析。然后利用鄰接法(Neighbor-Joining)1 000次泊松校驗(yàn)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[12]。

1.5 表達(dá)菌株的構(gòu)建

提取pMD19-T-ara1805質(zhì)粒以NdeI/XhoI 于37 ℃過夜酶切，目的基因片段和pET-29a(+)質(zhì)粒的NdeI/XhoI雙酶切產(chǎn)物酶連，將酶連好的重組質(zhì)粒pET-29a(+)-ara1805轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單克隆至含Kan的3 mL液體LB試管，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)8 h，提取質(zhì)粒電泳檢測大小，NdeI/XhoI雙酶切驗(yàn)證，菌液送上海祥音生物科技有限公司測序，測序引物為位于pET29a(+)上的T7promoter和T7terminator。將測序無誤的pET-29a(+)-ara1805轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建表達(dá)菌株。

1.6 重組酶Ara1805的誘導(dǎo)表達(dá)

將表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)(pET-29a(+)-ara1805)劃線，接種單菌落于含有50 mg/mL卡那霉素(Kan)的3 mL 液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min振蕩過夜。取1 mL菌液轉(zhuǎn)接于100 mL液體LB培養(yǎng)基(含50 mg·mL-1Kan)，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6左右，加入1 mol/L IPTG 20 μL，18 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，超聲破碎后，12 000 rpm離心10 min，SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后觀察結(jié)果。取10 μL酶液測定酶活。

1.7 重組酶純化

Ni2+-NTA親和層析柱預(yù)先以兩倍柱體積的20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)平衡，將含有重組酶Ara1805的破碎液離心上清上樣至Ni2+-NTA親和層析柱，4 ℃孵育1 h，以5倍柱體積的20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)洗去雜蛋白，然后以20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0，50、100、200 mmol/L咪唑)進(jìn)行梯度洗脫，SDS-PAGE電泳，收集合并重組酶純度最高的洗脫液，4 ℃下以截留分子量10 ku的透析袋在20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)緩沖液中透析過夜去除咪唑[13]。

1.8 酶活測定

以對硝基苯-阿拉伯呋喃糖苷為底物，采用分光光度法測定該酶從底物對硝基苯-α-L-阿拉伯呋喃糖苷(pNPAF) 釋放對硝基苯酚(pNP)的量[14]。反應(yīng)體系為200 μL,內(nèi)含10 μL 20 mmol/L底物pNPAF、180 μL 50 mmol/L pH 7.0的Tris-HCl緩沖液、10 μL 粗酶液。于85 ℃反應(yīng)20 min，然后加入600 μL 1 mol/L的Na2CO3終止反應(yīng)并顯色，測定OD410，以對硝基苯酚濃度為橫坐標(biāo)，OD410為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶促反應(yīng)產(chǎn)生的對硝基苯酚的量。酶活單位定義為每分鐘產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚所需的酶量(mg)[15]。蛋白含量測定按Bradford方法進(jìn)行，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，具體操作見參考文獻(xiàn)[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pMD19-T-ara1805克隆載體構(gòu)建

以高鹽法提取菌株Chitinophagasp.CH-1總DNA，以總DNA為模板，正向引物Ara1805F和反向引物Ara1805R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。

PCR擴(kuò)增所得的ara1805基因全長900 bp左右，大小與基因組草圖中的α-L-阿拉伯糖苷酶編碼序列全長一致。將目的基因與pMD19-T載體在16 ℃下酶連16 h以上，酶連產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，藍(lán)白斑篩選單克隆，將陽性克隆接種至含100 mg/L Amp液體LB培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，提質(zhì)粒，0.75%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)，NdeI/XhoI雙酶切驗(yàn)證無誤后測序。

圖1 ara1805 基因PCR擴(kuò)增Fig.1 Agarose gel electrophoresis of fragment of ara1805by PCR

泳道1:DL5000 marker;泳道2～3:pMD19-T空載質(zhì)粒；泳道4～7:pMD19-T- ara1805質(zhì)粒。Lane 1:DL5000 marker;Lane 2～3:Plasmid of pMD19-T;Lane 4～7:Plasmid of pMD19-T-ara1805圖2 克隆載體電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of pMD19-T-ara1805

泳道1:λHindⅢ marker;泳道2～3:pET-29a(+)-ara1805;泳道4:pET-29a(+)空載質(zhì)粒。Lane 1:λHindⅢ marker;Lane 2～3:Plasmid of pET-29a(+)-ara1805;Lane 4:Plasmid of pET-29a(+)圖3 表達(dá)載體電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of pET-29a(+)-ara1805

2.2 表達(dá)載體構(gòu)建

將測序正確的質(zhì)粒pMD19-T-ara1805質(zhì)粒及pET-29a(+)質(zhì)粒以NdeI/XhoI 于37 ℃水浴過夜雙酶切，0.75%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收后以T4 ligase 16 ℃過夜酶連。酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布至含50 mg/L Kan的LB平板，37 ℃培養(yǎng)16 h，挑單菌落至3 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 mg/L Kan)，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，提質(zhì)粒，0.75%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3)。電泳檢測大小無誤的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建表達(dá)菌株。

測序結(jié)果顯示ara1805基因全長903 bp，編碼300個氨基酸。將目的蛋白氨基酸序列提交至蛋白質(zhì)分子量預(yù)測網(wǎng)站http://web.expasy.org/compute_pi/預(yù)測結(jié)果為Theoretical pI/Mw:9.12/36 ku。將Ara1805氨基酸序列在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)上以BLASTP進(jìn)行比對，與已報(bào)道的阿拉伯糖苷酶以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示Ara1805歸屬于糖苷水解酶第43家族。且來源于Chitinophaga屬和來源于Flexibacter屬的糖苷水解酶可歸為一類，而來源于Spirosoma屬、Filimonas屬、Sphingobacterium屬的阿拉伯糖苷酶可歸為另一類。

圖4 鄰接法構(gòu)建Ara1805系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Ara1805 and related arabinosidase constructed by the neighbor-joining method

在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索已報(bào)道的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，并將Ara1805氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)Ara1805中可能存在的活性中心為Asp67，Glu186和Asp236(圖5)

圖5 Ara1805與其它阿拉伯糖苷酶氨基酸序列的比較Fig.5 Comparison of amino acid sequences of different arabinosidases

泳道1:中分子量蛋白marker;泳道2:E. coli BL21(DE3)pET-29a(+)空載菌株可溶性全蛋白分析。泳道3:空載菌株粗酶液沉淀;泳道4表達(dá)菌株粗酶液可溶性全蛋白分析;泳道5:表達(dá)菌株粗酶液沉淀。Lane 1:protein marker;lane 2:total protein of E. coli BL21(DE3) harboring pET-29a(+) as control;lane 3:inclusion body protein ofE. coli BL21(DE3) harboring pET-29a(+);lane 4:total protein of recombinant strains,induced by 0.2 mmol/L IPTG;lane 5:inclusion body protein ofrecombinant strains.圖6 重組酶Ara1805純化SDS-PAGE電泳圖譜Fig.6 Analysis of the expression and purification of recombinant Ara1805

2.3 重組酶誘導(dǎo)表達(dá)

將表達(dá)菌株誘導(dǎo)表達(dá)后，菌體離心重懸，破碎離心后取上清液、溶解后的沉淀SDS-PAGE電泳，以E.coliBL21(DE3)(pET-29a)菌株誘導(dǎo)表達(dá)上清為對照，結(jié)果見圖5。SDS-PAGE電泳顯示，與對照相比，表達(dá)菌株破碎粗酶液上清及沉淀在分子量為38 ku處有一條明顯的蛋白染色條帶，說明經(jīng)0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，ara1805基因已在E.coliBL21(DE3) 中表達(dá)，并以可溶性蛋白大量存在。

根據(jù)蛋白分子量與電泳遷移率(Rf)的關(guān)系，繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)，根據(jù)待測樣品的相對遷移率，初步計(jì)算目的蛋白分子量大小為38 ku。與Ara1805在Expasy上的預(yù)測結(jié)果基本一致。

構(gòu)建表達(dá)菌株時，在重組酶Ara1805的C端加上了6個組氨酸序列(6×His tag)，可通過Ni2+-NTA親和層析對重組酶Ara1805進(jìn)行純化。表達(dá)菌株粗酶液經(jīng)含不同濃度咪唑的20 mmol/L Tris-HCl(pH7.0)緩沖液洗脫后，測定活性，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(圖7)。

圖7 目的蛋白分子量計(jì)算Fig.7 Molecular weight measurement of the Ara1805

2.4 重組酶活性測定

3 結(jié)論與討論

阿拉伯糖苷酶作為實(shí)現(xiàn)植物殘?bào)w的生物轉(zhuǎn)化所必不可少的重要酶類,在半纖維素資源開發(fā)與利用的領(lǐng)域已成為國外科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。目前，阿拉伯糖苷酶已從許多微生物如細(xì)菌Paenibacilluscurdlanolyticus、Thermotogathermarum和Clostridiumthermocellum以及真菌Penicilliumchrysogenum、Trichodermareesei和Aspergillusniger中純化和鑒定，而來源于噬幾丁質(zhì)菌屬的阿拉伯糖苷酶則很少報(bào)道[3]。

1:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2:200 mmol/L咪唑洗脫;3:100 mmol/L咪唑洗脫;4:50 mmol/L咪唑洗脫;5:粗酶液Lane 1:marker;lane 2:protein eluted with 200 mmol/L imidazole;lane 3:protein eluted with 100 mmol/L imidazole;lane 4:protein eluted with 50 mmol/L imidazole,lane 5:total protein of E. coli BL21(DE3) harboringpET-29a(+)-ara1805圖8 重組酶Ara1805純化SDS-PAGE電泳圖譜Fig.8 Analysis of the expression and purification of recombinant Ara1805

1:100 mmol/L咪唑洗脫測活；2:E. coli BL21(DE3)(pET-29a(+))菌株測活對照;3:表達(dá)菌株E. coli BL21(DE3)(pET-29a(+)- ara1805)活性檢測1:activity detection of protein eluted with 100 mM imidazole;2:E. coli BL21(DE3)(pET-29a(+) as control;3:activity detection oftotal protein of E. coli BL21(DE3) harboringpET-29a(+)-ara1805圖9 重組酶活性檢測Fig.9 pNPAF hydrolysisactivity detection of E. coli BL21(DE3)(pET-29a(+)-ara1805

R.J.Gruninger等[3]從土壤宏基因組文庫中克隆到一個具有木聚糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性的雙功能酶Bgxa1，分子量為81.7 ku，木聚糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活最適反應(yīng)條件分別為pH 6.0/45 ℃和pH 8.5/40 ℃。Priscila Innocenti Justo等[4]從Caulobactercrescentus克隆到XynB5也同時具有木聚糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性，分子量大小為95 ku。薛業(yè)敏等[17]從采用PCR 從海棲熱袍菌(Thermotogamaritima) 克隆出編碼極耐熱穩(wěn)定性阿拉伯糖苷酶基因，編碼蛋白分子量56.57 ku，阿拉伯糖苷酶活性最適作用溫度和最適作用pH分別為90～95 ℃和pH 5.0～5.5，在pH 4.2～8.2 之間酶活力穩(wěn)定，95 ℃的半衰期為4 h。彭靜靜[18]從嗜熱厭氧乙醇菌擴(kuò)增到雙活性阿拉伯/木糖苷酶(XarB)基因，并連接到新型熱激表達(dá)載體pHsh上，得到重組質(zhì)粒pHsh-xarB，并實(shí)現(xiàn)了雙功能半纖維素酶在大腸桿菌(EscherichiacoliJM109)中的高效表達(dá)。

本研究用PCR 方法從噬幾丁質(zhì)細(xì)菌Chitinophagasp.CH-1克隆出編碼阿拉伯糖苷酶的基因，與組氨酸標(biāo)簽融合，以高拷貝質(zhì)粒pET29a作為載體在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，為其應(yīng)用性研究提供便利；同時，基因表達(dá)產(chǎn)物融合了一個6個組氨酸的標(biāo)簽，可通過金屬離子親和層析柱純化，既簡化操作又減少目的蛋白的損失。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)通常也具有β-D-木糖苷酶活性，在分類上隸屬于糖苷水解酶家族43(GH43)，其活性中心由Asp/Glu-Glu-Asp組成[17,19]。在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索已報(bào)道的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，并將Ara1805氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)Ara1805中可能存在的活性中心為Asp67，Glu186和Asp236(圖5)，表明后期的蛋白質(zhì)理性設(shè)計(jì)可圍繞這幾個氨基酸殘基進(jìn)行。

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