扁桃種皮組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)觀察

張宏平，張晉元，吳國良，趙彥華

(1.山西晉城職業(yè)技術(shù)學院，山西 晉城 048026；2.河南農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，河南 鄭州 450002；3.山西農(nóng)業(yè)科學院 果樹研究所，山西 太原 030031)

扁桃(AmygdaluscummunisL.)是世界重要的干果，產(chǎn)量居四大干果之首[1-2]。扁桃食用部位為種子。種皮是種仁營養(yǎng)輸送的部位，影響著扁桃種子的質(zhì)量和產(chǎn)量。目前，系統(tǒng)研究扁桃種皮組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)尚未報道，主要集中在遺傳育種和栽培管理方面[2-3]。在種皮微觀領(lǐng)域方面，桃和核桃上有所報道[4-6]。本試驗以扁桃種皮為材料，系統(tǒng)觀察其不同時期組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的特點，達到豐富干果類種皮微觀領(lǐng)域研究；通過觀察扁桃種皮韌皮部SE/CC復合體與周圍薄壁細胞的細胞學聯(lián)系，對其糖卸載方式作出初步判斷，為提高扁桃的質(zhì)量和產(chǎn)量提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗材料取自運城萬榮縣董謀為果園。扁桃進入盛花期后，于4月初每隔10 d取材1次，直到9月中旬扁桃果實成熟。切片材料于中國農(nóng)業(yè)大學和南京農(nóng)業(yè)大學的電鏡室進行觀察。

1.2 試驗方法

1.2.1 透射電鏡樣品制備方法 透射電鏡組織包埋塊的制作方法在吳國良[5]的基礎(chǔ)上稍做改動。扁桃種皮維管束組織用雙面刀切成2～3 mm3小塊后，在4 ℃下用2.5%的戊二醛(濃度為2 mol/L的磷酸緩沖液配制，pH 7.2)固定7 h，抽氣直到切塊完全下沉。用1 mol/L的磷酸漂洗液進行漂洗，4 ℃下1%鋨酸固定過夜后，用1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次，每次15 min；4 ℃下，將材料置于體積分數(shù)為50%、70%、90%的乙醇中分別脫水20 min；純丙酮室溫過渡，分3次，每次15 min；Spurr(Dow Chemical co，USA )包埋，68 ℃下聚合8 h。修塊后，用切片機(型號LKB-8800)切成70 nm厚的小片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染法染色，電鏡觀察(型號為JEOL-1230和日立H-7650)。

1.2.2 半薄切片樣品制備方法 在透射電鏡做好包埋塊的基礎(chǔ)上，用超薄切片機(型號KLB—V)進行半薄切片，厚度0.4 μm。載玻片上滴入水滴，挑入薄片，在60 ℃溫臺上烘干，使切片很好地貼于載玻片上。用亞甲藍/天青A(pH6.9)/番紅(pH9.1)進行染色[7]，水洗去多余染料，加拿大樹膠封片，Olympus顯微鏡下進行拍照觀察。

2 觀察結(jié)果

2.1 不同時期扁桃種皮組織結(jié)構(gòu)觀察

扁桃種皮從早期到末期可明顯的分為3層結(jié)構(gòu)，在不同時期各層細胞特征變化相當明顯。在發(fā)育早期，扁桃種皮可以明顯的辨別出細胞層數(shù)，外種皮為3層細胞組成，中種皮為18～20層細胞，內(nèi)種皮由1層細長形細胞組成。扁桃外種皮細胞較小，過渡層與外種皮相鄰，細胞排列整齊，細胞體積小。中種皮細胞排列比較凌亂，細胞間隙較大，并出現(xiàn)為數(shù)不少的含酚細胞，中種皮細胞層數(shù)最多，其面積占到了整個種皮橫截面的4/5還多。維管束分布于中種皮靠近內(nèi)種皮一側(cè)，其中導管和篩管幾乎成并列排列，屬于并列維管束類型。在維管束周圍有大量的厚壁細胞存在。與扁桃種皮其他各層相比，扁桃內(nèi)種皮細胞體積巨大，排列不整齊，細胞大小懸殊，細胞內(nèi)含物較少(圖1，a)。

a.早期扁桃種皮組織結(jié)構(gòu)；b.中期扁桃種皮組織結(jié)構(gòu)；c.為b的放大圖像；d.后期扁桃種皮組織結(jié)構(gòu)；e.末期扁桃種皮組織結(jié)構(gòu)；f.為e的放大圖像。E.外種皮；T.過渡層；M.中種皮；EN.內(nèi)種皮；C.導管；ST.篩管；TC.傳遞細胞。a.The early almond seed capsule tissue structure;b.The middle almond seed capsule tissue structure;c.It is the figure b magnified image;d.The middle-last almond seed capsule tissue structure;e.The last almond seed capsuletissue structure；f.It is the e magnified image.E.Episperm;T.Transition layer;M.Mesosperm;EN.Endopleura;ST.Sieve tube;TC.Transfer cell.圖1 扁桃種皮組織結(jié)構(gòu)Fig1. The almond seed capsule tissue structure

扁桃種皮發(fā)育到中期，外種皮細胞最外層已經(jīng)木質(zhì)化成硬皮，內(nèi)部2層細胞透明化，細胞質(zhì)少，只能看到細胞核。過渡層細胞變化不明顯，只是細胞壁加厚(圖1，b)。中種皮普通薄壁細胞進一步發(fā)育，細胞質(zhì)充滿了整個細胞，細胞排列緊密，胞間隙變小(圖1，b、c)。中種皮的維管束發(fā)育完全，篩管中的伴胞染色較深，導管呈規(guī)則的圓形(圖1，b、c)。內(nèi)種皮細胞進一步增大，根據(jù)細胞特征可以分為2種類型：開始出現(xiàn)發(fā)達內(nèi)嵴的傳遞細胞和內(nèi)含很豐富的薄壁細胞，二者在體積上都進一步增大(圖1，b)。

扁桃種皮發(fā)育到后期時，外種皮細胞進一步木質(zhì)化成為一個整體，外種皮最外層細胞木質(zhì)化加重，內(nèi)部2層細胞被染成藍色。過渡層細胞也木質(zhì)化，鄰近外種皮的中種皮細胞已經(jīng)完全解體成為空腔狀，其他中種皮細胞沒有解體，細胞體積明顯縮小，細胞排列更緊湊。內(nèi)種皮的細胞變化是：出現(xiàn)的傳遞細胞內(nèi)嵴進一步發(fā)達，另一類細胞壁也有加厚的趨勢。與中期相比，中后期整個種皮的體積收縮變小，木質(zhì)化程度加重(圖1，d)。

扁桃種皮發(fā)育到末期，外種皮木質(zhì)化更加嚴重，2層木質(zhì)化的細胞染成黑色，鑲嵌在外種皮中。過渡層細胞顯著的特點是從中后期到末期融為一個整體，已經(jīng)看不出過渡層。中種皮細胞大部分解體，僅有靠近內(nèi)種皮的2層細胞存在；內(nèi)種皮普通薄壁細胞中的細胞內(nèi)含物減少，空泡化明顯，但是細胞壁次生加厚的特殊細胞已經(jīng)完全表現(xiàn)出傳遞細胞的特征(圖1，e、f)。

2.2 扁桃種皮超微結(jié)構(gòu)觀察

2.2.1 扁桃種皮薄壁細胞超微結(jié)構(gòu) 在扁桃種皮發(fā)育的早期，細胞質(zhì)濃厚，高爾基體、線粒體等大量存在，在細胞之間存在于大量的胞間連絲(圖2，a)。不同類型的囊泡在扁桃種皮早期出現(xiàn)，如規(guī)則的同心圓囊泡、邊緣加厚的同心囊泡等(圖2，a)。在扁桃種皮發(fā)育的中期，最突出的特點就是細胞中增加了大量線粒體，細胞核大而清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、各種細胞器散布在細胞質(zhì)中，細胞之間的胞間連絲較為發(fā)達(圖2，b)。在末期，扁桃細胞中的細胞器開始部分出現(xiàn)降解，線粒體也開始降解，但細胞之間的胞間連絲還很發(fā)達，扁桃外種皮細胞已完全木質(zhì)化，黑色物質(zhì)充滿了整個細胞，細胞壁木質(zhì)化，成為種子很好的保護層(圖2，c、d)。

a.早期扁桃種皮薄壁細胞；b.中期扁桃種皮薄壁細胞；c.末期扁桃種皮薄壁細胞；d.末期扁桃外種皮木質(zhì)化細胞。CW.細胞壁；M.線粒體；N.細胞核；PD.胞間連絲；Ve.囊泡；G.高爾基體；L.木質(zhì)化；BS.黑色物質(zhì)。a.The early almond seed capsule ultrastructure；b.The middle almond seed capsule ultrastructure;c.The late almond seed capsule parenchyma cells；d.The late almond seed capsule lignified cells.CW.Cell wall;M.Mitochondria;N.Nucleus;PD.Plasmodesma;Ve.Vesicles;G.Gologiosome;L.Lignification;BS.Black substance.圖2 扁桃種皮超微結(jié)構(gòu)圖版Fig.2 The almond seed capsule ultrastructure

2.2.2 扁桃種皮SE/CC復合體結(jié)構(gòu) 扁桃種皮韌皮部SE/CC復合體中，SE細胞器較少，CC中的細胞質(zhì)濃，顏色較深，擁有大量的線粒體和細胞核。2～3個比較大的囊泡存在扁桃種皮CC的細胞中，扁桃種皮中期的液泡代替了CC早期的囊泡位置(圖3，c、d、g)。在末期時，扁桃種皮SE細胞中出現(xiàn)了大量淀粉粒，SE與SE的篩孔和篩板明顯，并且篩孔未被胼胝質(zhì)堵塞(圖3，f)。扁桃種皮SE/CC復合體是典型結(jié)構(gòu)，在二者之間的胞間連絲構(gòu)造屬于常見的類型，即SE一邊為單通道結(jié)構(gòu)，CC一邊為多通道結(jié)構(gòu)(圖3，d、g)。在末期，SE/CC復合體中細胞壁變厚占據(jù)了大量的細胞間隙(圖3，h)，胞間連絲出現(xiàn)堵塞的現(xiàn)象，在扁桃種皮SE/SE細胞之間，部分胞間連絲是相通的，部分被胼胝質(zhì)堵塞(圖3，e、f)，可見SE/CC、SE/SE復合體由胞間連絲和胼胝質(zhì)共同調(diào)控物質(zhì)運輸和信息交流。

2.3 扁桃種皮維管束SE/CC復合體與周圍韌皮薄壁細胞之間的細胞學聯(lián)系

a.早期的扁桃種皮維管束；b.為a的放大圖像；c.早期的扁桃種皮SE/CC復合體；d.中期扁桃種皮SE/CC復合體；e.末期扁桃種皮維管束；f.末期扁桃種皮SE/SE；g.早期扁桃種皮SE/CC復合體縱切圖；h.末期扁桃種皮SE/CC。CC.伴胞；CW.細胞壁；M.線粒體；N.細胞核；PD.胞間連絲；PP.韌皮部周圍薄壁細胞；S.淀粉顆粒；SE.篩管；Ve.囊泡。a.The early almond seed capsule vascular bundle ultrastructure；b.It is the figure a magnified image；c.The early almond seed capsule SE / CC complex；d.The middle almond seed capsule SE/CC complex；e.The last almond seed capsule vascular bundle ultrastructure；f.The last almond seed capsule SE /SE ultrastructure；g.The early almond seed capsule SE / CC complex slippery image；h.The last almond seed capsule SE/CC complex.CC.Companion cell;CW.Cell wall;M.Mitochondria;N.Nucleus;PD.Plasmodesma；PP.Phloem parenchyma cell;S.Starch;SE.Sieve element;Ve.Vesicles.圖3 扁桃種皮維管束結(jié)構(gòu)圖版Fig.3 The almond seed capsule vascular bundle ultrastructure

在扁桃種皮SE/CC復合體與周圍薄壁細胞聯(lián)系的觀察中可看到：SE/CC復合體與韌皮部周圍薄壁細胞間存在胞間連絲，并且相當豐富，韌皮部中大量的薄壁細胞之間胞間連絲很發(fā)達(圖3，a、b、c)，故其存在密切的共質(zhì)體聯(lián)系。在扁桃果皮中同時觀察到SE和SE之間也存在胞間連絲，并分布于細胞壁加厚處(圖3，d、e、f)。在扁桃種皮后期，SE/CC扭曲折疊，細胞壁增厚，占據(jù)了大量的胞間隙，但SE/CC之間胞間連絲沒有堵塞(圖3，h)。扁桃種皮維管束中的SE/CC復合體比較典型(圖3，d、g)。在同一個SE和SE之間的有的胞間連絲相通，有的是堵塞(圖3，d、e、f)。

3 結(jié)論與討論

3.1 扁桃種皮組織結(jié)構(gòu)

扁桃種皮分為內(nèi)、中、外3層細胞，外種皮由3層細胞組成，中種皮有18～20層細胞，內(nèi)種皮由1層細胞組成。這與已報道的桃種皮不一樣，外種皮最為明顯，桃外種皮有11～13層[6]。扁桃外種皮細胞小；發(fā)育至中期，外層細胞木質(zhì)化；在末期外種皮細胞完全木質(zhì)化。中種皮由薄壁細胞和維管束組成，細胞間隙比較大；細胞層數(shù)較多，中種皮面積占到了整個種皮的4/5多，在后期中種皮解體嚴重，在末期中種皮細胞全部解體。內(nèi)種皮細胞在3層細胞中體積最大，有細胞壁特殊增厚的傳遞細胞出現(xiàn)，分布有大量的次生壁加厚明顯的傳遞細胞。與桃種皮的細胞發(fā)育特點相比，差異較大[6]。

3.2 扁桃種皮薄壁細胞超微結(jié)構(gòu)

扁桃種皮薄壁細胞發(fā)育特點與張宏平等[6]報道的相似。在扁桃種皮早期細胞質(zhì)濃，存在大量的高爾基體、線粒體和不同類型的囊泡。中期細胞核大而清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)多、各種細胞器散布在細胞中，胞間連絲發(fā)達，顯示了細胞之間物質(zhì)及能量交換活動旺盛。末期部分細胞器降解，但胞間連絲還很發(fā)達。外種皮細胞已完全木質(zhì)化，黑色物質(zhì)充滿了整個細胞，細胞壁木質(zhì)化，這種現(xiàn)象在桃種皮、核桃種皮中曾有報道[5-6]。

3.3 扁桃種皮SE/CC復合體及卸載方式

扁桃種皮SE/CC復合體之間胞間連絲在SE一側(cè)為多通道，在CC一側(cè)為單通道，如葡萄[8-9]、蘋果[10-12]、核桃[5]一樣。胞間連絲不僅是轉(zhuǎn)運有機營養(yǎng)的通道，而且也是調(diào)節(jié)物質(zhì)和信息流的通道。在核桃SE與SE之間也可以看到被胼胝質(zhì)堵塞的篩板的胞間連絲，形狀如面包[5]，在扁桃也觀察到一些SE/SE之間有胞間連絲被堵塞的現(xiàn)象。這些復雜的胞間連絲結(jié)構(gòu)上還有大量的蛋白，也包括細胞骨架的組成成份，單一的胞間連絲和分枝狀的胞間連絲在作用上有很大的不一樣[13]，近些年來已被證實[13]。所有這些SE/CC復合體、SE/SE之間的復雜胞間連絲的關(guān)系及具體作用需要進一步研究。

在扁桃種皮韌皮部薄壁細胞與SE/CC復合體之間存在發(fā)達的胞間連絲，可見共質(zhì)體系聯(lián)系密切，由此初步推斷扁桃種皮糖卸載的方式為共質(zhì)體，通過濃度梯度壓力[14-15]，擴散到扁桃胚中，提供種子所需的營養(yǎng)。另外，超微結(jié)構(gòu)觀察確定韌皮部卸載方式還是不夠的，仍需要酸性轉(zhuǎn)化酶膠體金定位和活體組織熒光示蹤試驗來驗證結(jié)果。

3.4 扁桃種皮細胞衰老方式

植物細胞衰老機制和假說主要分為6種[16]，但是在組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)水平上的變化表現(xiàn)為2種：第一類是常見的細胞軟化，即細胞壁解體，細胞膜的粘性變化[19]，細胞器降解，更進一步囊泡化和空泡化，細胞器模糊[18-19]；另外一類是細胞木質(zhì)化，包括細胞質(zhì)解體，細胞壁加厚，細胞扭曲變形，細胞被黑色致密的物質(zhì)等充滿并木質(zhì)化。以果肉為食用部位的，大部分屬于第一類細胞衰老方式，如：蘋果、葡萄、草莓、李、杏；而食用部位為種子的果實大都屬于第二類。本試驗研究的扁桃種子細胞衰老方式屬于第二類，以上結(jié)果通過本試驗組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)觀察驗證(圖1，d、f、f；圖2，c、d)。

[1] 張倩茹,尹蓉,王紅寧,等.扁桃種質(zhì)資源及其開發(fā)利用研究進展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工月刊,2016,15(8):49-51.

Zhang Q R，Yin R，Wang H N,et al.Research progress of the germplasm gesources and the exploitation and utilization of almond[J].Farm Products Processing,2016,15(8):49-51.

[2] 王琳,姜喜,李志軍.中國扁桃種質(zhì)資源研究進展[J].北方園藝,2013,37(20):178-181.

Wang L,Jiang X,Li Z J.Research progress on germplasm resources of China almond[J].Northern Horticulture,2013,37(20):178-181.

[3] 申燁華,李聰,張萍,等.扁桃研究進展[J].食品科學,2007,28(2):359-362.

Shen Y H,Li C,Zhang P,et al.Research progress in almond[J].Food Science,2007,28(2):359-362.

[4] 蘭秒,楊瑞,胡曉,等.桃種皮細胞的超微結(jié)構(gòu)觀察及生長素結(jié)合蛋白ABP1亞細胞定位[J].電子顯微學報,2016,35(1):42-48.

Lan M，Yang R，Hu X,et al.Observation of cellular ultrastructure and subcellular localization of ABP1 in seed coat of peach fruit[J].Journal of Chinese Electron Microscopy Society,2016,35(1):42-48.

[5] Wu Guoliang,Zhang Xiaoyan,Zhang Lingyun,et al.Phloem unloading in developing walnut is symplasmic in the seed pericarp and apoplasmic in the fleshy pericarp[J].Plant Cell Physiol,2004,45(10):1461-1470.

[6] 張宏平,張晉元,吳國良.桃種皮組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)觀察[J].山西農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版),2012,32(2):140-145.

Zhang H P,Zhang J Y,Wu G L.Observation on the structure and ultrastructure of peach seed coat[J].Shanxi Agric Univ Jou(Natural Science Edition),2012,32(2):140-145.

[7] 李兵,李登弟,張杰,等.植物樹脂半薄切片染色方法的改進[J].植物生理學報,2011,47(12):1207-1212.

Li B,Li D D,Zhang J,et al.Modification of resin semithin section staining method in plant tissues[J].Plant Physiology Journal,2011,47(12):1207-1212.

[8] Xia G H,Zhang D P.Intercellular symplastic connection and isolation of the unloading zone in flesh of the developing grape berry[J].Acta Botanica Sinica,2000,42(9):898-904.

[9] Yao Y,Xu G,Mou D,et al.Subcellular Mn compartation,anatomic and biochemical changes of two grape varieties in response to excess manganese[J].Chemosphere,2012,89(2):150-157.

[10] 謝紅江,陶煉,楊文淵,等.川藏高海拔不同生態(tài)區(qū)蘋果葉肉細胞葉綠體超微結(jié)構(gòu)的比較[J].果樹學報,2016,33(2):164-171.

Xie H J,Tao L,Yang W Y,et al.Comparison of chloroplast ultrastructure of ‘Golden Delicious’apple leaves in different ecological regions of high attitude areas in Sichuan-Ti-bet[J].Journal of Fruit Science,2016,33(2):164-171.

[11] Zhang D P,Lu Y M,Wang Y Z,et al.Acid invertase is predominantly localized to cell walls of both the practically symplasmically isolated element/companion cell complex and parenchyma cells in developing apple fruits[J].Plant Cell Environ,2001,24:691-702.

[12] Zhang L Y,Peng Y B,Travier S P,et al.Evidence for apoplasmic phloem unloading in developing apple fruit[J].Plant Physiology,2004,135(1):574-586.

[13] Kumar D,Kumar R,Hyun T K,et al.Plasmodesmata and phloem-based trafficking of macromolecules[J].Springer New York,2013(1):183-216.

[14] 岳勝錢，賈燕，楊秋生.植物光合同化物韌皮部卸載途徑研究進展[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2016,45(4):1-6.

Yue S Q,Jia Y,Yang Q S.Research progress on phloem unloading pathway of plant photoassimilate[J].Journal of Henan Agricultural Sciences,2016,45(4):1-6.

[15] Chen C,Yuan Y,Zhang C,et al.Sucrose phloem unloading follows an apoplastic pathway with high sucrose synthase in Actinidia fruit[J].Plant Science an International Journal of Experimental Plant Biology,2017,255:40

[16] 陳睿.植物衰老機理研究進展探討[J].綠色科技,2012,50(5):6-9.

Chen R.Advances in research on plant senescence mechanism[J].Journal of Green Science and Technology,2012,50(5):6-9.

[17] 韓英群,郭丹，魏鑫,等.果實采后軟化生理機制及調(diào)控技術(shù)研究進展[J].北方園藝,2017,41(5):30-38.

Han Y K,Guo D,Wei X，et al.Research advances on softening physiological mechanisms and its regulation in postharvest fruit[J].Northern Horticulture,2017,41(5):30-38.

[18] 李秀杰,韓真,李晨,等.根域限制對‘巨峰’葡萄果實可溶性糖含量及韌皮部超微結(jié)構(gòu)的影響[J].植物生理學報,2016,52(10):1546-1554.

Li X J,Han Z,Li C,et al.Effects of root restriction on soluble sugar contents and ultrastructure of phloem tissues in ‘Kyoho’ grape berry[J].Plant Physiology Journal,2016,52(10):1546-1554.

[19] 韓貽仁.分子細胞生物學[M].4版.北京:北京大學出版社,2012.

Han Y R.Molecular cell biology[M].4th.Beijing:Beijing University Press,2012.