水稻OsXCP2基因表達(dá)載體及RNAi載體構(gòu)建

張 磊，孫曉棠，唐子清，葉夢斐，崔汝強(qiáng)

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045)

水稻作為世界范圍內(nèi)種植的主要糧食作物之一，其產(chǎn)量受多種病原物影響。在水稻抗病過程中，篩選和利用水稻抗病基因尤為重要。木質(zhì)部半胱氨酸蛋白酶為植物與病原物互作中重要的酶類，而植物基因組大約編碼140種半胱氨酸蛋白酶，劃分為15個(gè)家族，屬木瓜蛋白酶同源酶類[1]。木質(zhì)部半胱氨酸蛋白酶2(XCP2)為半胱氨酸蛋白酶CA家族成員，是植物管狀細(xì)胞凋亡(PCD)過程中重要的自溶酶[2-3]?；谀静木哂兄匾慕?jīng)濟(jì)價(jià)值，早期對XCP蛋白酶的研究主要集中在植物調(diào)節(jié)木質(zhì)部分化、管狀分子PCD機(jī)制、次生壁及木質(zhì)素生物合成上，且研究成果較少[4-6]。但近期相關(guān)研究表明半胱氨酸蛋白酶在植物響應(yīng)病害侵染中也具有重要作用[1]，其中較為典型的是番茄與枝孢菌(Cladosporiumfulvum)互作[7]，玉米與玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis)親和互作[8]，再者是其參與本氏煙超敏反應(yīng)抵抗多種病原細(xì)菌，如梨火疫病菌(Erwiniaamylovora)和丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)[9]。作為調(diào)控植物抵抗活體營養(yǎng)型病原侵染的重要途徑，水楊酸(SA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能強(qiáng)烈誘導(dǎo)XCP蛋白表達(dá)，且滲透實(shí)驗(yàn)表明該蛋白酶能誘導(dǎo)植物PR1基因表達(dá)[10]。Zhang等[11]通過突變體技術(shù)、酵母雙雜交、免疫共沉淀等技術(shù)研究擬南芥與青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)互作，發(fā)現(xiàn)該病菌可通過與擬南芥PRN2蛋白互作，抑制擬南芥XCP2蛋白降解，使擬南芥易受青枯病菌侵染?？梢姡举|(zhì)部半胱氨酸蛋白酶為植物與病原物互作中重要的蛋白，而目前在水稻抗性基因的研究中對該基因的研究鮮有報(bào)到，僅嚴(yán)秀蕊等[12]進(jìn)行過相關(guān)研究，對XCP2蛋白在水稻與病原物互作中的作用進(jìn)行闡述，可為開發(fā)利用水稻半胱氨酸蛋白酶類抗病資源奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)室利用水稻潛根線蟲侵染抗感品種而獲得具有表達(dá)量明顯上調(diào)的OsXCP2基因，為進(jìn)一步研究其相關(guān)的功能，本研究將“酶切-連接”克隆技術(shù)與Gateway技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建了水稻OsXCP2基因過表達(dá)載體和RNAi載體，為后續(xù)探究該基因在水稻與病原物互作中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用水稻樣品采自本實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)種植的R155(霸王鞭)水稻根部組織；質(zhì)粒提取試劑盒、感受態(tài)大腸桿菌DH5a、pEASY-T3克隆載體購自北京全式金公司；植物過表達(dá)載體pCAMBIA1302(含mGFP5、his tags)、Gateway入門載體pGWc和植物RNAi載體pB7GWIWG2(II)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所范成明老師惠贈(zèng)。植物RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司、LR重組酶購自invitrogen公司；T4DNA 連接酶、rTaq酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；KOD-plus-NEO高保真酶、限制性內(nèi)切酶BglII、SpeI、Eam1105 I購自NEB(北京)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1OsXCP2基因orf克隆 參照植物RNA提取試劑盒操作說明從水稻根部組織中提取總RNA。以oligo(dT)n為引物，在AMV反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一條鏈。將本實(shí)驗(yàn)室水稻轉(zhuǎn)錄組測序得到OsXCP2基因EST序列提交至水稻基因組數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/)進(jìn)行blast，獲得OsXCP2開放閱讀框(orf)序列信息，根據(jù)該orf序列設(shè)計(jì)特異性引物XCP2-F/R。采用25 μL PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，PCR組分如下：2.5 μL 10×PCRKOD-plus-NEO高保真酶用緩沖液、2.5 μL dNTP (2 mmol/L)、 1.5 μL MgSO4(25 mmol/L)、2 μL 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、引物XCP2-F/R(10 mmol/L)各0.5 μL、1 μLKOD-plus-NEO高保真酶(5 U/μL)、加ddH2O至25 μL；PCR擴(kuò)增條件如下：94 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)，68 ℃孵育10 min，除退火溫度有所變化，下文PCR擴(kuò)增體系均參照上述體系進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，參考膠回收試劑盒說明書進(jìn)行純化回收。將回收產(chǎn)物連接到pEASY-T3載體后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，以M13通用引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定出的陽性克隆送蘇州泓訊公司測序,抽提測序正確的重組質(zhì)粒T3:XCP2，并于-80 ℃保存菌株。

1.2.2 植物過表達(dá)載體構(gòu)建 用OsXCP2基因特異性引物XCP2O-F/R(兩端帶有限制性酶切位點(diǎn)BglII和SpeI)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用限制性內(nèi)切酶BglII和SpeI酶切PCR產(chǎn)物與植物過表達(dá)載體pCAMBIA1302，酶切體系如下：5 μL 10×NEB 3.1 buffer、10 μL PCR產(chǎn)物/pCAMBIA1302載體、BglII、SpeI各1 μL、加ddH2O至50 μL,37 ℃酶切過夜后，分別膠回收酶切產(chǎn)物。IMPLEN微量核算分析儀檢測回收產(chǎn)物濃度后，調(diào)整目的片段與線性化載體的濃度為3∶1。參照T4DNA連接酶說明書連接目的基因與pCAMBIA1302載體，利用凍融法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5a后，用特異性引物pCA-F/R進(jìn)行菌落PCR鑒定，擴(kuò)繁并抽提陽性質(zhì)粒，用BglII和SpeI進(jìn)行雙酶切鑒定，體系參照上文酶切體系。鑒定為陽性的克隆測序驗(yàn)證，抽提測序正確的重組質(zhì)粒pCAMBIA1302:XCP2，并于-80 ℃保存菌株。

1.2.3 植物RNAi載體構(gòu)建 提交OsXCP2序列至NCBI進(jìn)行Blast，獲該基因特異性序列，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異性引物Ri-F/R，以T3:XCP2質(zhì)粒為模板，用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物與Eam1105 I酶切處理的入門載體pGWc，利用T4DNA連接酶將OsXCP2基因的RNAi片段與酶切后的pGWc連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后，用M13通用引物進(jìn)行菌落PCR鑒定和測序。參展質(zhì)粒提取試劑盒說明抽提陽性重組質(zhì)粒pGWc:XCP2與pB7GWIWG2(II)質(zhì)粒；參照invitrogen LR重組酶操作說明配制反應(yīng)體系后，于25 ℃進(jìn)行LR重組反應(yīng)。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5a后，涂布于含50 mg/L Spe(壯觀霉素)的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h，將根據(jù)35 s啟動(dòng)子與終止子序列設(shè)計(jì)的特異性引物FX-F/R與Ri-R組合使用，鑒定靶片段插入方向，抽提靶片段以反向重復(fù)方式插入的陽性克隆質(zhì)粒，送上海祥音公司測序，測序正確的克隆命名為pB7GWIWG2:XCP2，菌株-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 參展細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞制備方法制備土壤農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，利用凍融法將2種重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)農(nóng)桿菌GV3101中，分別在含50 mg/L Rif(利福平)和50 mg/L Kan(卡那霉素)的YEP平板與含50 mg/L Rif、50 mg/L Spe(壯觀霉素)的YEP平板上28 ℃培養(yǎng)36～48 h，以特異性引物pCA-F/R和Ri-F/R分別進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定出的陽性克隆用30%甘油保存在-80 ℃冰箱備用。

表2 PCR擴(kuò)增所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 OsXCP2基因過表達(dá)載體構(gòu)建

用含BglII和SpeI酶切位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增T3:XCP2質(zhì)粒獲得大小為1 100 bp左右的OsXCP2 cds序列(兩端含酶切位點(diǎn))；用T4DNA連接酶將酶切純化后cds片段與植物過表達(dá)載體pCAMBIA1302進(jìn)行連接，利用凍融法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5a，用pCA-F/R進(jìn)行菌落PCR鑒定陽性克隆，PCR產(chǎn)物約2 490 bp，與預(yù)計(jì)一致。擴(kuò)繁陽性克隆后抽提重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BglII和SpeI進(jìn)行雙酶切鑒定，預(yù)計(jì)產(chǎn)生1個(gè)10 550 bp大小片段和1個(gè)1 100 bp大小片段，與電泳結(jié)果一致(圖2)。

圖1 重組質(zhì)粒示意Fig.1 The structure of recombinant plasmids

M：marker DL 15000；1： pCAMBIA302載體；2：雙酶切產(chǎn)物；3： 基因cds序列M:DNA marker DL15000;1:pCAMBIA1302 vector;2:enzyme digest;3:XCP2 CDS fragment圖2 重組過表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定 Fig.2 Double enzyme digesting of recombinant overexpression plasmid

M：marker DL 2000；1：Ri-F/R擴(kuò)增結(jié)果；2：FX-F/Ri-R擴(kuò)增結(jié)果；3:FX-R/Ri-R擴(kuò)增結(jié)果M:molecular marker of DL 2000;1,2,3:PCR assay used by primer Ri-F/R,FX-F/Ri-R,FX-R/Ri-R圖3 重組RNAi PCR鑒定Fig.3 PCR assay of recombinant RNAi plasmid

2.2 OsXCP2基因RNAi載體構(gòu)建

利用OsXCP2 RNAi片段特異性引物與限制性內(nèi)切酶Eam1105 I以T3:XCP2質(zhì)粒為模板，將RNAi靶片段克隆進(jìn)入Gateway入門載體pGWc后，在LR重組酶作用下將靶片段通過位點(diǎn)特異性重組反向重復(fù)插入到植物RNAi載體pB7GWIWG2中，以引物FX-F/Ri-R、FX-R/Ri-R、Ri-F/R進(jìn)行菌落PCR鑒定(圖3)，并對鑒定出的陽性克隆進(jìn)行測序，結(jié)果顯示靶片段成功重組到該RNAi載體中。

M：marker DL 5000；2、11：陽性克隆M:molecular marker of DL 5000; 2、11：positive clones圖4 重組過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101鑒定Fig.4 PCR assay of recombinant overexpression plasmid transforming into GV3101

M：marker DL 2000；除10外均為陽性克隆M:molecular marker of DL 2000;Execept 10:positive clone圖5 重組RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101鑒定Fig.5 PCR assay of recombinant RNAi plasmid transforming into GV3101

2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101

參照質(zhì)粒提取試劑盒抽提兩種重組質(zhì)粒，利用凍融法將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)土壤農(nóng)桿菌GV3101，分別用特異性引物pCA-F/R、Ri-F/R進(jìn)行菌落PCR鑒定。電泳結(jié)果(圖4、5)與預(yù)計(jì)的2 490 bp和450 bp。表明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)化入土壤農(nóng)桿菌GV3101。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)首先利用特異性引物獲得該基因兩端含BglII和SpeI酶切位點(diǎn)的編碼區(qū)序列，然后在2種限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶作用下將目的片段重組進(jìn)入植物表達(dá)載體pCAMBIA1302(含GFP、his tags)。再者，在NCBI中比對獲得該基因特異性序列信息，并設(shè)計(jì)引物獲得該序列。由于未在該序列中添加用于BP重組反應(yīng)的特異性位點(diǎn)，先利用內(nèi)切酶Eam1105 I將該片段重組到入門載體pGWc中，再進(jìn)行LR重組反應(yīng)獲得重組質(zhì)粒pB7GWIWG2:XCP2。由于pGWc載體中AhdI酶切位點(diǎn)經(jīng)酶切后產(chǎn)生的平末端難以進(jìn)行連接，選用其同尾酶Eam1105 I進(jìn)行切割，連接反應(yīng)相對容易進(jìn)行。

早期對XCP編碼基因的研究主要集中在植物細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡，雖然近期對其在植物抗病機(jī)制中的作用進(jìn)行了闡述，但局限于玉米，番茄、擬南芥等，對其在水稻與病原互作中的作用并無相關(guān)報(bào)道。水稻作為重要的糧食作物，病原物的侵染不僅會(huì)導(dǎo)致水稻產(chǎn)量下降，也會(huì)引起水稻細(xì)胞程序性死亡，如潛根線蟲的侵染[13]。因?qū)倩铙w營養(yǎng)型的潛根線蟲不導(dǎo)致水稻細(xì)胞凋亡，水稻的這種細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是水稻的自我保護(hù)機(jī)制之一。水楊酸(SA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在水稻抵抗病原侵染中發(fā)揮重要作用[14-15]，早期對玉米XCP2的研究表明SA信號途徑可通過與其作用誘導(dǎo)植物防衛(wèi)反應(yīng)[9-10]，同時(shí)對擬南芥XCP2的研究表明青枯病菌可以通抑制XCP2的降解使水稻易受該病菌侵染[11]，此雖說明XCP2在植物與病原物互作中發(fā)揮重要作用，但目前水稻中關(guān)于該基因的報(bào)道甚少，對其具體作用機(jī)制和在水稻與病原物互作中的作用了解不足。構(gòu)建水稻OsXCP2基因植物表達(dá)載體(含GFP、his tag)和RNAi載體為后續(xù)進(jìn)行該基因亞細(xì)胞定位、互作蛋白研究、轉(zhuǎn)基因水稻株系獲取提供條件，可進(jìn)一步闡明半胱氨酸蛋白酶在植物細(xì)胞凋亡、組織分化及在水稻抗病中的作用。

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