大承氣湯對急性重癥胰腺炎大鼠血清IL-6 sIL-2R誘導胰腺腺泡細胞凋亡的研究*

張明敏，杜建文（.貴陽中醫(yī)學院，貴州貴陽55000；.貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院急診科，貴州貴陽 55000）

急性重癥胰腺炎（SAP）起病迅速，發(fā)展快，并發(fā)癥嚴重，預后不良，病死率高，近年來，相關(guān)文獻報道其發(fā)病率為10%～30%[1-2]。一直以來，SAP均是急腹癥領域研究的熱點，對于SAP的發(fā)病原因也在不斷探索中。本實驗以中醫(yī)基礎理論為指導，對臨床治療SAP的經(jīng)典方劑——大承氣湯進行研究。大承氣湯來自仲景的《傷寒論》，其組方（大黃、厚樸、枳實、芒硝）簡單而精妙。本實驗采用腹腔注射L-精氨酸方法造模，對造模成功的SD大鼠進行口腔灌胃大承氣湯，股動脈采血并開腹取胰腺組織進行相關(guān)血清學及胰腺腺泡細胞凋亡分析，觀察大鼠血清白細胞介素-6（IL-6）、可溶性白細胞介素-2受體（sIL-2R）水平變化對胰腺腺泡細胞凋亡的影響，探討大承氣湯治療SAP的可能作用機制，特別是對胰腺腺泡細胞凋亡的作用，為臨床用藥提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般材料 采用成年SD大鼠66只，均為雌性，大鼠平均體重為（230±20）g，由四川大學華西醫(yī)學中心實驗動物中心供給。許可證號：scxk（川）2016-09。按照隨機數(shù)字表法、完全隨機分組法將66只大鼠分為空白組、模型組、大承氣湯組，其中空白組6只，模型組和大承氣湯組各30只。模型組及大承氣湯組分別再按時間點 2、6、12、24、48 h 進行分組，每組 6 只。在造模成功后分別將模型組和大承氣湯組大鼠按照對應時間點處死并進行分批股動脈取血及手術(shù)取胰腺組織?？瞻捉M大鼠于腹腔注射生理鹽水后3 h采樣，模型組造模成功后不再灌胃大承氣湯。

1.1.2 試劑及儀器 主要試劑：L-精氨酸（索萊寶公司）；生理鹽水（科倫藥業(yè)股份有限公司）；大承氣湯（北京同仁堂）。中藥煎藥機（恒延鑫密閉壓榨煎藥機）由貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院提供；12號灌胃針頭；主要酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒：IL-6、sIL-2R由伊來瑞特生物科技有限公司提供，產(chǎn)品編號：E-EL-R0015c。凋亡試劑盒（美國BD公司，貨號：551302，規(guī)格：MITOSCREEN JC-1 KIT 100TST）由成都百態(tài)生物科技有限公司提供。流式細胞儀由貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院實驗室研究平臺提供（藥物臨床試驗機構(gòu)）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 動物適應性喂養(yǎng)不禁食、禁飲5 d后，進行實驗造模，空白組6只大鼠不做處理，造模前24 h禁食、禁飲。模型組及大承氣湯組分別進行SAP造模，采用腹腔注射L-精氨酸方法進行造模，用生理鹽水配置，pH值為7.0腹腔注射制作大鼠SAP模型，采用1.148 mmol/L（10%）L-精氨酸溶液，每次 3.0 mg/g，1 h 后重復注射1次，3 h后即為造模成功[3]。模型組與大承氣湯組造模方法相同?？瞻捉M：采用等量生理鹽水腹腔注射。

1.2.2 給藥方法及試劑 藥物：（1）方劑采用《方劑學》5版教材劑量。大承氣湯：大黃12 g，芒硝9 g，枳實12 g，厚樸15 g。（2）大承氣湯煎劑制作：先將中藥用清水浸泡 2 h，再用煎藥機煎 2 h，煎成每劑 200 mL。（3）大承氣湯組所有大鼠均采用口腔灌胃的方法給藥，于造模成功后3 h灌胃，采用12號灌胃針頭及中藥濃度為43.2%的大承氣湯溶液（劑量按人與大鼠體表面積換算，即100 mL 溶液中含大承氣湯 43.2 g）灌胃（1 mL/200 g）[4]。（4）模型組采用等量生理鹽水灌胃。各組SD大鼠灌胃每次均 12 h，在 2、6、12、24、48 h 分批處死 6 只 SD 大鼠并采集血清及胰腺組織。

1.2.3 標本采集 空白組大鼠于腹腔注射生理鹽水后3 h采樣，模型組及大承氣湯組大鼠于造模成功后2、6、12、24、48 h采樣。采樣方法：斷頭處死后，股動脈取血及時進行離心、分離，取上層血清，并立即于-80℃低溫冰箱保存血清，以便檢測IL-6、sIL-2R水平；立即開腹取出胰腺組織，將取出的胰腺組織立即保存于液氮中，以便進行細胞懸液制備，檢測胰腺腺泡細胞凋亡率。

1.2.4 血清IL-6、sIL-2R水平測定 依據(jù)大鼠的標記號及相應分組，對分離所得血清采用ELISA檢測IL-6、sIL-2R水平，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.5 胰腺腺泡細胞凋亡檢測 將液氮保存的胰腺組織用眼科剪將組織細胞分離，進行細胞懸液的制備。采用Annexin V法檢測細胞凋亡率，凋亡的胰腺腺泡細胞定量用BD凋亡細胞試劑盒檢測，且嚴格按BD公司凋亡試劑盒說明書進行。將Annexin-V進行熒光素藻紅蛋白（PE）標記，以標記了Annexin-V作為熒光探針，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡發(fā)生情況。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以x±s表示，各組間同一指標比較采用單因素ANOVA方差分析，同組內(nèi)同一指標治療前后變化比較采用自身配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組各時間點血清IL-6、sIL-2R水平比較 大承氣湯組及模型組大鼠組內(nèi)2、6 h的血清IL-6、sIL-2R水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但2 h與12、24、48 h時的血清IL-6、sIL-2R水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。大承氣湯組大鼠2、6 h時的血清IL-6、sIL-2R水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），大承氣湯組48 h IL-6水平明顯低于模型組，12、24 h IL-6水平均明顯高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），大承氣湯組 24、48 h sIL-2R 水平均明顯低于模型組，12 h sIL-2R水平明顯高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表 1。

2.2 各組胰腺腺泡細胞凋亡率比較 經(jīng)檢測，空白組及模型組大鼠的胰腺腺泡細胞凋亡率較低，大承氣湯組大鼠 2、6、12、24、48 h 的胰腺腺泡細胞凋亡率均顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組組內(nèi)各時間點的細胞凋亡率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；大承氣湯組組內(nèi)各時間點的細胞凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表 2。

表1 各組各時間點IL-6、sIL-2R水平比較（±s，pg/mL）

表1 各組各時間點IL-6、sIL-2R水平比較（±s，pg/mL）

注：與同組 2 h 比較，aP＜0.05；與模型組同時間點比較，bP＜0.05；與模型組及大承氣湯組比較，cP＜0.05

sIL-2R 20.02±8.39 24.27±10.22 100.28±12.36a 120.25±18.17a 110.23±13.29a 21.38±7.36 23.45±9.98 150.47±21.36ab 75.27±12.21ab 40.33±10.03ab 23.25±20.43c組別模型組時間（h）2 6 1 2 24 48大承氣湯組2 6 1 2空白組24 48 3 n 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 IL-6 60.37±10.12 63.23±18.74 150.48±20.33a 200.25±30.23a 210.00±28.73a 55.32±9.97 59.57±20.21 100.38±18.73ab 160.32±16.32ab 110.11±19.57ab 50.45±20.32c

表2 各組胰腺腺泡細胞凋亡率比較（±s）

表2 各組胰腺腺泡細胞凋亡率比較（±s）

注：與模型組同時間點比較，aP＜0.05

組別模型組24 48時間（h）2 6 1 2大承氣湯組2 6 1 2空白組細胞凋亡率（%）1.21±0.29 2.34±0.87 2.97±0.46 3.09±0.46 2.21±0.58 16.29±0.48a 19.39±0.35a 17.39±0.52a 18.34±0.41a 24.32±0.31a 0.81±0.09 24 48 3 n 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6

3 討 論

有研究證實，SAP的發(fā)生與腸道細菌移位有著密切的關(guān)系，SAP患者的腸黏膜屏障受到破壞，大量體液會丟失，從而導致腸道缺血、缺氧[5-6]。同時胃腸道功能減弱，腸道細菌移位導致內(nèi)毒素產(chǎn)生，進而體內(nèi)炎癥介質(zhì)被激活；胰腺細胞的壞死、溶解，細胞壞死增加而細胞凋亡減少[7]。IL-6是重要的促炎性細胞因子之一，能直接激活炎癥細胞，催化和放大炎性反應，并能損傷血管內(nèi)皮細胞，與SAP病情嚴重程度呈正相關(guān)[8]；sIL-2R是一種重要的免疫抑制劑，可中和、活化T細胞周圍的IL-2，減弱機體的內(nèi)分泌效應，抑制已活化的T細胞的克隆化擴增。同樣與SAP病情嚴重程度呈正相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，SAP大鼠血清IL-6、sIL-2R水平的變化和胰腺細胞凋亡之間存在著線性關(guān)系。造模成功后，模型組及大承氣湯組大鼠的血清IL-6、sIL-2R水平在2、6、12、24、48 h 各時間點均有不同程度的升高，具體為模型組IL-6水平在造模后6 h開始上升，在48 h達到峰值；sIL-2R在造模后6 h開始上升，在24 h達到峰值。大承氣湯組IL-6水平在造模后6 h開始升高，24 h達到峰值，隨后下降，sIL-2R水平在造模后6 h開始升高，12 h達到峰值，隨后下降，但模型組峰值明顯高于大承氣湯組。大承氣湯組的峰值提前出現(xiàn)，并且峰值水平下降，這表明大承氣湯發(fā)揮了減少T細胞及巨噬細胞等炎癥細胞炎癥介質(zhì)的釋放，阻斷了炎癥介質(zhì)引起的“瀑布”式反應，起到了治療效果。有研究表明，IL-6能夠降低肝臟對于細胞內(nèi)毒素的清理，使炎癥致病因子進入血液循環(huán)，從而加快其他臟器的損害，加重SAP的病情[9]。在相對應的時間點胰腺腺泡細胞凋亡率水平來看，模型組各時間點的細胞凋亡率均低于大承氣湯組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明大承氣湯可以通過拮抗炎性因子的釋放，減輕周圍組織炎性反應，并提高胰腺腺泡細胞凋亡率，凋亡的細胞可以將細胞內(nèi)的酶原釋放到細胞外，從而減輕組織周圍的炎性反應[10]，達到減輕SAP癥狀的目的。

祖國醫(yī)學雖然沒有明確的急性胰腺炎病名，但從急性胰腺炎的癥狀和體征上來講，當歸屬于“胃脘痛”范疇。唐喜玉等[11]指出，急性胰腺炎是由于各種病因?qū)е乱认俳M織所分泌的消化酶在胰腺內(nèi)被激活，從而對胰腺自身組織進行消化的胰腺急性化學性炎癥，屬中醫(yī)學“里證”“實證”“熱證”，治宜通腑泄熱、活血化瘀、行氣止痛。其代表方劑——大承氣湯是《傷寒論》的經(jīng)典方劑，針對SAP腹?jié)M脹痛，大便不通，集合中醫(yī)“通則不痛”的理論，具有通里攻下、清熱解毒、瀉下逐滿的功效。大承氣湯組方（大黃、厚樸、枳實、芒硝）簡單，但其實際臨床使用方便，效果較好，絕大部分患者在西醫(yī)治療的基礎上運用大承氣湯后，起到了增效的作用。為探求其有效成分，有研究發(fā)現(xiàn)，大承氣湯中大黃等可以消食導滯，通里攻下，清除腸道內(nèi)的細菌和內(nèi)毒素，具有保護和恢復腸道黏膜的屏障作用，減少SAP休克的發(fā)生率并能夠縮短病程[12]。早期運用大承氣湯可以改善腸道功能，抑制細菌移位，加快SAP的恢復[13]。大黃能有效促進胃腸功能恢復，增加腸蠕動及腸張力，避免胰腺和全身的繼發(fā)感染，有效改善SAP患者因腸功能衰竭導致的細菌移位，同時抑制胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶，防止胰酶引起胰腺組織自身消化[14]。枳實、厚樸行氣活血止痛，具有抗菌、抗病毒、清除內(nèi)毒素及炎性因子作用，刺激消化道黏膜，引起反射性興奮，增加小腸蠕動，調(diào)整胃腸功能，促進胃排空以減輕腹脹；芒硝清熱瀉下，可清除腸道燥熱實積，減少胃腸道壓力，與大黃協(xié)同達到通腑泄?jié)岬墓π15]，提高機體的免疫力。但大承氣湯治療SAP的確切機制還有待廣大學者進一步研究及闡明，本實驗僅對IL-6、sIL-2R及細胞凋亡率進行了探索，在臨床上起到了佐證大承氣湯治療SAP有效的結(jié)果。作者認為，在臨床上加用大承氣湯治療SAP較單純西醫(yī)治療所取得的效果更加顯著。

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