ADAMTS-1基因多態(tài)性及C反應蛋白在頸動脈斑塊患者中的相關性研究

陳超 林冬銘 吳源鴻 黃抒偉

Ⅰ型血小板結合蛋白基序的解蛋白樣金屬蛋白酶-1（ADAMTS-1）是一種新發(fā)現(xiàn)的金屬蛋白酶，其金屬蛋白酶結構區(qū)域含有鋅離子（Zn2+）結合部位，是Zn2+依賴性金屬蛋白酶家族的新成員[1]。ADAMTS-1基因rs402007位點位于第1外顯子區(qū)，轉錄后為5′-UTR區(qū)，提示可能參與翻譯調節(jié)，影響mRNA的穩(wěn)定性、翻譯效率等。前期研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS-1基因rs402007位點多態(tài)性與腦梗死、冠心病等眾多心腦血管疾病有關，但其具體機制還不清楚[1-2]；近來研究表明低度炎性反應伴隨心腦血管疾病始終，兩者之間相互影響，是一個惡性循環(huán)的關系[3]。C反應蛋白（CRP）在炎癥反應中起重要作用，本研究旨在闡明ADAMTS-1基因多態(tài)性與血清CRP之間的關系，探討ADAMTS-1基因多態(tài)性致頸動脈斑塊形成的機制。

1 對象和方法

1.1 對象 2015年6月至2016年9月在我院體檢中心檢查的受試者684例，由2位高年資超聲科醫(yī)生進行頸動脈超聲檢查及診斷，根據(jù)檢查結果有無斑塊將其分為斑塊組和對照組。斑塊組383例，其中男 229例，女 154例，年齡 47～76（69.54±9.67）歲。對照組301例，其中男168例，女133例，年齡44～75（61.73±11.14）歲。所有的研究對象之間無親緣關系。排除標準：有感染性疾病、急性腦梗死、急性心肌梗死、風濕性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤、外傷性疾病、嚴重的肝腎疾病的患者。研究方案通過我院倫理委員會批準，全部研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 生化指標測定 抽取清晨空腹肘靜脈血2ml至EP管，用美國Beckman公司生產的離心機（ALLEGRA X-12centrifuge）分離血清，分離好的血清標本儲存于-80℃冰箱，避免反復凍融。ELISA法測定血清CRP水平。

1.2.2 基因組DNA抽提 用血液基因組DNA抽提試劑盒（上海捷瑞生物工程公司）提取基因組DNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設計和PCR反應 從Ensembl數(shù)據(jù)庫獲得含有rs402007位點的ADAMTS1基因目的片段序列，輸入Primer5.0軟件合成引物（上游引物：5′-GGCGTCTTTGGGATGGAA-3′；下游引物：5′-CAGGAGACACCGCTCGTAG-3′）。反應體系 25μL包括1.0μl DNA模板，上下游引物各0.5μl，MixdNTP（10mmol/L）0.5μl，10×緩沖液 2.5μl，Taq DNA 聚合酶（5U/μl）0.25μl，Mg2+（25mmol/L）1.0μl，雙蒸餾水18.75μl。反應條件：95℃2min，94℃45s，56℃45s，72℃1min，35個循環(huán)，72℃延伸 10min；1.8%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像分析儀下分析。

1.2.4 測序和突變分析 對樣本的PCR擴增產物用ABI-PRISM3730全自動測序儀進行檢測，對瓊脂凝膠中的目的DNA片段純化后直接寄往上海生工生物有限公司測序部測序。

1.2.5 觀察指標 比較斑塊組與對照組兩組間年齡、糖尿病、高血壓、吸煙史、飲酒史、LDL-C、TG、TC、CRP、等位基因頻率及基因型的差異；比較不同基因型及基因頻率間CRP血清水平的差異。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料之間比較采用χ2檢驗；計量資料以或四分位數(shù)表示，比較采用t檢驗或非參數(shù)秩和檢驗；采用二元logistic回歸分析危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者一般資料比較 兩組受試者糖尿病、高血壓、吸煙、年齡、LDL-C比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），飲酒、TG、TC 比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表 1。

表1 兩組受試者一般資料比較[例（%）]

2.2 ADAMTS-1基因rs402007檢測序列圖 見圖1。

2.3 兩組受試者ADAMTS1基因型頻率和等位基因頻率比較 見表2。

由表2可見，斑塊組GG基因型頻率低于對照組，GC、CC基因型頻率高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。兩組G、C等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組間rs402007位點均符合 Hardy-Weinberg 平衡（χ2＝0.643、0.205，P＝0.423、0.651）。

圖1 ADAMTS-1基因rs402007檢測序列圖：CC/GC/GG；GG：野生純合子；GC：突變雜合子；CC：突變純合子

表2 兩組受試者ADAMTS-1基因型頻率和等位基因頻率比較[例（%）]

2.4 ADAMTS-1基因型及等位基因致病風險分析見表3。

表3 ADAMTS-1基因型及等位基因致病風險分析

由表3可見，C等位基因攜帶者可使斑塊發(fā)生的患病風險增加1.37倍；GC、CC與GG相比，分別使斑塊患病風險增加1.416倍及1.812倍。

2.5 兩組及各基因型間CRP的比較 斑塊組血清 CRP 水平為 0.81（0.35，1.24）mg/L，高于對照組0.58（0.22，1.13）mg/L，差異有統(tǒng)計學意義（Z＝-3.667，P＝0.000）。GC組、CC組、GG組CRP水平分別為0.82（0.34，1.26）、0.94（0.42，1.45）、0.39（0.21，0.68）mg/L，其中GG組與GC組、CC組比較，差異有統(tǒng)計學意義（Z＝-6.794、-6.213，均P＜0.01）。此外，GG組與GC+CC組 0.91（0.31，1.47）mg/L 比較，差異有統(tǒng)計學意義（Z＝-8.384，P＜0.01）。

2.6 頸動脈斑塊的多因素logistic回歸分析 見表4。

由表4可見，ADAMTS-1 rs402007位點GC+CC基因型較GG基因型增加斑塊患病風險（OR＝1.552；95%CI：1.093～2.203），此外高血壓病史、年齡、LDL-C水平升高、吸煙也是斑塊產生的獨立危險因素。

表4 頸動脈斑塊的多因素logistic回歸分析

3 討論

動脈粥樣硬化是動脈壁炎性-纖維增生性病變，是導致急性心腦血管疾病發(fā)生的主要原因。遺傳易感性及環(huán)境危險因素是目前動脈粥樣硬化的防治重點[4-5]。研究已證實，ADAMTS-1基因rs402007位點C等位基因是急性大動脈粥樣硬化性腦梗死的遺傳易感基因，但其致病機制尚未完全清楚[1]。近年資料證明：CRP水平通過刺激膠原纖維和平滑肌增生，促使動脈血管壁結構改變，激活補體系統(tǒng)，大量炎癥介質及自由基同時產生和釋放，與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展有密切的關系[6-7]。進一步推測ADAMTS-1基因rs402007位點G＞C突變可能通過調節(jié)血清CRP水平影響斑塊發(fā)生、發(fā)展及穩(wěn)定性，從而增加心腦血管疾病的患病風險。

本研究中我們應用病例-對照設計，進行ADAMTS-1基因多態(tài)性、血清CRP水平及頸動脈斑塊3者之間的關聯(lián)性研究。研究結果表明，斑塊組血清CRP水平較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義，提示CRP水平與動脈粥樣硬化病變過程相關。斑塊組rs402007位點GC+CC基因型頻率及C等位基因頻率均較對照組高，logistic回歸分析提示其為斑塊形成的獨立危險因素，C等位基因攜帶者患動脈斑塊的風險較無C等位基因攜帶者高1.552倍，提示C等位基因是動脈粥樣硬化及斑塊形成的一個遺傳易感等位基因。而C等位基因攜帶者血清CRP水平較無C等位基因攜帶者顯著高，提示ADAMTS-1基因rs402007位點G＞C突變與炎癥因子的表達有密切聯(lián)系，證實了我們的推測。本研究結果顯示rs402007位點G和C等位基因頻率分別為0.572和0.428，符合浙江漢族人群的基因分布。

CRP是一種短鏈正五聚蛋白（PTX），主要在肝臟合成，在機體急性及慢性炎癥中具有重要作用。而ADAMTS-1作為一種炎癥相關蛋白，已被證實與炎癥反應密切相關[8-9]。本次研究進一步發(fā)現(xiàn)ADAMTS-1基因rs402007位點G＞C突變與炎癥因子CRP的表達有密切聯(lián)系，分析原因，ADAMTS-1基因rs402007位點G＞C突變通過影響ADAMTS-1蛋白表達，一方面，直接刺激血管平滑肌細胞（VSMCs）釋放CRP[10]；另一方面，激活單核巨噬細胞NADPH氧化酶，促進ROS產生，ROS可以活化促炎轉錄因子激活蛋白-1和NF-kB，誘導CRP的產生[11]。本次研究未涉及相關機制，因此在接下來的研究中，我們將從分子表達通路角度進行進一步研究。

綜上所述，ADAMTS-1基因rs402007位點C等位基因是動脈粥樣硬化及斑塊形成的一個遺傳易感等位基因；G＞C突變通過影響炎癥因子的表達影響斑塊發(fā)生、發(fā)展及穩(wěn)定性增加心腦血管疾病的患病風險。

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（本文系第十一屆錢江國際心血管病會議優(yōu)秀論文）