基于ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９構(gòu)建基因編輯小鼠ｓｇＲＮＡ有效性驗(yàn)證研究

許文豪 周婉 臧敦安 鞏雪潔 劉慶華 于孟飛 薛璐 彭勇波

摘要：以小鼠S100A9基因?yàn)槔?，設(shè)計(jì)針對該基因的sgRNA，體外轉(zhuǎn)錄后與Cas9 mRNA通過顯微注射入受精卵，選取囊胚期的胚胎，單枚獨(dú)立進(jìn)行基因型分析，并綜合得出編輯效率。結(jié)果表明，顯微注射113枚受精卵，其中28枚成功發(fā)育到囊胚期，其中有5枚囊胚在特定位點(diǎn)產(chǎn)生了基因突變，總編輯效率為18%。該方法操作簡單，可快速對sgRNA活性進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，并為后續(xù)基因編輯小鼠的制備提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9;小鼠;sgRNA有效性;囊胚

中圖分類號：Q78? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）24-0156-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.042? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： The mouse gene，S100A9 was used as an example to illustrate the expected sgRNA design. After in vitro transcription and Cas9 mRNA were injected into the fertilized egg by micro-injection，the embryos in the blastocyst stage were selected，and then performed with genotype identification. The results showed that a total of 113 fertilized eggs were microinjected，of which 28 successfully developed into the blastocyst stage，and five blastocysts produced effective genetic mutations at specific sites. The editing efficiency was 18%. This method is simple to operate，can rapidly verify the sgRNA activity in vivo，and provides a basis for the preparation of subsequent genetically edited mice.

Key words： CRISPR/Cas9; mouse; sgRNA validity; blastosphere

2013年，美國科學(xué)家Zhang等首次證明了Cas9核酸酶可以對小鼠和人類細(xì)胞DNA進(jìn)行有效的編輯[1]。CRISPR/Cas9被整合為基因編輯工具后，由于在特異性識別基因組上的目標(biāo)位點(diǎn)和在目標(biāo)位點(diǎn)對DNA雙鏈進(jìn)行切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制這兩方面表現(xiàn)出了較強(qiáng)的功能，該系統(tǒng)在包括果蠅、斑馬魚、小鼠、大鼠和人類等在內(nèi)的各物種的基因組編輯中得到廣泛運(yùn)用[2]。經(jīng)過改造后的CRISPR/Cas9將原本獨(dú)立的crRNA及tracrRNA[3]融合為一條單鏈引導(dǎo)RNA（single-stranded guide RNA，sgRNA）[4]使其更加易于使用。

依靠CRISPR/Cas9技術(shù)和胚胎顯微注射技術(shù)，研究人員可以高效地構(gòu)建基因敲除、定點(diǎn)敲入及敲減的動物模型，為研究基因功能、藥物開發(fā)和發(fā)病機(jī)制研究提供新的材料和策略。但CRISPR/Cas9系統(tǒng)中設(shè)計(jì)的sgRNA是否具有特異性的胚胎內(nèi)源引導(dǎo)活性，是成功進(jìn)行基因編輯中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)?，F(xiàn)階段sgRNA的篩選主要有通過sgRNA與Cas9蛋白進(jìn)行體外酶切驗(yàn)證[5]和利用敲除載體進(jìn)行細(xì)胞系水平驗(yàn)證2種方式[6]。上述2種sgRNA活性驗(yàn)證方式都存在一定的弊端，如前者為體外酶切試驗(yàn)，無法真實(shí)反映該sgRNA在細(xì)胞內(nèi)的引導(dǎo)活性;后者由于細(xì)胞系選擇不同，導(dǎo)致結(jié)果存在誤差，且制備過程繁瑣，耗時(shí)耗力?；谀壳坝嘘P(guān)CRISPR/Cas9系統(tǒng)中sgRNA有效性驗(yàn)證存在的不足，本研究以小鼠S100A9基因?yàn)槔?，建立了基于體外培養(yǎng)顯微注射后的胚胎[7]和對囊胚時(shí)期單胚胎進(jìn)行基因型分析，從而對sgRNA有效性進(jìn)行驗(yàn)證。

1? 材料與方法

1.1? 材料

SPF級4周齡C57BL/6小鼠，SCXK（鄂）2017-0018。

lentiCRISPR V2載體（Addgene公司）、T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（百奧邁科生物技術(shù)有限公司）、KSOM培養(yǎng)基（Sigma公司）、PCR引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.2? 方法

1.2.1? sgRNA設(shè)計(jì)與合成? 根據(jù)GenBank中的鼠源S100A9基因（NM_001281852）包含3個外顯子，將選擇后的外顯子片段在麻省理工學(xué)院的CRISPR Design軟件（http：//CRISPR.mit.edu/）中進(jìn)行sgRNA設(shè)計(jì)。根據(jù)得分高低順序依此選擇6條候選sgRNA進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。表1加粗部分為質(zhì)粒載體骨架序列，gRNA-RP為載體通用下游引物。

1.2.2? 體外轉(zhuǎn)錄? 以lentiCRISPR v2（Plasmid #52961）為模板，PCR擴(kuò)增上述6條sgRNA，純化后溶于Nuclease-FreeWater，-20 ℃保存。純化后的DNA片段通過T7 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后為單一條帶，且A260 nm/A280 nm>1.9，A260 nm/A230 nm>2.3。

1.2.3? Cas9 mRNA/sgRNA 顯微注射? 選取4周齡C57BL/6雌性小鼠提前進(jìn)行PMSG（10 IU/只）及HCG（10 IU/只）人工超數(shù)排卵，并在HCG注射當(dāng)日與性成熟的雄性C57BL/6小鼠進(jìn)行合籠，次日取見栓雌鼠解剖。在顯微鏡下，用針頭將輸卵管壺腹部刺破，將富集有受精卵的云霧團(tuán)劃出，移至含有0.1%透明質(zhì)酸M2溶液中消化。將明顯破損或異常的受精卵進(jìn)行剔除，完成后待顯微注射用。

將6條sgRNA提前混合，隨后與Cas9 RNA按照終濃度10、100 ng/μL再次混勻。選取狀態(tài)良好的受精卵進(jìn)行顯微注射，調(diào)整合適注射壓保證外源物質(zhì)順利進(jìn)入胞內(nèi)，且不使其發(fā)生破裂和融解為宜。

1.2.4? 胚胎體外培養(yǎng)? 注射完成后的受精卵轉(zhuǎn)移至KSOM培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng)，直至胚胎囊胚期。囊胚期是現(xiàn)階段人工體外培養(yǎng)胚胎能達(dá)到的最后階段，在該階段Cas9的切割作用也已基本完成。按單枚胚胎每管收集正常發(fā)育中的囊胚期的胚胎，用于后續(xù)基因型分析和對sgRNA內(nèi)源活性進(jìn)行鑒定。

1.2.5? 囊胚總DNA提取及基因型鑒定? 按表2中所示比例配置裂解液，并將單枚囊胚置于其中。混合均勻后在55 ℃下裂解20 min，隨后95 ℃作用5 min。此時(shí)囊胚中的基因組DNA已經(jīng)充分釋放，可進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證試驗(yàn)。

根據(jù)sgRNA位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了如下檢測引物F（5′-3′）CTCCATTATGTAGCACCCTA，R（5′-3′）TCACCA

TCCTCCCAACTC進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定，并分析sgRNA內(nèi)源活性。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 受精卵顯微注射及體外培養(yǎng)

經(jīng)過顯微注射后的受精卵，在KSOM溶液中培養(yǎng)至胚胎3.5 d。顯微注射113枚受精卵，其中28枚受精卵成功發(fā)育到囊胚期。在培養(yǎng)的過程中會出現(xiàn)一定比例的受精卵死亡，一部分原因是注射過程中機(jī)械損傷，另外部分原因是2-細(xì)胞阻滯（2-cell block）[8]，體外培養(yǎng)的受精卵會由于無法順利的度過2細(xì)胞期而停止發(fā)育，從而無法成功獲得囊胚期細(xì)胞。

受精卵發(fā)育過程中，其胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)會增多，與此同時(shí)，sgRNA和Cas9復(fù)合體在核內(nèi)對基因組進(jìn)行切割，可以提取囊胚基因組DNA進(jìn)行檢測，分析sgRNA是否具有內(nèi)源引導(dǎo)活性。

2.2? 靶位點(diǎn)所在區(qū)域的片段擴(kuò)增與鑒定

在成功進(jìn)行顯微注射和體外培養(yǎng)后，獲得了28枚囊胚，通過裂解后，取1 μL DNA為模板，利用特異性的檢測引物對目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.5%凝膠電泳鑒定（圖2）。野生型片段為556 bp，若小于或大于該片段就可能發(fā)生了基因的缺失或插入。5號囊胚基因組發(fā)生編輯，缺失135 bp;7號囊胚呈現(xiàn)2條目的條帶，一條為野生型片段，另外一個等位基因共缺失171 bp;9號囊胚基因組缺失51 bp;16號囊胚基因組缺失54 bp;20號囊胚基因組缺失3 bp。19號囊胚與7號囊胚呈現(xiàn)相似的2條目的條帶，但是由于測序失敗，未能收集到基因組變換情況。

將PCR擴(kuò)增得到的片段，進(jìn)行測序分析，測序峰圖及基因編輯情況見圖3。

經(jīng)過測序分析，鑒定的28枚囊胚中出現(xiàn)了5枚囊胚的突變，分別缺失了11 bp至171 bp不等，總切割比例為18%，突變區(qū)域與設(shè)計(jì)位點(diǎn)吻合。

囊胚鑒定可替代常見的引物體外活性檢測，因?yàn)槟遗咂谑芫鸦蚪M近乎等同于F0代小鼠基因組，而體外活性檢測利用體外的酶切反應(yīng)無法最真實(shí)地模擬胞內(nèi)環(huán)境。直接選取囊胚進(jìn)行鑒定，也節(jié)約了大量等待小鼠孕期及F0代小鼠生長的時(shí)間，加快了整個試驗(yàn)進(jìn)度，提高了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

囊胚鑒定中，檢測引物的擴(kuò)增效率需要通過預(yù)試驗(yàn)進(jìn)行提前驗(yàn)證，避免擴(kuò)增檢測片段時(shí)因?yàn)橐镒陨淼臄U(kuò)增效率過低而導(dǎo)致囊胚基因組DNA的浪費(fèi)和流失。

3? 小結(jié)與討論

傳統(tǒng)的基因敲除小鼠模型是利用同源重組技術(shù)，在ES細(xì)胞中針對特定的DNA序列進(jìn)行編輯，由于重組效率低、耗時(shí)長，得到的小鼠需要多代回交等原因，大大限制了基因敲除小鼠構(gòu)建的速度。

2013年Rudolf通過共同注射Cas9 mRNA和 sgRNA到小鼠受精卵中，實(shí)現(xiàn)了CRISPR/Cas9技術(shù)首次被用于多細(xì)胞生物的多基因敲除[9]。利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因敲除小鼠構(gòu)建時(shí)，只需設(shè)計(jì)20 bp的gRNA與靶序列DNA互補(bǔ)[9]，Cas9蛋白通過識別靶序列末端的PAM區(qū)[10]，即可進(jìn)行DNA雙鏈的切割。然而在靶基因上往往存在多個可設(shè)計(jì)和識別的gRNA位點(diǎn)，但是每個gRNA介導(dǎo)的Cas9對DNA切割效率并不一致。由于受體材料為離體胚胎，體外操作具有很高的死亡率，所以提前對gRNA進(jìn)行活性驗(yàn)證對于利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因編輯小鼠是非常必要的。

本研究利用一種新的sgRNA驗(yàn)證手段，選取顯微注射后，囊胚期的細(xì)胞進(jìn)行特定靶點(diǎn)驗(yàn)證，并得出綜合編輯效率。該方法可以對靶位點(diǎn)活性進(jìn)行驗(yàn)證，還可以對上游制備的mRNA質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證，不僅適用于小鼠全基因組編輯時(shí)sgRNA活性篩選，也適用于基于CRISPR/Cas9技術(shù)的條件下敲除和敲入基因的提前驗(yàn)證。

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