湖北省水稻白葉枯病菌致病型分化檢測與分析

袁斌 劉友梅 黃薇 張舒 呂亮 常向前 楊小林

摘要：為了掌握湖北省水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）的致病型分化和變異動態(tài)，采集湖北省水稻種植區(qū)白葉枯病樣品分離白葉枯病菌，用含不同白葉枯病抗性基因的近等單基因系IRBB2、IRBB3、IRBB5、IRBB13、IRBB14和IR24作為鑒別寄主，采用剪葉接種，根據(jù)寄主和分離菌株的互作反應檢測病菌的致病型分化。鑒定結果表明，在湖北省水稻白葉枯病的致病型R9（SSSSSS）占鑒定菌株的46.2%，還有Unknown類型的菌株占38.5%。與前人研究結果相比，湖北白葉枯病菌致病型發(fā)生了很大的變異，主要致病型由R4變成了R9，且出現(xiàn)了以前沒有的R8（SSRSSS）類型和Unknown類型。同時，鑒定了Xa7和Xa23介導的湖北省白葉枯病菌的抗性，Xa7有2個分離菌株可以克服其抗性，而Xa23能抗所有分離菌株，因此在湖北省可以利用這2個基因進行水稻抗白葉枯病育種。

關鍵詞：水稻;白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）;致病型

中圖分類號：S435.111.4+7? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）24-0100-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.028? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： In order to understand the pathogenic differentiation and variation of Xanthomonas oryzae pv. oryzae in Hubei province，pathogenic isolates were collected from rice growing areas in Hubei province. Near isogenic lines IRBB2，IRBB3，IRBB5，IRBB13，IRBB14 and IR24 carrying different resistance genes were used to detect pathogenic differentiation. Leaf-clipping method was used to detect pathogenic differentiation of the pathogen according to the interaction between the host and the isolates. The results showed that the pathotype R9（SSSSSS） of rice bacterial blight was 46.2%，and the unknown strains were 38.5%. Compared with the results of previous studies，the pathotypes of bacterial blight in Hubei province had undergone considerable variations， and the main pathogenic form was changed from R4 to R9，with the emergence of R8 （SSRSSS） types which wasnt detected and unknown types. At the same time，Xa7 and Xa23 mediated resistance were identified. A few strains of Xa7 gene could be overcome，while Xa23 could resist all strains. Therefore，these two genes could be used in rice breeding for resistance to bacterial blight in Hubei province.

Key words： rice; Xanthomonas oryzae pv. Oryzae; pathotype

作為水稻三大病害之一的白葉枯病，曾經(jīng)造成湖北省水稻生產(chǎn)的巨大損失[1]。隨著水稻抗白葉枯病品種的應用、綜合防治措施的推廣以及環(huán)境條件的變化等，白葉枯病由以前的常發(fā)病害變成了偶發(fā)病害，致使水稻生產(chǎn)上忽略了白葉枯病的防治，所以偶發(fā)也可能造成大的損失。在先前的研究中，分析了近年來湖北省水稻主栽品種對白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）的抗性，表明多數(shù)品種只能抗白葉枯病少數(shù)株系，而對致病型強的株系大多數(shù)缺乏抗性[2]。其中的原因就有隨著白葉枯病為害下降，育種家普遍輕視針對白葉枯病的抗性育種。水稻品種對白葉枯病抗性的喪失將是導致白葉枯病暴發(fā)的潛在危險。本研究分析了湖北省白葉枯病菌致病型的變化，對白葉枯病菌致病型動態(tài)變異的監(jiān)測有利于選擇合適的抗病基因用于水稻白葉枯病抗性育種[3]。同時，分析了Xa7與Xa23這2個白葉枯病抗性基因在湖北省水稻抗白葉枯病育種上的利用價值。

1? 材料與方法

1.1? 鑒別品種與種植

選用國際水稻所育成的分別含有不同白葉枯病抗性基因的近等單基因系IRBB2（Xa2）、IRBB3（Xa3）、IRBB5（xa5）、IRBB13（xa13）、IRBB14（Xa14）和IR24（S）作為鑒別品種對分離的白葉枯病菌進行致病型檢測[4]。同時，接種IRBB7（Xa7）和CBB23（Xa23）兩個品種。

所有品種分別種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學院植保土肥研究所試驗場，每個品種種植150株左右，單本插植，肥水管理與大田相同，防蟲不防病。

1.2? 白葉枯病菌收集與分離

2013—2016年，收集湖北省水稻白葉枯病病葉，并分離病菌。采用稀釋平板法進行[5]。剪取新鮮發(fā)病的葉片中包含有病健交界處6 cm片段，用75%乙醇表面消毒30 s，轉移到0.1%氯化汞溶液中表面消毒5 min，用無菌水沖洗3次，每次1 min。剪碎處理過的葉片，置于加有1 mL滅菌水的滅菌研缽中磨碎，取100 μL溶液加入到900 μL的滅菌水中，逐級稀釋，取100 μL相應梯度的稀釋液涂于NA平板中，于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d，挑取典型的單菌落搖菌。取出一定量的菌液于滅菌的1.5 mL離心管中，加入50%的滅菌甘油，終濃度為15%，保存于? -80 ℃冰箱中備用。

1.3? 白葉枯病菌接種與調(diào)查

將保存的白葉枯病菌從-80 ℃中取出，在NA培養(yǎng)基平板上劃線，置于28 ℃培養(yǎng)3 d活化，再挑單菌落在NA培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)3 d。用滅菌水洗脫平板上菌體，利用比濁法配制成3×108 CFU/mL細菌懸浮液。采用剪葉接種法，接種完全展開的劍葉[4]。每個菌株接種各個品種10株，每個單株接種4～5片劍葉。

接種21 d后，測量接種葉片的病斑長度或估測病斑面積，參照方中達等[6]的研究結果進行抗性分級（表1）。

2? 結果與分析

2.1? 湖北省部分地區(qū)白葉枯病發(fā)病概況

2013—2016年湖北省水稻種植區(qū)白葉枯病發(fā)生很輕，大部分水稻種植區(qū)都沒有白葉枯病的發(fā)生，采集樣品的地點詳見表2。從這些樣品中分離到13個菌株，其中有6個菌株分別在2013、2015和2016年來自湖北省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所水稻試驗田，5個菌株分別于2014和2015年來自華中農(nóng)業(yè)大學水稻試驗田，而僅在2015年在黃岡黃梅采集到白葉枯病樣品。分析近年來湖北省水稻種植區(qū)白葉枯病危害減少的原因可能是：一方面大部分品種對白葉枯病菌有一定的抗性，盡管先前的研究表明湖北省主栽品種對強毒性菌株FuJ和YN1缺乏抗性[2]，但是這樣的強毒性菌株并沒有在湖北省水稻種植區(qū)傳播開來。另一方面流水在白葉枯病菌的傳播中起著重要作用，淹澇往往導致白葉枯病大面積發(fā)生。以往，湖北省各地洪澇災害頻發(fā)，近年來，大型水利設施以及各地水利設施的修建并投入使用，使得湖北省發(fā)生洪澇災害的危害大大減輕，也很大程度上減少了病菌的傳播[7，8]。

2.2? 湖北水稻白葉枯病菌在鑒別寄主上的致病型

分離到的13個菌株分別接種水稻白葉枯病抗性基因近等單基因系上的致病反應結果見表3，依據(jù)表1的反應類型，將13個菌株劃分為R8（SSRSSS）類型的有2個菌株，占所有菌株的15.4%;劃分為R9（SSSSSS）類型的有6個菌株，占所有菌株的46.2%;還有5個菌株未能劃分到相應的致病類型，占所有菌株的38.5%，根據(jù)它們對近等基因系的抗病反應又可以分為2個類型：SRSSSS和SRRSSS。其余8種類型在本次試驗中并沒有鑒定到。

先前的研究表明，湖北省水稻白葉枯病菌的優(yōu)勢致病型為R4，未發(fā)現(xiàn)R7和R8 2個致病型的菌株[9]，而本研究結果顯示R8致病型在湖北省已經(jīng)出現(xiàn)，且R9強致病小種占有優(yōu)勢，不僅如此，還有5個菌株不能歸類為已知的致病型，這5個菌株分別屬于3個不同的地方。這表明湖北省白葉枯病致病優(yōu)勢菌株已經(jīng)發(fā)生大的改變。

2.3? Xa7和Xa23白葉枯抗性基因對湖北省水稻白葉枯病菌的抗性

為了明確白葉枯抗性基因Xa7和Xa23在湖北省水稻抗白葉枯病育種上的利用價值，以及更為準確地區(qū)分白葉枯菌株的致病類型，在本試驗中增加了IRBB7和CBB23兩個品種，分別攜帶有Xa7和Xa23白葉枯抗性基因。結果（表4）表明，所測試的13個菌株對CBB23都不致病，而13WH-C和13WH-E 2個菌株對IRBB7致病，而這2個菌株在鑒別品種上鑒定為R9和R8類型，其余11個菌株表現(xiàn)為不致病。增加新的單基因系到鑒別品種中，可以提高白葉枯病菌致病型的鑒別能力，有利于對白葉枯病菌致病型的區(qū)分，為白葉枯病菌致病型的鑒定提供更為準確的信息。

2.4? 同區(qū)域不同年份分離的菌株的致病型變化

采集的病菌菌株主要來源于湖北省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所水稻試驗地6個菌株（2013、2014和2016年各2個）和華中農(nóng)業(yè)大學水稻試驗地5個菌株（2013年3個，2014年2個）。不同年份的菌株致病型存在差異。2塊試驗田里每年分離到對所有鑒別品種都致病的小種R9（SSSSSS）菌株，隨著年份的變化出現(xiàn)了以前沒有監(jiān)測到的R8類型和Unknown類型，表明田間的白葉枯病菌菌株致病型存在多樣性和變異。為了進一步明確這一點，分離更多的白葉枯病菌進行分析是有必要的。

3? 小結與討論

利用含不同單一白葉枯病抗性基因的6個水稻近等基因系鑒定白葉枯病菌的致病型，將2013—2016年湖北省水稻白葉枯病菌鑒定為R8和R9兩種類型以及Unknown類型，而R9和Unknown類型是優(yōu)勢致病型。這與以前的研究結果不同，先前的研究顯示武漢地區(qū)的優(yōu)勢致病型為R4，黃岡地區(qū)的優(yōu)勢致病型為R3、R4，而在本研究中R3、R4這2個類型沒有出現(xiàn)，還鑒定出曾經(jīng)認為沒有的R8和Unknown類型的菌株[9]。推測可能的原因是本試驗采集樣品的地點常年用來作育種基地，種植的都是育種材料，對白葉枯病菌進行了選擇，導致白葉枯病菌致病型發(fā)生了變化所致，但是這并不能解釋黃岡地區(qū)出現(xiàn)的Unknown類型。病原物致病型的變異往往導致抗病品種抗性喪失，因此，準確監(jiān)測白葉枯病致病型的變化是防止白葉枯病再次成為水稻生產(chǎn)嚴重威脅的必要保證。

本試驗結果表明，當前所用的6個單基因近等基因系對白葉枯病菌的致病型區(qū)分能力有限，不能將所有分離到的菌株鑒定到不同的致病型。試驗增加的IRBB7和CBB23 2個單基因品種，一方面增加了鑒別品系的區(qū)分能力，另一方面鑒定Xa7和Xa23 2個基因在湖北省水稻抗白葉枯病育種上的利用價值。Xa23白葉枯病抗性基因可以抗所有分離的菌株，是湖北省水稻抗白葉枯病育種可以利用的優(yōu)良抗性基因;而Xa7可以抗絕大部分白葉枯分離菌株，在育種上也是可以利用的抗性資源。

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