放線菌ＪＫ－１的鑒定及其對(duì)稻瘟病菌的抑菌活性

曾凡松 李素芹 王運(yùn)鳳 劉啟梅 向禮波 楊立軍 龔雙軍 史文琦

摘要：對(duì)放線菌菌株JK-1的形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rRNA基因序列進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，菌株JK-1為微白黃鏈霉菌變種（Streptomyces albidoflavus var.）。為明確JK-1對(duì)4種植物病原真菌，稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、棉花黃萎病菌（Verticillium alboatrum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）和水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani Kühn）的抑制活性，采用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行了抑菌活性測(cè)定。該菌株粗發(fā)酵液對(duì)4種真菌的菌絲生長(zhǎng)均有顯著抑制作用，尤其是對(duì)稻瘟病菌，抑制率達(dá)到91.14%±0.04%。進(jìn)一步對(duì)粗發(fā)酵液進(jìn)行了凍干濃縮和甲醇提取。提取液在稀釋2 000倍后對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)抑制率為53.42%±1.29%，表現(xiàn)出優(yōu)良的抑菌活性。

關(guān)鍵詞：鏈霉菌（Streptomyces）;分類鑒定;稻瘟病菌（Magnaporthe orgzae）;抑菌活性

中圖分類號(hào)：S435.111.4+1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）24-0096-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.027? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Morphological，physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence of actinomyce isolate JK-1 were analysed. It showed that isolate JK-1 belonged to Streptomyces albidoflavus var. . To evaluate the inhibiting activities of isolate JK-1 against four plant fungal pathogens，the rice blast fungus（Magnaporthe oryzae），the cotton verticillium wilt pathogen （Verticillium alboatrum），the fusarium head blight pathogen （Fusarium graminearum） and rice sheath blight pathogen （Rhizoctonia solani Kühn），antifungal activity assays were performed using mycelium growth rate method. The crude fermentation liquid showed strong inhibiting activity against the four pathogens，especially M. oryzae with inhibitory rate of 91.14%±0.04%. The crude fermentation liquid was concentrated by freeze drying，and then extracted with methanol. The diluted methanol extraction of fermentation liquid with 2 000 times exhibited a significant inhibitory effect on mycelium growth of M. oryzae with inhibiting rate of 53.42%±1.29%.

Key words： Streptomyces; classification and identification; the rice blast fungus （Magnaporthe oryzae）; antimicrobial activity

由稻梨孢（Magnaporthe orgzae）引起的水稻稻瘟病是水稻生產(chǎn)上的重要病害之一[1]。種植抗病品種和施用化學(xué)藥劑是防治該病害最主要的兩種措施。由于病原菌小種頻繁發(fā)生變異，導(dǎo)致抗病品種抗性被克服。在這種情況下，施用殺菌劑在減少經(jīng)濟(jì)損失方面發(fā)揮了重要作用[2]。在目前防治稻瘟病的藥劑中，化學(xué)藥劑占據(jù)了主導(dǎo)地位，例如稻瘟凈、異稻瘟凈和三環(huán)唑等。然而，這些藥劑的長(zhǎng)期施用使病原菌對(duì)藥劑產(chǎn)生了抗藥性[3，4]，給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)了巨大壓力。開(kāi)發(fā)新型環(huán)境友好型藥劑將有助于解決這一問(wèn)題。

放線菌是一類能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)的微生物資源，尤其是鏈霉菌（Streptomyces），在開(kāi)發(fā)稻瘟病生物防治藥劑中具有巨大潛力[5]。鏈霉菌產(chǎn)生的活性化合物對(duì)稻瘟病菌的抑制作用包括抑制分生孢子萌發(fā)，導(dǎo)致分生孢子畸形，抑制菌絲生長(zhǎng)，誘發(fā)寄主細(xì)胞過(guò)敏性壞死反應(yīng)，提高水稻抗病性等[6-10]。而且，鏈霉菌產(chǎn)生的化合物是天然合成的，大部分也是可降解化合物，因此對(duì)環(huán)境是友好的[11]。本研究以從藥用植物藍(lán)花鼠尾草（Salvia farinacea）中分離的放線菌JK-1為材料，對(duì)其進(jìn)行了分類鑒定和對(duì)稻瘟病菌的活性測(cè)定，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型環(huán)境友好型農(nóng)藥提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 菌種和培養(yǎng)基

菌株JK-1：系由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所實(shí)驗(yàn)室從藍(lán)花鼠尾草葉組織中分離獲得的1株內(nèi)生放線菌[12]。抑菌活性測(cè)定使用的靶標(biāo)菌包括稻瘟病菌（M. oryzae）、棉花黃萎病菌（Verticillium alboatrum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）和水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani Kühn），均由該實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)基：LB和PDA按常規(guī)方法制作，酵母膏-麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基（ISP2）、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基（ISP3）、無(wú)機(jī)鹽-淀粉瓊脂培養(yǎng)基（ISP4）、甘油-天門(mén)冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基（ISP5）和高氏1號(hào)培養(yǎng)基的制作參考文獻(xiàn)[13];發(fā)酵用種子培養(yǎng)基（1 L）：麥精10 g，玉米粉10 g，酵母提取物4 g，NH4SO4 5 g，NaCl 5 g和CaCO3 5 g，并調(diào)節(jié)pH至6.8±0.1。生產(chǎn)用培養(yǎng)基配方與種子培養(yǎng)基配方相同。

1.2? 菌株的鑒定

放線菌形態(tài)學(xué)觀察、培養(yǎng)特征和生理生化特征分析參照文獻(xiàn)[13]和文獻(xiàn)[14]執(zhí)行。電鏡觀察參照Williams等[15]的方法在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)電鏡室進(jìn)行。16S rRNA基因序列的擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建參照張志斌等[16]的方法執(zhí)行。其中PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min;35個(gè)循環(huán)包括94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，? 72 ℃ 1 min;72 ℃ 10 min;4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后連接到pMD18-T載體（大連寶生物科技有限公司），并送北京鼎國(guó)生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3? 菌種發(fā)酵及發(fā)酵液提取物的制備

1.3.1? 發(fā)酵? 將菌種接種到ISP2培養(yǎng)基斜面上，28 ℃培養(yǎng)72 h，用無(wú)菌水洗下，孢子濃度為1.0×108 CFU/L。將孢子懸浮液接種到30 mL的種子培養(yǎng)基中，接種比例為1∶10。28 ℃，180 r/min搖培48 h，作為種子液。將種子液接種到300 mL生產(chǎn)培養(yǎng)基中，接種比例為1∶10，180 r/min搖培96 h進(jìn)行擴(kuò)大發(fā)酵。

1.3.2? 發(fā)酵液提取物的制備? 將含菌體的發(fā)酵液在凍干機(jī)上凍干后，在液氮中研磨成粉并稱重。取10 g干粉，加入100 mL水飽和正丁醇，攪拌1 h。常溫下10 000 g離心10 min。取上清液在50 ℃條件下將正丁醇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，最后將浸膏用10 mL的甲醇溶解，獲得發(fā)酵液抽提物，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4? 生物活性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)靶標(biāo)菌進(jìn)行生物活性的測(cè)定。將發(fā)酵液按1∶9比例與PDA培養(yǎng)基混合制備含藥培養(yǎng)基，參照張志斌等[16]的方法進(jìn)行菌落直徑測(cè)定。其中抑制率=[（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）]×100%。將發(fā)酵液抽提物用無(wú)菌水稀釋10、50和200倍后，同樣按1∶9比例配成含藥培養(yǎng)基（即終濃度稀釋100、500和2 000倍），測(cè)定抑制率。每處理重復(fù)3次。以無(wú)菌水作陰性對(duì)照。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 內(nèi)生放線菌JK-1的鑒定

2.1.1? 形態(tài)觀察? 在ISP2培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，在普通光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下觀察其形態(tài)特征（表1，圖1）。該菌株產(chǎn)生的灰白色橢圓形孢子，大小為0.6 μm×1.4 μm，孢子鏈直立或微曲，表面光滑但有凹陷?；鶅?nèi)菌絲黑色，直徑約0.8 μm。

2.1.2? 培養(yǎng)特征? 菌株JK-1在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況如表2所示。該菌株在ISP2和LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛。在ISP2培養(yǎng)基上形成灰白色氣生菌絲和黑色基內(nèi)菌絲，并在培養(yǎng)基中形成可溶性褐色色素。該菌株在ISP3、ISP4、ISP5和高氏1號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況不良，且不產(chǎn)生可溶性色素。根據(jù)以上形態(tài)和培養(yǎng)特征判斷，JK-1屬于鏈霉菌屬放線菌。

2.1.3? 生理生化特征? 菌株JK-1能夠利用D-葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，但不能利用D-木糖、D-樹(shù)脂醛糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-果糖、棉子糖、D-甘露醇、肌醇和D-水楊苷。氮源利用測(cè)試結(jié)果表明，JK-1能夠利用半胱氨酸，但不能利用纈氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、KON3、精氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、絲氨酸和甲硫氨酸等9種氮源（表3）。

菌株JK-1能夠液化明膠，使牛奶產(chǎn)生胨化現(xiàn)象且凝固，能水解淀粉，但不產(chǎn)生H2S，不具有果膠酶活性，不能水解油脂（表4）。菌株JK-1能夠抵抗多種抗生素，包括氨芐青霉素（10 μg）、羧芐青霉素（100 μg）、多黏菌素E（10 μg）、紅霉素（15 μg）、兩性霉素B（100 μg）和制霉菌素（100 μg）。菌株JK-1能夠耐受不超過(guò)8.0%的NaCl、0.000 1%的結(jié)晶紫和0.1%的苯酚。

2.1.4? 16s rRNA序列分析? 經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了大約1 500 bp的條帶，經(jīng)回收，測(cè)序和序列拼接，獲得了1 494 bp的16s rRNA堿基序列。將序列在NCBI網(wǎng)站上與其他物種核苷酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。在比對(duì)一致性>99%的序列中，以白色鏈霉菌（Streptomyces albus）為外圍菌，選取另外7種菌株的16s rRNA堿基序列進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。如圖2所示，菌株JK-1與昌帕瓦特鏈霉菌（Streptomyces champavatii）和微白黃鏈霉菌（Streptomyces albidoflavus）的親緣關(guān)系最近。

2.2? 菌株JK-1發(fā)酵液及其粗提物的抑菌活性

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了菌株JK-1對(duì)4種植物病原真菌的抑制率。結(jié)果（表5）表明，菌株JK-1的發(fā)酵液對(duì)4種病原菌均具有抑制活性。其中，對(duì)水稻稻瘟病菌的抑制效果最好，抑制率達(dá)到91.14%±0.04%。將包含菌體的發(fā)酵液凍干后取10 g凍干粉進(jìn)行正丁醇抽提，提取浸膏經(jīng)甲醇溶解后獲得10 mL的甲醇溶液。將甲醇提取液稀釋100、500和2 000倍后測(cè)定其對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率。結(jié)果（圖3）表明，稀釋100和500倍后的抑制率分別為78.93%±1.33%、58.50%±1.48%。稀釋2 000倍后對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)仍有抑制效果（抑制率為53.42%±1.29%），對(duì)菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)出較好的抑制活性。

3? 小結(jié)與討論

放線菌來(lái)源廣泛，其中對(duì)稻瘟病菌有拮抗活性的鏈霉菌國(guó)內(nèi)外已有很多報(bào)道。例如，從湖水沉淀中分離出了對(duì)稻瘟病菌有拮抗活性的酒紅土褐鏈霉菌（Streptomyces vinaceusdrappus），它對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率為53.5%[17]。從紅椒根基土壤中分離的泥蜂鏈霉菌（Streptomyces philanthi）對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)到88.7%[18]。而且，從植物中也發(fā)現(xiàn)了類似的菌株。例如，從水稻中分離的內(nèi)生白色鏈霉菌（Streptomyces albus）菌株OsiSh-10[7]、米修鏈霉菌（Streptomyces misionensis）菌株Osi Rt-1[9]和黃三素鏈霉菌（Streptomyces flavotricini）[19]。此外，來(lái)自藥用植物的內(nèi)生放線菌具有豐富的多樣性，且對(duì)多種細(xì)菌和真菌具有抑制活性[20]。但目前還沒(méi)有從藥用植物中分離到對(duì)稻瘟病菌有活性的鏈霉菌。本研究對(duì)來(lái)自藥用植物藍(lán)花鼠尾草組織中的鏈霉菌菌株JK-1進(jìn)行了抑菌活性研究，明確了其發(fā)酵液和抽提物對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)具有顯著抑制活性。這不僅豐富了稻瘟病菌拮抗放線菌的來(lái)源，而且為稻瘟病生物防治藥劑的開(kāi)發(fā)提供了更多的候選資源。

16s RNA序列分析表明，菌株JK-1與昌帕瓦特鏈霉菌和微白黃鏈霉菌親緣關(guān)系最近。根據(jù)文獻(xiàn)[13]，將菌株JK-1的形態(tài)特征和生理生化反應(yīng)特征與昌帕瓦特鏈霉菌和微白黃鏈霉菌進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)JK-1與微白黃鏈霉菌相似，但又存在差異。例如，JK-1產(chǎn)生黑色色素，不利用D-木糖、D-果糖和D-甘露醇，能夠使牛奶固胨等。因此，將JK-1鑒定為微白黃鏈霉菌變種（Streptomyces albidoflavus var.）。微白黃鏈霉菌產(chǎn)生的鏈絲菌素（Streptothricin）具有抗細(xì)菌和真菌活性[21]。這類鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物能夠抑制尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）等多種植物病原菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，其活性成分可能為抗霉素類物質(zhì)[22，23]。測(cè)定菌株JK-1發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)其他病原細(xì)菌和真菌等有害生物的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)其他靶標(biāo)有害生物的抑制作用將進(jìn)一步完善其殺菌譜，從而擴(kuò)寬其應(yīng)用前景。對(duì)發(fā)酵液中的活性化合物進(jìn)一步分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，有望獲得具有應(yīng)用價(jià)值的天然產(chǎn)物，為新型農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)提供可能的先導(dǎo)化合物。

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