里氏木霉發(fā)酵培養(yǎng)基的響應面法優(yōu)化

饒犇 周榮華 閔勇 廖先清 劉芳 陳偉 龍同 張光陽

摘要：為了得到里氏木霉（Trichoder mareesei）發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基，應用Plackett-Burman設計法對影響里氏菌絲體產量的關鍵因子進行了篩選，并進一步采用響應面分析法對影響菌絲產量的關鍵因素最佳水平進行了研究。結果表明，影響里氏木霉菌絲體產量的關鍵因素為魚蛋白胨和甘油的濃度。通過響應面分析法的擬合和推算，得到在魚蛋白胨和甘油濃度分別為1.414 3和2.439 3 g/100 mL時模型預測發(fā)酵最佳產量為85 g/100 mL，驗證值為81 g/100 mL，預測值與驗證值吻合較好，約是原始培養(yǎng)基產量（60 g/100 mL）的1.35倍。

關鍵詞：里氏木霉（Trichoder mareesei）;Plackett-Burman設計法;響應面分析法

中圖分類號：Q813.1? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）24-0081-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.022? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： In order to obtain the optimal medium composition for Trichoder mareesei production， the Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of variables， and the optimum levels of key factors affecting mycelium yield were conducted by response surface analysis methodology. The results showed that， the optimal values of the two parameters determined by response surface analysis methodology were fish peptone 1.414 3 g/100 mL and glycerol 2.439 3 g/100 mL. At this point，the model predicted optimal fermentation yield was 85 g/100 mL， and the verified value was 81 g/100 mL，and they were in agreement and it was about 1.35 times the yield of the original medium （60 g/100 mL）.

Key words： Trichoder mareesei; Plackett-Burman design; response surface analysis methodology

絲狀真菌里氏木霉（Trichoder mareesei）是多細胞的真核微生物，紅褐肉座菌（Hypocrea jecorina）的無性型，隸屬于叢梗孢目（Moniliales）木霉屬（Penicillium）。其作為工業(yè)菌株用于生產分解不同植物材料的酶類，包括纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等，已有多年歷史。研究高產里氏木霉的液體發(fā)酵條件尤為重要。

本試驗利用響應面法對里氏木霉發(fā)酵的關鍵因素進行了優(yōu)化。從Plackett-Burman試驗可以得知，魚蛋白胨和葡萄糖對里氏木霉的菌絲產量影響顯著，所以利用響應面試驗設計以這兩個因素為自變量，以里氏木霉菌絲量為響應值，通過Minitab 15軟件對試驗數據進行多項式回歸分析，建立多元二次回歸方程，利用方差分析模型和各因子的顯著性獲得里氏木霉液體發(fā)酵工藝的最佳參數，以期為里氏木霉制劑的開發(fā)提供參考[1-6]。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1）菌株。里氏木霉是湖北省生物農藥工程研究中心生物技術研究室分離保存，能夠拮抗多種植物病害，保存于-80 ℃超低溫冰箱。

2）培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，2%瓊脂;種子培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基;發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖0.5 g/100 mL、豆粕0.2 g/100 mL、魚蛋白胨1.0 g/100 mL、甘油0.5 g/100 mL、玉米漿1.0 g/100 mL;后期采用優(yōu)化后的配方。

1.2? 方法

1）發(fā)酵培養(yǎng)條件。接種體積分數5%，發(fā)酵溫度30 ℃，搖床轉速200 r/min，發(fā)酵96 h。

2）Plackett-Burman試驗。采用Minitab的Plackett-Burman兩水平法對培養(yǎng)基成分進行考察，篩選影響棘孢木霉生物量的重要因素，確定最佳配方。設計水平和排列方式見表1。

3）最陡爬坡試驗。根據Plackett-Burman試驗得出的擬合方程安排最陡爬坡試驗來確定因素取值中心點。擬合方程中各變量系數確定爬坡方向和變化步長，另外步長確定亦與試驗條件相關。

4）中心組合設計和響應面分析。對Plackett-Burman試驗確定的因素，以最陡爬坡試驗得到中心點，根據中心組合設計原理安排響應面試驗獲得重要因素的最佳配方水平。根據中心組合設計結果來擬合數據，得到描述響應值和自變量之間關系的二階模型，即：

其中，Y是產物能力測量值，b0是截距，bi是關鍵因素線性效果的系數，bii是關鍵因素的二次效應的系數，bij是關鍵因素間交互作用的系數。

根據擬合的數學模型以及方差分析的結果評價每個因子及其交互作用對過程的影響程度，利用響應面圖和等高線圖直觀地描繪其結果，同時利用擬合的數學方程求解最優(yōu)結果。

5）培養(yǎng)基優(yōu)化結果驗證試驗。用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵結束后測定發(fā)酵液中的菌絲重量。

2? 結果與分析

2.1? Plackett-Burman試驗結果

根據前期研究結果，確定以葡萄糖和甘油為碳源，以魚蛋白胨、玉米漿和豆粕為氮源，共5種因素（X1：葡萄糖;X2：豆粕;X3：魚蛋白胨;X4：甘油;X5：玉米漿）一起進行Plackett-Burman設計試驗，設計方案和試驗結果見表1。

由T檢驗結果可知，魚蛋白胨和甘油對里氏木霉的菌絲生長具有顯著影響，可信度在95%以上。且兩者對里氏木霉的菌絲生長影響是負效應。

由上述Plackett-Burman試驗得到的回歸方程如下：

Y=49+0.042X1+2.11X2+5.6X3+5.8X4+0.46X5，方程擬合的相關性為R2=0.953 4，表明此多項式方程很好地模擬和解釋了Plackett-Burman的試驗結果。

2.2? 最陡爬坡試驗結果

找到對產物發(fā)酵影響最大的因素后，需要進一步對這些因素進行分析。最速上升法以前述Plackett-Burman設計試驗得到的一次方程為基礎，以相應因素的系數比為基準進行步移，直到步移至最高點，然后以最高點附近的范圍作為響應面優(yōu)化的相應范圍。從Plackett-Burman設計試驗得到方程中魚蛋白胨和甘油的系數（X1∶5.6;X2∶5.8），可以得到這兩個因素步移的步長比為1∶1，即當魚蛋白胨步移1個單位（0.2 g/L）時，甘油也步移1個單位（0.2 g/L）。以Plackett-Burman設計中的中心點作為步移的起點，試驗設計與試驗結果如表2所示。從試驗結果可以看出，里氏木霉菌絲體的產量在步移進行至第三步時達到最高點，之后里氏木霉菌絲體產量開始下降。步移最高點時魚蛋白胨和甘油的濃度分別為1.00和1.26 g/L，這一點被用作下一步響應面分析的中心點。

2.3? 中心組合設計試驗結果

根據以上兩水平Plackett-Burman試驗可知，影響里氏木霉生物量的兩個重要因素分別是魚蛋白胨和甘油。根據中心優(yōu)化組合方法，試驗設計及結果見表3，共13組試驗。

以魚蛋白胨和甘油為自變量，以里氏木霉的菌絲體濕重為響應值，根據分析結果得到的二次多項式回歸方程為Y=84.98+0.583 4X1+3.555 5X2-5.971 2X12-9.071 3X22+1.975X1X2，Y為響應值，X1為魚蛋白胨，X2為甘油。利用Minitab軟件響應優(yōu)化器進行計算可得，最大值處X1=1.414 3 g/100 mL，X2=2.439 3 g/100 mL，在此條件下理論預測得到的值為85 g/100 mL。

2.4? 最佳培養(yǎng)基的驗證

為了確定試驗結果的可靠性，對上述優(yōu)化條件進行了驗證試驗，共進行3組平行試驗，結果表明，里氏木霉的菌絲體產量為81 g/100 mL，與預測值十分接近。

3? 小結

對里氏木霉生長培養(yǎng)基進行了優(yōu)化研究，得到最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖2 g/100 mL、豆粕1 g/100 mL、魚蛋白胨1.414 3、甘油2.439 3、玉米漿1 g/100 mL。在此條件下，里氏木霉的菌絲體理論最高產量為85 g/mL，驗證試驗中最高值為81 g/100 mL，與理論預測值相符，約是優(yōu)化前實際產量（60 g/100 mL）的1.35倍。

參考文獻：

[1] 張保元，許夢秋，謝響明.粉紅粘帚霉67-1液體發(fā)酵生產生物農藥概述[J].現代農業(yè)科學，2009，16（3）：20，31.

[2] 鄒? 勇，文成敬，唐貴群，等.幾個因素對木霉菌株T-33產生厚垣孢子的影響[J].微生物學通報，2006，33（4）：43-47.

[3] 宋文婧，劉振邦，朱? 虹，等.十種蟲生真菌液體培養(yǎng)芽生孢子的形態(tài)發(fā)生[J].菌物學報，2011，30（4）：572-579.

[4] 高克祥，項存悌，駱會欣，等.木霉菌株T-（88）生物學特性的研究[J].東北林業(yè)大學學報，1995，23（2）：33-39.

[5] 陳建愛，肖? 敏，王未名，等.木霉誘變菌株發(fā)酵條件研究[J].核農學報，2002，16（5）：305-309.

[6] 莊敬華，高增貴，劉? 限，等.不同發(fā)酵條件對木霉產孢類型的影響[J].中國生物防治，2005，21（1）：37-40.