轉(zhuǎn)基因技術(shù)在家蠶中的應(yīng)用研究進(jìn)展

吳凡 李德臣 郝瑜 肖勝武 陳登松

摘要：概括了家蠶（Bombyx mori Linaeus）轉(zhuǎn)基因的方法，綜述了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在家蠶相關(guān)領(lǐng)域中的研究進(jìn)展，展望了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在家蠶研究上的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：家蠶（Bombyx mori Linaeus）;轉(zhuǎn)基因技術(shù);應(yīng)用;研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：S881.2+4? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）24-0015-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.004? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： The transgenic methods of silkworm（Bombyx mori Linaeus） were discribed. The research progress of transgenic technology in silkworm was summarized，and the application prospect of transgenic technology in silkworm research was prospected.

Key words： silkworm （Bombyx mori Linaeus）; transgenic technology; application; the research progress

轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展迅速，作為研究動(dòng)植物遺傳變異和基因功能的主要輔助手段，已經(jīng)成為生物技術(shù)研究的核心領(lǐng)域。家蠶（Bombyx mori Linaeus）作為重要的鱗翅目經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，在中國(guó)具有悠久的歷史，自2004年家蠶基因組發(fā)布以來(lái)，大量基礎(chǔ)研究結(jié)果的積累使家蠶已經(jīng)成為研究真核生物基因表達(dá)調(diào)控的模式生物之一[1-5]。Inagaki等[6]研究發(fā)現(xiàn)蠶的藥代動(dòng)力學(xué)特征與哺乳動(dòng)物類似，注入各種肝毒素的化學(xué)物質(zhì)也會(huì)在家蠶的血淋巴中觸發(fā)高丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性，而且綠色熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)基因家蠶可以通過(guò)觀察蠶體表GFP熒光強(qiáng)度的減弱對(duì)注射的化學(xué)物質(zhì)的時(shí)間和劑量進(jìn)行分析，而不需要連續(xù)收集血淋巴，說(shuō)明家蠶可以作為替代動(dòng)物模型評(píng)價(jià)藥物引起的組織損傷。家蠶因?yàn)榫哂猩芷诙獭曫B(yǎng)簡(jiǎn)單、易于繼代等的特點(diǎn)，所以以家蠶作為主要研究對(duì)象，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究真核生物體內(nèi)基因的表達(dá)調(diào)控、基因功能和利用外源基因?qū)倚Q的遺傳特性進(jìn)行改良[7]，成為很多學(xué)者的關(guān)注目標(biāo)。

1? 家蠶轉(zhuǎn)基因方法

轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgene technology）是指采用基因工程技術(shù)將人工分離或合成的外源DNA片段轉(zhuǎn)入到特定的生物個(gè)體中，與其本身的基因組進(jìn)行重組，再?gòu)闹羞M(jìn)行數(shù)代的人工選育，從而獲得具有穩(wěn)定表達(dá)特定遺傳性狀的個(gè)體。該技術(shù)可以使重組生物表現(xiàn)人們所期望的新性狀，可以利用該技術(shù)進(jìn)行家蠶品種選育研究，培育新的家蠶品種。目前，在家蠶的轉(zhuǎn)基因技術(shù)上發(fā)展了很多的研究方法，主要有顯微注射法、脂質(zhì)體法、精子介導(dǎo)法、電穿孔法、壓力滲透法、基因槍法、扎卵法等，其中顯微注射法在家蠶的轉(zhuǎn)基因研究上應(yīng)用最多。

1.1? 顯微注射法

顯微注射法是利用玻璃微量注射針將外源DNA片段直接注射到原核期胚胎或培養(yǎng)的細(xì)胞中，使其在宿主基因組序列中順利表達(dá)，從而獲得能穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因個(gè)體的一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)。利家蠶的顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)是1990年由日本學(xué)者Tamura 等[8]建立的，并成功獲得了轉(zhuǎn)基因家蠶個(gè)體。

Sun等[9]利用RNAi顯微注射法獲得了具有濃核病抗性的轉(zhuǎn)基因家蠶BDV1-I和BDV2-I，這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因家蠶因濃核病的死亡率分別降低了45%和39%。Zhao等[10]利用胚胎顯微注射法將轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)載體BmPGRP-S2轉(zhuǎn)入到家蠶中，獲得了轉(zhuǎn)基因家蠶PGRPS2-1和PGRPS2-2，在轉(zhuǎn)基因家蠶中成功表達(dá)了BmPGRP-S2，轉(zhuǎn)基因家蠶PGRPS2-1和PGRPS2-2的死亡率分別降低了36%和32%。Jiang等[11]通過(guò)顯微注射法將Bmlipase-1增量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因載體注射家蠶品種大造，獲得轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)LI-A和LI-B。

1.2? 精子介導(dǎo)法

精子介導(dǎo)法是利用精子能瞬間吸收外源DNA的能力，把精子作為外源基因的載體，與外源DNA進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，使精子攜帶外源DNA，通過(guò)受精過(guò)程將外源DNA整合于受精卵的染色體中。郭秀洋等[12]構(gòu)建了質(zhì)粒pFbGFP，利用精子介導(dǎo)法向家蠶導(dǎo)入質(zhì)粒，獲得了轉(zhuǎn)基因個(gè)體，證明該方法可有效導(dǎo)入外源基因。Zhou等[13]將新霉素抗性基因（neo（R））和綠色熒光蛋白基因融合到轉(zhuǎn)座子載體piggyBac上，采用精子介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入家蠶中，發(fā)現(xiàn)熒光蛋白的表達(dá)率為72.7%，Southern印跡分析表明了抗性基因的表達(dá)。

1.3? 其他方法

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法是利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能通過(guò)靜電作用將DNA包裹，形成的DNA-脂復(fù)合體再被帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜吸附，形成一種微囊結(jié)構(gòu)，通過(guò)膜的融合作用將外源DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。Lee等[14]為了解超聲輻射治療在家蠶上的應(yīng)用，比較了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、超聲孔轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體結(jié)合超聲孔轉(zhuǎn)染的效率，發(fā)現(xiàn)一種熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒被轉(zhuǎn)移到剛蛻變的蠶蛹的血腔中，也被轉(zhuǎn)移到其他組織中，熒光素酶活性測(cè)定結(jié)果顯示，脂質(zhì)體結(jié)合超聲孔轉(zhuǎn)染的效率是單純脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和超聲孔轉(zhuǎn)染的6倍。吳雪鋒等[15]利用脂質(zhì)介導(dǎo)法將構(gòu)建好的家蠶轉(zhuǎn)基因載體piggyBacA3EG轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)胚胎細(xì)胞SWAU1-BmE，轉(zhuǎn)染后48 h可在熒光顯微鏡下觀察到發(fā)綠色熒光的細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)也能在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的cDNA中擴(kuò)增出EGFP片段。

2? 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在家蠶中的應(yīng)用領(lǐng)域

2.1? 家蠶基因功能的研究

轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以進(jìn)行基因的過(guò)量表達(dá)或者是使基因沉默，造成基因功能的缺失，成為研究家蠶基因功能的重要方法之一。Sakai等[16]通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法在轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)內(nèi)強(qiáng)制表達(dá)Masc-R基因，在幼蟲(chóng)階段造成雌性個(gè)體死亡，雜合的轉(zhuǎn)基因雌性個(gè)體表達(dá)雄性特異蛋白ImpM和Bmdsx，卵巢發(fā)育異常，結(jié)果表明Masc-R基因主要是決定家蠶雄性。Liu等[17]通過(guò)顯微注射的方法將構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體BmAtlastin-n注射到家蠶卵中，獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶具有BmNPV的抗性，說(shuō)明BmAtlastin-n對(duì)提高家蠶BmNPV的抗性起到重要作用。在家蠶的Bmdsx基因含有一個(gè)新的C端，且在家蠶的雄性個(gè)體中特異性表達(dá)，為確定其C端的作用，Duan等[18]構(gòu)建了兩個(gè)家蠶轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)，使雄性個(gè)體中該基因的表達(dá)異常，對(duì)W染色體進(jìn)行特異的PCR分析和表型觀察沒(méi)有發(fā)現(xiàn)發(fā)育異常和性別翻轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，定量PCR分析發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因雄性個(gè)體中SP1和Vg在脂肪體中的表達(dá)上調(diào)，PBP在觸角中的表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明Bmdsx基因的C端通過(guò)調(diào)控下游基因表達(dá)而使該基因參與到家蠶的性別發(fā)育中。Zheng等[19]用非轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因載體pIZT-B8將含有Orgyia pseudotsugata核型多角體病毒IE2啟動(dòng)子的BBX-B8基因轉(zhuǎn)入到家蠶中，獲得了BBX-B8過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因家蠶，與非轉(zhuǎn)基因家蠶相比，轉(zhuǎn)基因家蠶的發(fā)育延遲2.5～3.5 d，雌性個(gè)體的繭層量減少4.79%，雄性個(gè)體的繭層量減少7.44%，轉(zhuǎn)基因雌性蛹的質(zhì)量減少6.75%，雄性蛹減少13.83%，結(jié)果表明BBX-B8基因?qū)倚Q的發(fā)育、絲蛋白的合成和卵的滯育具有重要作用。

Wang等[20]在2A裂解肽的基礎(chǔ)上建立了一個(gè)多基因表達(dá)系統(tǒng)（MGES），通過(guò)顯微注射法使該系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因家蠶中表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因家蠶系統(tǒng)，在轉(zhuǎn)基因家蠶MGES系統(tǒng)可以同時(shí)調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)和絲腺靶基因的裂解，且甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸間隔物（GSG）可有效提高2A的裂解效率，P2A-GSG成功裂解人造人類血清白蛋白（66 ku）與人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（20.2 ku）融合基因和家蠶卵黃蛋白受體片段（196 ku）與EGFP融合基因，結(jié)果表明MGES系統(tǒng)是進(jìn)行基因功能研究的有力手段，并為功能性絲制材料在醫(yī)藥、化妝品和其他生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的利用開(kāi)拓新的用途。

2.2? 生物反應(yīng)器

與其他動(dòng)植物相比，家蠶作為生物反應(yīng)器更具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榧倚Q具有生命周期短，容易飼養(yǎng)，飼養(yǎng)成本低，合成的蛋白量高，而且表達(dá)的蛋白純度高等特點(diǎn)。自從轉(zhuǎn)基因家蠶成功以來(lái)，其很快就被發(fā)展為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)人類結(jié)合蛋白，包括單克隆抗體[21-23]、細(xì)胞因子[24，25]和膠原蛋白[26]。Kurihara等[27]以piggyBac為載體構(gòu)建了絲蛋白H-chain表達(dá)系統(tǒng)，在轉(zhuǎn)基因家蠶的蠶繭中產(chǎn)生重組蛋白，由家蠶絲素重鏈基因啟動(dòng)子調(diào)控FeIFN/H-chain融合基因的表達(dá)，表明轉(zhuǎn)基因家蠶H-chain表達(dá)系統(tǒng)能作為一個(gè)產(chǎn)生活性重組蛋白和絲生物材料的平臺(tái)。

Wang等[28]將重組人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（r-haFGF）基因轉(zhuǎn)入到家蠶中，利用家蠶的絲腺表達(dá)r-haFGF蛋白，獲得轉(zhuǎn)基因家蠶系統(tǒng)，且轉(zhuǎn)基因家蠶r-haFGF蛋白的表達(dá)量與非轉(zhuǎn)基因家蠶系統(tǒng)相比提高了5.6倍，有利于該蛋白的純化和大量生產(chǎn)，這一研究結(jié)果說(shuō)明家蠶的絲腺可以有效表達(dá)有活力的重組haFGF蛋白。Nikaido等[29]在轉(zhuǎn)基因家蠶的脂肪體中建立了一個(gè)鑒定新型類鴉片活性肽μ-受體的配體篩選系統(tǒng)，表達(dá)μ-受體-Gi1α融合蛋白，成功鑒定出一個(gè)新的結(jié)構(gòu)性復(fù)合物，命名為GUM1。Sumitani等[30]為建立家蠶組織特異的細(xì)胞死亡系統(tǒng)，用Gal上游啟動(dòng)子序列作為啟動(dòng)子，構(gòu)建了在特定組織過(guò)表達(dá)老鼠BAX基因（mBax）的轉(zhuǎn)基因家蠶系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因家蠶內(nèi)表達(dá)的mBax可以誘導(dǎo)家蠶絲腺、脂肪體和感覺(jué)細(xì)胞的特異性死亡。占鵬飛等[31]通過(guò)piggyBac轉(zhuǎn)座子及顯微注射方法將Ⅰ型類人膠原蛋白基因（Hcool-I）和膠原蛋白羥基化修飾所必需的脯氨酰4-羥化酶α-亞基基因（BmP4Hα）轉(zhuǎn)入家蠶早期胚胎，這兩個(gè)基因受絲素輕鏈基因fib-L啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，在轉(zhuǎn)基因家蠶幼蟲(chóng)后部絲腺中獲得表達(dá)。

2.3? 家蠶品種的選育

轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)與傳統(tǒng)的育種技術(shù)相比具有很多優(yōu)點(diǎn)，更有利于新品種的選育，如可以打破物種間固有的遺傳屏障，克服物種遺傳壁壘，可針對(duì)目標(biāo)性狀查明決定基因或基因群，利用生物技術(shù)將其導(dǎo)入目標(biāo)群體，快速精準(zhǔn)地實(shí)現(xiàn)特定性狀的改良，縮短育種周期，已成為動(dòng)植物遺傳育種的主要技術(shù)手段。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，蠶業(yè)生產(chǎn)上對(duì)特殊用途家蠶新品種的需求越來(lái)越迫切，傳統(tǒng)的育種方法已經(jīng)不能完全滿足蠶業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的需要，加之家蠶基因組框架圖的完成，都有力地促進(jìn)了家蠶轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)的發(fā)展。

Jiang等[11]通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得兩個(gè)過(guò)表達(dá)Bmlipase-1的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)LI-A和LI-B，4齡起蠶添食BmNPV后，發(fā)現(xiàn)LI-A的死亡率比野生型大造降低33%，表明轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)對(duì)BmNPV的抗性增強(qiáng)，而且其經(jīng)濟(jì)性狀沒(méi)有受到影響。Dong等[32]構(gòu)建了表達(dá)CRISPR/Cas的家蠶轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)和以家蠶核型多角體病毒（BmNPV）為目標(biāo)的sgRNA，以調(diào)節(jié)家蠶早期基因的表達(dá)，通過(guò)G1代雜交獲得了4個(gè)轉(zhuǎn)基因雜交系，結(jié)果證明Cas9（C）/sgRNA（C）轉(zhuǎn)基因系對(duì)核型多角體病毒的半致死劑量（LD50）提高了1 000倍，而且雜交后代的經(jīng)濟(jì)性狀與正常水平無(wú)顯著差異。劉輝芬等[33]利用DNA重組技術(shù)將1 600 bp的人工蜘蛛拖牽絲蛋白基因連接至piggyBac轉(zhuǎn)座子載體，構(gòu)建蜘蛛拖牽絲蛋白基因表達(dá)質(zhì)粒，成功在家蠶5齡幼蟲(chóng)的后部絲腺中特異性表達(dá)人工蜘蛛拖牽絲蛋白基因。李軍等[34]利用家蠶資源庫(kù)中的突變基因，采用系統(tǒng)選育、雜交育種、將目的基因定向?qū)敕ǖ扔N手段導(dǎo)入了與活性物質(zhì)黃酮類產(chǎn)生有關(guān)的基因，育成了絲膠繭蠶品種，使該品種產(chǎn)生的絲膠中含有特殊的功能性活性物質(zhì)。

3? 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在家蠶中的研究展望

隨著分子遺傳學(xué)和分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展與進(jìn)步，越來(lái)越多的新技術(shù)、新成果不斷被應(yīng)用于遺傳育種領(lǐng)域[35]。自從家蠶基因組完成測(cè)序以來(lái)，家蠶的研究進(jìn)入了后基因組時(shí)代，家蠶基因的表達(dá)芯片、蛋白質(zhì)組、代謝組、遺傳變異圖譜等陸續(xù)獲得解析[36]，進(jìn)一步推動(dòng)了家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展。利用家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在家蠶的產(chǎn)量、質(zhì)量、抗性等方面累積了大量的轉(zhuǎn)基因素材[37]，開(kāi)拓了生物反應(yīng)器，進(jìn)行了基因功能研究等。轉(zhuǎn)基因技術(shù)在家蠶新品種選育及資源的創(chuàng)新利用等方面展現(xiàn)了其他技術(shù)無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)和潛力，必將為家蠶遺傳育種工作的再一次騰飛奠定理論基礎(chǔ)，為蠶桑產(chǎn)業(yè)的升級(jí)發(fā)展和拓展應(yīng)用不斷地注入新鮮的血液和活力。

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