木本油料文冠果APETALA2基因全長cDNA序列與生物信息學(xué)分析

劉曉輝+馬靜怡+羅媛+李志民+王莉

摘要 文冠果是我國北方特有的木本油料樹種。AP2是植物種子發(fā)育調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子。根據(jù)已獲得的文冠果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)搜索文冠果AP2基因序列（XsAP2），并對XsAP2基因全長cDNA序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，XsAP2基因cDNA序列包含1個(gè)長度為1 548 bp的完整ORF，編碼515個(gè)氨基酸。XsAP2蛋白大部分區(qū)域?yàn)橛H水區(qū)，由136個(gè)ɑ螺旋、89個(gè)延伸鏈、43個(gè)β-轉(zhuǎn)角、247個(gè)無規(guī)則卷曲構(gòu)成。依據(jù)2gcc.1.A同源建模法，獲得1個(gè)三級結(jié)構(gòu)模型，該模型從第153個(gè)氨基酸開始到第213個(gè)氨基酸結(jié)束。XsAP2蛋白與9種其他植物AP2蛋白的同源性分析顯示，文冠果AP2與可可AP2的同源性最高（71%）。該結(jié)果可為解析文冠果種子生長發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)，并有助于文冠果油品質(zhì)改良和文冠果分子育種工作。

關(guān)鍵詞 文冠果；APETALA2基因；cDNA；親水性；ɑ螺旋；同源性

中圖分類號 S794.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）02-0145-02

文冠果是我國北方特有的木本油料樹種，其種仁含油量高達(dá)50%～70%，富含油酸、亞油酸、神經(jīng)酸等優(yōu)質(zhì)不飽和脂肪酸[1]，是國家“十三五”期間大力發(fā)展的新型健康木本食用油，在許多工業(yè)領(lǐng)域如制藥與生物質(zhì)能源等方面也具有重要的用途。因此，挖掘調(diào)控文冠果種子發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子基因，對提高文冠果種子產(chǎn)量和含油量具有重要意義。

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，含有1～2個(gè)保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域[2-3]。其中AP2亞家族轉(zhuǎn)錄因子主要參與植物花、果實(shí)和種子等器官生長發(fā)育的調(diào)控[4]。APETALA2是AP2亞家族的成員之一，已相繼在擬南芥、水稻和葡萄等物種中分離出來[5]，而在文冠果中AP2轉(zhuǎn)錄因子方面的研究還較少。因此，本研究在測序獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩查文冠果APETALA2（AP2）基因的全長cDNA序列，通過生物信息學(xué)方法分析AP2轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征及功能，為解析文冠果種子生長發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)，有助于文冠果油品質(zhì)改良和文冠果分子育種工作。

1 材料與方法

1.1 搜索轉(zhuǎn)錄組獲得新基因序列

從本研究室測序獲得的文冠果根、莖、葉的de novo轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中搜索獲得文冠果AP2基因的cDNA序列。

1.2 文冠果AP2基因cDNA序列的生物信息學(xué)分析

利用ORFfinder在線軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）預(yù)測XsAP2基因cDNA序列的ORF。采用Prot-Param在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測XsAP2蛋白序列的一級結(jié)構(gòu)。通過ProtScale在線軟件（http：//web.expasy.org/protscale/）分析XsAP2蛋白的疏水性/親水性。利用SOPMA在線軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_ sopma.pl）預(yù)測XsAP2蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)。采用SWISS-MODEL軟件（http：// www.swissmodel.expasy.org/）預(yù)測XsAP2蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.3 文冠果AP2蛋白與其他植物AP2蛋白氨基酸序列的同源性比較

從NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載9種植物（可可、甜橙、葡萄、木本棉、木薯、千年桐、土瓶草、陸地棉和麻風(fēng)樹）的AP2氨基酸序列。然后利用DNAMAN軟件將文冠果和9種其他植物的AP2氨基酸序列進(jìn)行同源性比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果XsAP2基因cDNA序列的ORF預(yù)測

依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已獲得的文冠果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，搜查獲得文冠果AP2基因的全長cDNA序列。使用ORF Finder軟件，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)遺傳代碼查找XsAP2的開放讀碼框（ORF），結(jié)果顯示，AP2基因ORF序列長度為1 548 bp，可編碼515個(gè)氨基酸（圖1）。

2.2 XsAP2基因編碼蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用ProtParam在線軟件對XsAP2基因編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測見表1。XsAP2蛋白分子式為C2482H3827N755O801S16，相對分子質(zhì)量為57 572.23，等電點(diǎn)為6.38，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為60.47。

2.3 XsAP2蛋白疏水性/親水性分析

利用ProtScale在線軟件對XsAP2蛋白序列進(jìn)行疏水性/親水性預(yù)測，根據(jù)線性質(zhì)量差異模型，得到蛋白質(zhì)親疏水性信號（圖2）。圖2中可見XsAP2蛋白的疏水性最大值為0.989，最小值為-3.511，總體來看XsAP2大部分氨基酸屬于親水性氨基酸。

2.4 XsAP2蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，利用SOPMA在線軟件對XsAP2蛋白序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖3）。結(jié)果表明，XsAP2蛋白由136個(gè)ɑ螺旋、89個(gè)延伸鏈、43個(gè)β-轉(zhuǎn)角、247個(gè)無規(guī)則卷曲構(gòu)成，分別占據(jù)26.41%、17.28%、8.35%、47.96%，即XsAP2蛋白質(zhì)無規(guī)則卷曲所占比例最高。因此，可以推測文冠果XsAP2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中最大量的結(jié)構(gòu)原件是以無規(guī)則卷曲的形式存在，ɑ螺旋、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈分散在整個(gè)蛋白質(zhì)中。

2.5 XsAP2蛋白序列的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用同源建模法，將文冠果AP2蛋白序列提交至SWISS-MODEL，見圖4。依據(jù)2gcc.1.A同源建模法，獲得1個(gè)三級結(jié)構(gòu)模型（圖4），該模型從第153個(gè)氨基酸開始到第213個(gè)氨基酸結(jié)束。該蛋白質(zhì)主要由無規(guī)則卷曲、ɑ螺旋、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈組成，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果基本一致。endprint

2.6 文冠果XsAP2蛋白序列與其他植物AP2蛋白序列的同源性比較

文冠果XsAP2氨基酸序列提交NCBI在線比對，選擇與其同源性較高的9種植物的AP2氨基酸：可可AP2（Theobroma cacao，XP_007047337）、甜橙AP2（Citrus sinensis，KDO79131）、葡萄AP2（Vitis vinifera，XP_010652782）、木本棉AP2（Gossypium arboretum，XP_017627516）、木薯AP2（Manihot esculenta，OAY 35492）、千年桐AP2（Vernicia montana，APQ47383）、土瓶草AP2（Cephalotus follicularis，GAV88830）、陸地棉AP2（Gossy-pium hirsutum，XP_016679121）、麻風(fēng)樹AP2（Jatropha curcas，XP_012079274）。使用 DNAman 軟件將這些序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)不同植物的氨基酸序列同源性較高，其中文冠果與可可的同源性最高，達(dá)到71%。

3 結(jié)論與討論

文冠果XsAP2蛋白是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，有研究報(bào)道在牡丹AP2蛋白中存在2個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域[6]，這2個(gè)結(jié)構(gòu)域在不同物種中具備很高的保守性。本研究通過將文冠果AP2氨基酸序列與NCBI Nr數(shù)據(jù)庫中其他植物的AP2氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)文冠果XsAP2與可可、甜橙、葡萄、千年桐、陸地棉、麻風(fēng)樹等9種植物均有較高的同源性，其中與可可的同源性最高（71%），與甜橙和陸地棉的同源性相對較低（66%）。這說明文冠果與其他高等植物在AP2氨基酸序列上存在較長的保守區(qū)域，且保守區(qū)域?yàn)?個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，從而在進(jìn)化上相對較為保守。本研究通過搜索文冠果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得文冠果AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子，對開展文冠果高油新品種分子育種工作提供重要參考價(jià)值，也為下一步利用試驗(yàn)方法研究該基因的結(jié)構(gòu)功能方面奠定基礎(chǔ)[7]。

4 參考文獻(xiàn)

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[7] 敖妍，段劼，于海燕，等.文冠果研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，17（6）：197-203.endprint