靈芝哈茨木霉病害生防細(xì)菌的篩選及菌劑制備研究

解鵬飛，郭建峰，張春蘭，徐濟(jì)責(zé),,3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 生物工程學(xué)院，吉林 吉林 132101；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118；3.吉林市食藥用菌產(chǎn)業(yè)應(yīng)用技術(shù)研究院，吉林 吉林 132101)

靈芝(Ganodermalingzhi) 屬擔(dān)子菌門，傘菌綱，多孔菌目，靈芝科，靈芝屬[1]，是重要的藥用菌物，有著良好的營(yíng)養(yǎng)、藥用、保健和觀賞等價(jià)值[2]，在古代被人們譽(yù)為瑞草，歷代醫(yī)學(xué)家均認(rèn)為靈芝能滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本，更有著延年益壽的功效[3]。研究發(fā)現(xiàn),靈芝有增強(qiáng)免疫系統(tǒng)抵抗癌癥[4]、提高體內(nèi)酶活性達(dá)到抗衰老[5]、保護(hù)肝臟[6]的作用，能夠緩解神經(jīng)衰弱、失眠、食欲不振等多種疾病[7]。隨著靈芝功效不斷被發(fā)掘，野生靈芝不能滿足市場(chǎng)需求，人工栽培靈芝的規(guī)模越來越大[8]，我國(guó)已形成規(guī)模化的地方栽培基地[9]，目前靈芝栽培主要是固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)，固體培養(yǎng)包括椴木栽培和代料栽培[10]，2015年我國(guó)椴木栽培和代料栽培面積達(dá)到1萬公頃左右，產(chǎn)值約16億美元，已成為世界上靈芝的主要生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)[11]。隨著椴木栽培面積的不斷擴(kuò)大，一些靈芝病害也相繼被發(fā)現(xiàn)[12]，其中木霉菌是靈芝生產(chǎn)中最常見的病原菌之一[13]。木霉病害發(fā)生后主要通過使用農(nóng)藥等化學(xué)試劑進(jìn)行防治，但由于木霉自身可在土壤中繁殖并久存且極易傳播，使其效果不佳[14]，隨著各個(gè)國(guó)家和地區(qū)對(duì)農(nóng)殘等最低要求的提高，我國(guó)食藥用菌等因農(nóng)殘超標(biāo)而被退事件時(shí)有發(fā)生，同時(shí)農(nóng)藥殘留對(duì)環(huán)境造成了極大的破壞[15]。因此近年來生防菌及其抑菌物質(zhì)受到了研究者的廣泛關(guān)注[16-19]，在研究生產(chǎn)中靈芝在染病前幾乎不會(huì)受到土壤中細(xì)菌的影響，本研究通過對(duì)土樣進(jìn)行梯度稀釋、分離、純化、拮抗實(shí)驗(yàn)的研究，初步獲得靈芝木霉病害的拮抗菌，并與11種生防藥劑進(jìn)行對(duì)比，對(duì)獲得的細(xì)菌菌株進(jìn)行鑒定、發(fā)酵條件探索和菌劑載體篩選，為今后靈芝木霉病害的生物防治和菌劑制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 病原菌采自靈芝栽培基地，生防菌編號(hào)JSW-0601，純化保存。枯草芽胞桿菌B0066B，購(gòu)自廣東省微生物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基、檸檬酸鹽利用培養(yǎng)基，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》。

1.2 方法

1.2.1 生防菌的初篩、純化及復(fù)篩 利用“三點(diǎn)”接種法進(jìn)行初篩；平板劃線法進(jìn)行純化；對(duì)純化后的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.2 濾菌液抑菌效果的測(cè)定 采用含毒介質(zhì)法[20]測(cè)定。NA液體培養(yǎng)基接種JSW-0601,(30±1) ℃，150 r/min培養(yǎng)48 h。4 ℃、1 500 r/min條件下離心20 min除菌[21]，用0.22 μm微孔濾膜除菌。將所得液體以2.5%的量與冷卻至約40 ℃的PDA培養(yǎng)基混合并設(shè)置5個(gè)重復(fù)，以混入等量無菌水的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。平板中央接種病原菌菌餅，25 ℃培養(yǎng)，連續(xù)記錄14 d病原菌的長(zhǎng)速，觀察其生長(zhǎng)特性。

抑菌率(%)=((對(duì)照組日均生長(zhǎng)速度-實(shí)驗(yàn)組日均生長(zhǎng)速度)/對(duì)照組日均生長(zhǎng)速度)×100%

1.2.3 滅菌液的抑菌效果測(cè)定 采用含毒介質(zhì)法測(cè)定。混入量分別為20%、15%、10%、5%，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)，操作同1.2.2。25 ℃培養(yǎng)，連續(xù)記錄4 d病原菌的長(zhǎng)速，觀察其生長(zhǎng)特性。

1.2.4 菌液的抑菌效果測(cè)定 采用含毒介質(zhì)法測(cè)定?；烊肓糠謩e為20%、15%、10%、5%，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)，操作同1.2.2。25 ℃培養(yǎng)，連續(xù)記錄18 d病原菌的長(zhǎng)速，觀察其生長(zhǎng)特性。

1.2.5 菌體的抑菌率測(cè)定 采用紙碟法[22]進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。分別加入5、10、15、20 μL的菌體制成4組不同濃度梯度的菌液，每平板對(duì)稱放置4個(gè)濾紙碟，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)，以無菌水處理為空白對(duì)照。25 ℃下培養(yǎng)，記錄第2天的抑菌圈直徑，計(jì)算抑菌率[23]。

1.2.6 11種生防藥劑的抑菌效果測(cè)定 以紙碟法檢測(cè)11種生防制劑的抑菌效果，以接入等量無菌水的平板為對(duì)照，25 ℃培養(yǎng)，分別記錄第2天和第18天的菌落特征。

1.2.7 JSW-0601的形態(tài)特征及生理生化鑒定 參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[24]及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[25]進(jìn)行逐步分析鑒定。實(shí)驗(yàn)操作方法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[25]完成。

1.2.8 JSW-0601的分子生物學(xué)鑒定 采用16S rDNA序列分析法[26]對(duì)菌株JSW-0601進(jìn)行鑒定，通過提取DNA、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物測(cè)得16S rDNA的序列信息。利用 BLAST程序進(jìn)行比對(duì)，檢索同源性高且具代表性的菌株，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.9 生防菌劑的制備和載體篩選 ①最優(yōu)接種量的確定：分別以0.05%、0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%接種量的菌液接入NA培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)，測(cè)定OD600[27]。②生長(zhǎng)曲線繪制：以最優(yōu)接種量的接種，分別培養(yǎng)24、48、72、96和120 h，測(cè)定OD600，繪制生長(zhǎng)曲線[17]。③菌液發(fā)酵單因素試驗(yàn)：碳源：NA液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選取葡萄糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、蔗糖為基礎(chǔ)培養(yǎng)基碳源，以最優(yōu)接種量接種，恒溫培養(yǎng)48 h；測(cè)定OD600；無機(jī)鹽：選取氯化鈉、硫酸鎂、硫酸鋅、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基無機(jī)鹽，以最優(yōu)接種量接種，恒溫培養(yǎng)48 h，測(cè)定OD600；氮源：選取蛋白胨、酵母膏、硝酸銨、尿素為基礎(chǔ)培養(yǎng)基氮源，以最優(yōu)接種量接種，恒溫培養(yǎng)48 h；測(cè)定OD600。④正交試驗(yàn)：?jiǎn)我蛩卦囼?yàn)后，設(shè)計(jì)L4(23)正交試驗(yàn)(表1)。⑤載體初篩：選取高嶺土、殼聚糖、幾丁質(zhì)、硅藻土為細(xì)菌載體[28]，以5%的量添加到NA培養(yǎng)基中。稀釋涂布平板，以未加載體的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。30 ℃恒溫培養(yǎng)4 d，以細(xì)菌活菌量為指標(biāo)，初步篩選出拮抗細(xì)菌載體。⑥載體復(fù)篩：選取高嶺土、殼聚糖、硅藻土為細(xì)菌載體，發(fā)酵菌液，制備菌粉。稀釋涂布測(cè)定載體的保護(hù)力。復(fù)篩最優(yōu)細(xì)菌載體。

表1 L4(23)正交試驗(yàn)表Table 1 The orthogonal experiment table of L4(23)

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)篩結(jié)果

確定JSW-0601為所篩拮抗菌中抑菌效果較好的細(xì)菌菌株。

2.2 濾菌液的抑菌效果測(cè)定

相同培養(yǎng)條件下，對(duì)照組已產(chǎn)大量的孢子，而實(shí)驗(yàn)組只產(chǎn)生少量孢子，可見發(fā)酵液中活性物質(zhì)對(duì)病原菌的產(chǎn)孢有很好的抑制效果，且2.5%濾菌液抑菌率為30.80%(圖1、表2)。

圖1 濾菌液的抑菌效果Fig.1 The bacteriostatic effect of filtering the bacteria fermented liquidA：對(duì)照組；B：實(shí)驗(yàn)組A:control group； B:experimental group

2.3 滅菌液的抑菌效果測(cè)定

實(shí)驗(yàn)組病原菌的菌絲生長(zhǎng)較對(duì)照組稀疏?？梢奐SW-0601分泌的無活性化學(xué)物質(zhì)對(duì)病原木霉生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢量均有較好的抑制效果，抑菌率依次為5%滅菌液51.91%、10%滅菌液62.79%、15%滅菌液73.97%、20%滅菌液80.20%，且呈線性規(guī)律(圖2、表2)。

表2 不同含量發(fā)酵液的抑菌率Table 2 The bacteriostatic effect of ifferent amount fermented liquid

2.4 菌液的抑菌效果測(cè)定

相同培養(yǎng)條件下，對(duì)照組大量產(chǎn)孢且菌落色澤為黃綠色，實(shí)驗(yàn)組菌落未長(zhǎng)滿平板且菌落色澤為白色，同時(shí)呈現(xiàn)外層邊緣菌絲稀疏，里層邊緣菌絲濃密。菌液對(duì)病原菌有較強(qiáng)的抑制效果，抑菌率依次為5%菌液93.75%、10%菌液94.77%、15%菌液94.93%、20%菌液94.86%，但并無規(guī)律可循(圖3、表2)。

2.5 菌體的抑菌率測(cè)定結(jié)果

菌體對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)有一定的抑制效果，5 μL菌體制成的菌液抑制率為51.67%、10 μL菌液為 55.00%、15 μL菌液為8.34%、20 μL菌液為63.33%(圖4)。

2.6 11種生防藥劑的抑菌性測(cè)定

前期，11種生防藥劑中，地衣芽胞桿菌、多粘芽胞桿菌有較好的抑菌效果，其他9種藥劑均無抑菌效果。后期，接入綠僵菌、側(cè)芽胞桿菌的病原菌長(zhǎng)勢(shì)弱，菌落色澤為側(cè)耳色。地衣芽胞桿菌、多粘芽胞桿菌所產(chǎn)生的抑菌圈依然明顯，但病原菌長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)。接入白僵菌、綠色木霉的病原菌長(zhǎng)勢(shì)雖強(qiáng)，但產(chǎn)孢受到明顯抑制，其余對(duì)病原菌仍均無抑制效果(圖5、圖6、表3)。

圖2 滅菌液的抑菌效果Fig.2 The bacteriostatic effect of sterilization fermented liquidA：對(duì)照組；B：5%滅菌液；C：10%滅菌液；D：15%滅菌液；E：20%滅菌液A:control group； B:5% sterilization fermented liquid； C:10% sterilization fermented liquid； D:15% sterilization fermented liquid； E:15% sterilization fermented liquid

圖3 發(fā)酵原液的抑菌效果Fig.3 The bacteriostatic effect of fermented liquidA：對(duì)照組；B：5%發(fā)酵原液；C：10%發(fā)酵原液；D：15%發(fā)酵原液；E：20%發(fā)酵原液A:control group； B:5% fermented liquid； C:10% fermented liquid； D:15% fermented liquid； E: 20% fermented liquid

圖4 不同梯度菌液的前期菌體抑菌率Fig.4 Pre-bacteriostatic bacteriostatic effects of different gradient brothA：對(duì)照組；B：5 μL 菌液；C：10 μL菌液；D：15 μL 菌液A:control group； B: 5 μL liquid； C:10 μL liquid； D:15 μL liquid

圖5 11種生防藥劑的前期抑菌效果Fig.5 Pre-bacteriostatic effect of 11 kinds of Biological agentsA：綠僵菌；B：地衣芽胞桿菌；C：白僵菌；D：香菇多糖；E：綠色木霉菌；F：短穩(wěn)桿菌；G：多粘類芽胞桿菌；H：蘇云金桿菌；I：鏈霉素；J：微生物土壤改良劑；K：側(cè)孢芽胞桿菌；L：空白，圖6同 A:Metarrhizium anisopliae；B:Bacillus licheniformis； C:Beauveria bassiana； D:lentinan； E:green wood mold； F:Empedobacter brevis； G:Paenibacillus polymyxa； H:Bacillus thuringiensis； I:streptomycin； J:microbial soil conditioner； K: Bacillus laterosporus； L: CK；same figure 6

圖6 11種生防藥劑的后期抑菌效果Fig.6 The later bacteriostatic effect of 11 kinds of bio-control agents

表3 11種生防藥劑的抑菌效果Table 3 The bacteriostatic effect of 11 kinds of biological agents

注：-：無抑菌圈；+：抑菌圈小，菌絲長(zhǎng)勢(shì)弱；++：抑菌圈較大，菌絲長(zhǎng)勢(shì)較好；+++：抑菌圈大，菌絲長(zhǎng)勢(shì)好；A：綠僵菌；B：地衣芽胞桿菌；C：白僵菌；D：香菇多糖；E：綠色木霉菌；F：短穩(wěn)桿菌；G：多粘類芽胞桿菌；H：蘇云金桿菌；I：鏈霉素；J：微生物土壤改良劑；K：側(cè)孢芽胞桿菌

2.7 鑒定結(jié)果

2.7.1 16S rDNA序列分析 測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，下載同源性最高的16S rDNA序列。利用MAGE6.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖7可知JSW-0601的16S rDNA序列與Bacilluspumillus序列的同源性最高，最大相似性達(dá)到100%，因此確定JSW-0601為短小芽胞桿菌。

圖7 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 The Phylogenetic tree which is made by 16S rDNA order

2.7.2 形態(tài)特征 菌落形態(tài)為不透明，乳白色，圓形，邊緣整齊有規(guī)則，表面濕潤(rùn)，光滑，菌落向外凸出生長(zhǎng)。文獻(xiàn)報(bào)道有不透明和半透明兩種菌落形態(tài)，半透明的菌落較少存在，乳黃色[29-30]JSW-0601的菌體為短桿狀。

2.7.3 生理生化特性鑒定結(jié)果 菌株JSW-0601為革蘭陽性菌，其淀粉水解反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)、檸檬酸鹽利用均呈陽性，如表4所示。對(duì)照表5可知該菌株特征數(shù)據(jù)與短小芽胞桿菌基本相似，但是由于巴氏芽胞桿菌的革蘭反應(yīng)與短小芽胞桿菌相似，且其接觸酶反應(yīng)與檸檬酸鹽利用這兩項(xiàng)特征數(shù)據(jù)文獻(xiàn)未有記載，結(jié)合分子鑒定結(jié)果確定菌株為短小芽胞桿菌。

2.8 生防菌劑制備和載體篩選

2.8.1 最佳接種量確定 JSW-0601的OD600值隨接種量增加呈先升高后降低最終趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，接種量為0.10%時(shí)，OD600值達(dá)到最大值(圖8)。

圖8 接種量對(duì)JSW-0601的影響Fig.8 The influence of Inoculation amount of JSW-0601

2.8.2 生長(zhǎng)曲線繪制 由圖9可知，培養(yǎng)48 h時(shí)OD600值最大，菌量最多。

圖9 時(shí)間對(duì)JSW-0601的影響Fig.9 The influence of time of JSW-0601

2.8.3 液體發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn) 葡萄糖為CK對(duì)照，由圖10可知，4種碳源均優(yōu)于葡萄糖，添加麥芽糖時(shí)OD600值最大，可達(dá)0.184 5。

圖10 碳源對(duì)JSW-0601的影響Fig.10 The influence of carbon source of JSW-0601

表4 生理生化特性鑒定結(jié)果Table 4 The identification results of physiological and biochemical characteristics

注：+：90%～100%為陽性；-：90%～100%為陰性

表5 生理生化特性對(duì)照表Table 5 The comparison table of physiological and biochemical characteristics

注：+：90%～100%為陽性；-：90%～100%為陰性；d：反應(yīng)不同；v：在一定菌株內(nèi)不穩(wěn)定；ND：未記載

蛋白胨為CK對(duì)照，其他3種氮源除酵母膏外均低于蛋白胨，且添加酵母膏時(shí)菌液的OD600值最高，可達(dá)0.208。硝酸銨和尿素對(duì)JSW-0601的生長(zhǎng)有一定的抑制作用(圖11)。

NaCl為CK對(duì)照，除ZnSO4外其他無機(jī)鹽均優(yōu)于NaCl，當(dāng)添加MgSO4時(shí)，菌液的OD600值最高，可達(dá)0.252 5。ZnSO4對(duì)JSW-0601有很強(qiáng)的抑制作用(圖12)。

2.8.4 正交試驗(yàn) 通過L4(23)的正交試驗(yàn)，最終確定麥芽糖0.25%、蛋白胨1%、硫酸鎂0.5%為最優(yōu)發(fā)酵條件(表6)。

圖11 氮源對(duì)JSW-0601的影響Fig.11 The influence of Nitrogen source of JSW-0601

圖12 無機(jī)鹽對(duì)JSW-0601的影響Fig.12 The influence of Inorganic salt of JSW-0601

表6 L4(23)的正交試驗(yàn)Table 6 Orthogonal test of L4(23)

2.8.5 載體初篩 加入載體后菌液中的活菌數(shù)受到了影響，其中幾丁質(zhì)對(duì)JSW-0601的影響最大，故將幾丁質(zhì)排除選用剩下3種進(jìn)一步篩選最優(yōu)載體(表7)。

表7 載體初篩Table 7 Vector eariy screening

2.8.6 載體復(fù)篩 在初篩時(shí)的最優(yōu)載體高嶺土，反而在制成菌粉后所載附活菌數(shù)變?yōu)樽畹?。硅藻土作為載體所制菌粉每克中活菌數(shù)最高，因此最終選定硅藻土為菌劑所用載體(表8)。

表8 載體復(fù)篩Table 8 Vector secondary screening

3 討 論

枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌和凝結(jié)芽胞桿菌是現(xiàn)階段美國(guó) FDA 認(rèn)為安全的3種芽胞桿菌[31]，自1990年以來中國(guó)農(nóng)業(yè)部已經(jīng)對(duì)可應(yīng)用于飼料和養(yǎng)殖的微生物種類進(jìn)行了幾次增補(bǔ)[32]，目前認(rèn)為可安全使用的芽胞桿菌是由農(nóng)業(yè)部1126號(hào)公告所公布的枯草芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌兩種；但2010年出臺(tái)的征求意見稿則進(jìn)一步擴(kuò)大芽胞桿菌使用范圍，在原有基礎(chǔ)上，增補(bǔ)了短小芽胞桿菌、凝結(jié)芽胞桿菌、側(cè)孢芽胞桿菌和遲緩芽胞桿菌[33]。

結(jié)合分子鑒定和生理生化特性,確定JSW-0601為短小芽胞桿菌。通過測(cè)定抑菌效果，發(fā)現(xiàn)JSW-0601分泌的化學(xué)物質(zhì)及胞外活性物質(zhì)對(duì)病原菌絲均有較好抑制效果，與菌體共同存在時(shí)所表現(xiàn)的抑菌效果更強(qiáng)。對(duì)比紙碟法和含毒介質(zhì)法，可見通過生防菌影響病原菌的營(yíng)養(yǎng)來源可達(dá)到更好的防治效果?？紤]到研究階段存在的局限性，在田間施用時(shí)，可能受溫度、微生物、pH等環(huán)境因素影響，防治效果也會(huì)隨之變化，因此田間防效有待進(jìn)一步研究。

11種生防藥劑中，白僵菌、綠色木霉前期雖無抑菌效果，后期對(duì)產(chǎn)孢的抑制卻優(yōu)于JSW-0601，但綠色木霉作為一種食用菌病害也可能侵染靈芝，故可排除綠色木霉；綠僵菌、側(cè)芽胞桿菌前期也無抑菌效果，但后期呈現(xiàn)較好抑制產(chǎn)孢效果；地衣芽胞桿菌、多粘芽胞桿菌雖前、后期的抑菌圈均較為明顯，但對(duì)產(chǎn)孢無明顯抑制效果，不利于病害的控制，較JSW-0601的抑菌效果差，可考慮與側(cè)芽胞桿菌作為復(fù)合劑施用。其他生防藥劑對(duì)病害均無抑菌效果，可見JSW-0601有很大的研究空間、實(shí)用價(jià)值。

本研究對(duì)JSW-0601可濕性粉劑進(jìn)行初步研制，進(jìn)行了最佳接種量的確定、生長(zhǎng)曲線的測(cè)定、載體篩選以及發(fā)酵條件的優(yōu)化等試驗(yàn)。最終確定硅藻土、0.1%接種量、培養(yǎng)48 h為最佳菌劑研制條件。L4(23)正交試驗(yàn)最終確定麥芽糖0.25%、蛋白胨1%、硫酸鎂0.5%為最優(yōu)發(fā)酵條件。最優(yōu)發(fā)酵條件的篩選為后期田間試驗(yàn)提供了優(yōu)良的佐劑條件將大大縮短菌體萌發(fā)時(shí)間，大大提高菌劑的性能。目前國(guó)內(nèi)外短小芽胞桿菌主要應(yīng)用于植物病害防治、毒素及石油降解、水產(chǎn)養(yǎng)殖、動(dòng)物養(yǎng)殖的飼料添加益生菌等研究[34-40]。在靈芝及其他食用菌致病木霉的生防應(yīng)用方面卻鮮有報(bào)道，可見短小芽胞桿菌在此方面有很大的應(yīng)用潛力。