1株陽離子藍染料高效脫色菌的分離鑒定及特性研究

張 璐，張崇淼*，牟 霄，張琪雯

(1.西安建筑科技大學 環(huán)境與市政工程學院 西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點實驗室 陜西省環(huán)境工程重點實驗室，陜西 西安 710055；2.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710065)

陽離子染料又稱堿性染料或鹽基性染料，主要用于腈綸纖維的染色。根據(jù)染料分子中陽離子電荷與發(fā)色團共軛體的組成形式，可將其劃分為隔離型和共軛型兩大類[1]，絕大多數(shù)陽離子染料屬于后者。陽離子藍是共軛型陽離子染料的典型代表，具有著色力強、耐曬牢度高等優(yōu)點，其發(fā)色團共軛體中有偶氮鍵、芳環(huán)和含氮雜環(huán)[2]。我國是陽離子染料生產(chǎn)和使用的主要國家，每年產(chǎn)量占染料生產(chǎn)總量的20%～30%。陽離子染料在生產(chǎn)和使用過程中容易流失[3]，廢水的色度高達幾萬至幾十萬，可生化性差[4]，給環(huán)境治理帶來嚴重威脅。目前用于處理陽離子藍染料廢水的方法包括吸附法[5-6]、氧化法[7-9]和電化學法[10-11]等，但大都存在處理成本高、易造成二次污染的缺點。采用生物處理技術可以有效地解決上述問題，但由于陽離子染料難生化降解的特性，故常需要使用特定的功能菌才能實現(xiàn)良好的處理效果。近年來的研究發(fā)現(xiàn)了對陽離子染料具有良好脫色效果的微生物，例如假單胞菌(Pseudomonas)[12-13]、庫特氏菌(Kurthia)[14]、棒狀桿菌(Coryneforms)[15]等，但它們對脫色條件要求較嚴格，達到良好脫色效果所需時間較長，對染料濃度的耐受能力十分有限，這在很大程度上限制了其推廣應用。因此，尋找適應性強、對陽離子染料具有快速高效脫色性能的微生物，進一步開發(fā)陽離子染料生物處理技術具有重要的意義。陽離子藍是一種色澤濃艷的偶氮類水溶性染料，在腈綸的染色和印花中使用量非常大，但目前鮮有陽離子藍染料脫色菌的報道。本研究針對陽離子藍染料篩選分離脫色菌，利用16S rDNA分析比對法進行種屬鑒定。通過在不同條件下的脫色試驗研究該菌株的脫色特性和影響因素，并對其連續(xù)脫色性能進行考察，以期為該脫色菌的工業(yè)化應用提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 染料 選用的染料為陽離子藍SD-GSL，購自蘇州市東吳染料有限公司。染料的陽離子是含有偶氮基的發(fā)色基因，其化學式為C19H23N4SO，結構式如圖1所示，相對分子質量為355，在水溶液中的最大吸收波長587 nm。

圖1 陽離子藍SD-GSL的陽離子結構式Fig.1 Structural formula of cation of cationic Blue SD-GSL

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：牛肉膏 5.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，氯化鈉 5.0 g/L，pH調整至7.0±0.2；馴化培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)基中加入不同濃度的陽離子藍SD-GSL；陽離子藍培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)基中加入陽離子藍SD-GSL，終濃度為300 mg/L；陽離子藍平板培養(yǎng)基：陽離子藍染料培養(yǎng)基中加入瓊脂，質量分數(shù)為1.5%。

1.2 方法

1.2.1 陽離子藍脫色菌的篩選與分離 取長期受到工業(yè)污染的土壤10 g，置于盛有90 mL無菌水的錐形瓶內，室溫120 r/min振蕩2 h，將懸濁液靜置30 min，使顆粒物沉淀。取10 mL上清液與90 mL富集培養(yǎng)基混合，37 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。取培養(yǎng)液10 mL轉入含100 mL馴化培養(yǎng)基的錐形瓶中，進行陽離子藍濃度壓力馴化培養(yǎng)，陽離子藍濃度范圍為50～400 mg/L，遞增梯度為50 mg/L。最終馴化培養(yǎng)獲得的菌液轉至富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，然后在陽離子藍培養(yǎng)平板上劃線分離，挑取單菌落保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種鑒定 挑取平板上的菌落至無菌水中，置于95 ℃金屬浴5～10 min后，離心取含有菌株DNA的上清液作為模板。使用16S rDNA通用引物(上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物1492R：5′-GGTTACCTTGTT-ACGACTT-3′)進行聚合酶鏈反應。PCR反應體系(50 μL)：無菌水34 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL(2.5 mmol/L)，MgCl23 μL(25 mmol/L)，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，TaqDNA聚合酶1 μL(2.5 U/μL)，模板1 μL。PCR擴增程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min(30個循環(huán))；72 ℃ 7 min。擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳初步確定后交由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。利用美國國立生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information)的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中對測序結果進行同源性比對分析。

1.2.3 脫色菌生長曲線的繪制 取富集培養(yǎng)的菌液，以富集培養(yǎng)基為參比，在波長600 nm處每隔 2 h測定OD600，以培養(yǎng)時間為橫坐標，菌液的OD600值為縱坐標繪制菌株的生長曲線。

1.2.4 脫色實驗和脫色率測定 取10 mL富集培養(yǎng)的菌液接種于90 mL陽離子藍培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)(37 ℃，150 r/min)進行脫色實驗，每隔一段時間測定脫色率。脫色率測定方法：將脫色后的試樣離心(10 000 r/min，10 min)取上清液，以富集培養(yǎng)基為參比，在587 nm處測定吸光度A1。以未加菌液的含相同陽離子藍染料濃度的培養(yǎng)基作為空白，測定吸光度A0。按照下式計算菌株對陽離子藍的脫色率。

使用終濃度為300 mg/L的陽離子藍培養(yǎng)基進行脫色實驗，每隔2 h測定脫色率，以培養(yǎng)時間為橫坐標，脫色率為縱坐標繪制脫色曲線。調整培養(yǎng)基初始pH、溫度、轉速，脫色24 h后取樣測定脫色率，考察這些因素對菌株脫色性能的影響，每組3次平行。

1.2.5 連續(xù)脫色實驗 取10 mL菌液接種于90 mL 300 mg/L陽離子藍培養(yǎng)基中，在pH、溫度、轉速均為最佳條件下進行連續(xù)脫色，每隔12 h測定吸光度，計算脫色率。根據(jù)脫色液中剩余陽離子藍染料濃度在試樣中補充陽離子藍至終濃度300 mg/L，再開始下一次脫色實驗。連續(xù)進行5次脫色實驗，比較脫色率的變化，每組3次平行。

1.2.6 脫色途徑實驗 將富集培養(yǎng)12 h后的菌液分為2份，一份直接接種于陽離子藍培養(yǎng)基中進行脫色實驗，另一份則先高壓蒸汽滅菌20 min后再進行脫色實驗，每隔12 h測定脫色率。分別在脫色 0、6、12、24、48 h取上清液，離心后在波長200～800 nm范圍內掃描吸收光譜。

2 結果與分析

2.1 脫色菌株的鑒定

經(jīng)篩選分離后獲得1株對陽離子藍具有高效脫色能力的細菌，命名為ZHT-3。對菌株ZHT-3的16S rDNA 進行PCR擴增后測序，獲得402 bp的核酸片段。經(jīng)比對分析，該核酸片段序列與蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)16S rDNA同源，一致性(identity)高達99%(表1)。結合該菌的菌落形態(tài)特征，初步判定菌株ZHT-3為蠟狀芽胞桿菌，獲得序列號MG738794。

表1 菌株ZHT-3的16S rDNA部分序列與GenBank中其他序列的同源性比對Table 1 Homology comparison of 16S rDNA partial sequence of strain ZHT-3with other sequences located in GenBank

2.2 菌株ZHT-3的生長曲線和脫色曲線

菌株ZHT-3在陽離子藍培養(yǎng)基中測得的脫色曲線與在富集培養(yǎng)基中測得的生長曲線的變化趨勢基本一致(圖2)。在不含陽離子藍的富集培養(yǎng)基中，菌株ZHT-3沒有明顯的遲緩期，對數(shù)生長期大約持續(xù)到8 h，然后進入穩(wěn)定生長期，菌液的OD600在30 h達到峰值，而在8 h即達到峰值的86.6%。王震文[16]從紡織廢水中篩選得到用來降解偶氮染料的芽胞桿菌ACT1在24 h時就進入衰亡期，相比之下ZHT-3世代時間長，有利于穩(wěn)定脫色。在初始濃度300 mg/L陽離子藍培養(yǎng)基中，菌株ZHT-3在8 h內脫色率急劇增加，8 h即達到76.3%。由此可見，菌株ZHT-3對陽離子藍的脫色主要是在對數(shù)生長階段完成的，此時菌體

圖2 菌株ZHT-3的脫色曲線和生長曲線

具有較高的脫色活性，其結果與高效脫色偶氮染料活性黑5的混合菌群FF[17]有類似的作用規(guī)律，這一特性意味著該菌株可以實現(xiàn)對陽離子藍的快速脫色。8 h后隨著菌體的生長，脫色率逐漸增高，在30 h達到了最高脫色率98.8%。由圖2還可以看出，陽離子藍的脫色率在菌體進入穩(wěn)定期后增長很緩慢，可能由于染料的中間代謝產(chǎn)物對菌體產(chǎn)生毒性，從而抑制菌株脫色。

2.3 菌株ZHT-3對陽離子藍的脫色性能

菌株ZHT-3在不同初始染料濃度的培養(yǎng)基中對陽離子藍的脫色率隨時間的變化情況如圖3所示。當陽離子藍初始濃度在500 mg/L以內時，菌株ZHT-3都能夠達到95%以上的脫色率，且能夠長時間保持，但達到時間會隨著初始濃度的升高而延長。例如對于100 mg/L初始濃度的陽離子藍，菌株ZHT-3在12 h就達到96.7%；而對于500 mg/L初始濃度的陽離子藍，則需要36 h才能達到95.4%的脫色率。當陽離子藍初始濃度升至600 mg/L時，菌株ZHT-3最大脫色率為70.6%?？梢钥闯鼍陮θ玖系拿撋孰S著染料初始濃度的增加而降低，且達到最高脫色率的時間也隨之延遲，推測可能是隨著陽離子藍初始濃度的升高，染料的生物毒性越強，對菌體生長以及產(chǎn)生偶氮還原酶活性的抑制作用也逐漸增強，導致脫色能力的明顯下降。Hadi等[13]分離得到的銅綠假單胞菌對200 mg/L以上濃度范圍內的甲基藍24 h脫色率最高為43.08%。林麗英[14]篩選出對陽離子翠藍具有脫色能力的庫特氏菌108#在125 mg/L下24 h脫色率僅為49.27%。與這些研究結果進行對比可以發(fā)現(xiàn)，菌株ZHT-3對高濃度陽離子藍染料的脫色性能明顯優(yōu)于以往報道的脫色菌。

圖3 菌株ZHT-3對不同初始濃度陽離子藍的脫色率Fig.3 Decolorization rate of strain ZHT-3 in different initial Cationic Blue SD-GSL concentration

微生物的連續(xù)脫色能力是其能否應用到實際廢水處理的重要指標。隨著脫色時間和次數(shù)的延長，代謝產(chǎn)物和有毒物質逐漸積累，在反應液的單位體積內的濃度越來越高，導致微生物脫色性能的下降。菌株ZHT-3對陽離子藍連續(xù)脫色實驗中脫色率的變化(圖4)基本呈現(xiàn)出這一趨勢，但在前兩次連續(xù)脫色實驗中脫色率還有所升高，達到95.4%，之后才逐漸降低。連續(xù)脫色3次，脫色率仍保持在79.2%。這說明菌株ZHT-3對陽離子藍有較為持久的脫色性能，有利于實際應用。

圖4 菌株ZHT-3對陽離子藍連續(xù)脫色實驗的脫色率Fig.4 Continuous repeated batch decolorization of Cationic Blue SD-SL by the strain ZHT-3

2.4 不同因素對脫色率的影響

廢水中的pH值對生物處理十分重要，氫離子能影響細菌的生長和功能酶的活性，從而導致染料降解效果的不同。研究不同初始pH值對菌株ZHT-3脫色的影響曲線如圖5A所示?？梢钥闯鼍闦HT-3對pH的適應范圍較寬，在pH 5～8范圍內24 h脫色率均在93.4%以上，其中在pH 為7時脫色率最高，可達98.4%，可能是由蠟狀芽胞桿菌生長的最適pH是中性條件決定的。當pH大于8或者小于5時，脫色率急劇下降。說明pH值過高或過低影響酶功能及其催化反應速率，嚴重抑制菌株的脫色。

不同溫度下菌株ZHT-3的脫色情況如圖5B所示。培養(yǎng)24 h后，該菌能夠在30～40 ℃范圍內保持較高的脫色率，表明菌體產(chǎn)生的偶氮還原酶在這一溫度范圍內均具有較高的酶活性。而當溫度超過40 ℃時脫色率急速降低至18.6%，其原因可能由于菌體蛋白質、核酸、酶等重要組成成分因溫度過高發(fā)生不同程度的破壞，影響菌株的脫色能力[16]。而當溫度低于30 ℃時菌株的脫色能力逐漸降低，25 ℃時脫色率為52.4%，可能是由于溫度過低抑制了菌體生長繁殖，降低酶活性，導致脫色率的下降。

轉速在150 r/min時，菌株ZHT-3對陽離子藍的脫色率最高，達98.5%。轉速在0～200 r/min范圍內，脫色率可保持在92.1%以上，可見振蕩轉速對菌株ZHT-3的脫色并沒有明顯影響(圖5C)。因此在實際應用中，可以選擇靜置脫色，降低成本。脫色后培養(yǎng)基內溶解氧含量較脫色前明顯減少，這說明菌株ZHT-3在降解陽離子藍時需要氧的參與。

圖5 不同pH(A)、溫度(B)和轉速(C)對脫色率的影響Fig.5 Influences of different pH(A)、temperature(B) and shaking speed(C) on decolorization rate

2.5 ZHT-3對陽離子藍的脫色途徑

從圖6可以看出，使用活菌ZHT-3對陽離子藍的脫色率明顯高于使用高壓蒸汽滅活后的菌株，前者的脫色率可達95%以上，而后者卻僅約13%。使用滅活后菌株進行脫色實驗后，反應液經(jīng)離心回收的沉淀呈深藍色，而用未滅活菌株則無此現(xiàn)象。說明滅活后菌株僅通過吸附作用去除陽離子藍，其脫色效果十分有限。因此菌株ZHT-3對陽離子藍的生物降解在脫色過程中發(fā)揮了主要作用。

對比觀察脫色過程中試樣上清液的紫外-可見吸收光譜，可以發(fā)現(xiàn)脫色前的試樣在587 nm處有陽離子藍的特征吸收峰。隨著脫色反應的進行，該特征吸收峰的強度不斷減弱。脫色24 h后，則完全消失(圖7)。這表明陽離子藍的偶氮鍵發(fā)生斷裂，生色團消失。此外，該特征吸收峰在強度降低的過程中吸收波長發(fā)生紅移，這是由于偶氮共軛體系被破壞后，連接在偶氮鍵兩側的取代基發(fā)生了變化。

表2 不同陽離子染料脫色菌的脫色性能Table 2 ecolorization performance of different decolorizing bacteria for Cationic Dye

圖6 活菌與滅活菌對陽離子藍的脫色率Fig.6 Decolorization rate of Cationic Blue SD-GSL by live and dead strain ZHT-3

圖7 陽離子藍脫色過程中的吸收光譜Fig.7 Absorption spectrum during the decolorization process ofCationic Blue SD-GSL

3 討 論

目前，有關陽離子染料生物脫色研究主要針對的染料包括堿性藍41、甲基藍、陽離子翠藍X-GB等。表2列舉了現(xiàn)有脫色菌的種類及其脫色性能。盡管它們最佳脫色率都很高，但在對染料初始脫色濃度、達到最佳脫色率所需時間上存在明顯差別。

與以往報道的陽離子染料脫色菌相比，本研究分離得到的蠟狀芽胞桿菌ZHT-3不僅脫色率高，而且能夠適應陽離子染料更高的初始濃度，并能夠在更短的時間內達到最佳脫色率。這些特點意味著該菌在未來的實際應用方面具有突出的優(yōu)勢。

值得注意的是，Telke等[21]以活性染料活性橙16為目標染料馴化得到波株芽胞桿菌ADR(Bacillussp.)，發(fā)現(xiàn)該菌株對陽離子染料堿性綠4也具有一定的脫色能力，對100 mg/L堿性綠4在60 h脫色率為94%，但并未鑒定出該芽胞桿菌的具體菌種。芽胞桿菌屬包括枯草芽胞桿菌、蘇云金芽胞菌、蠟狀芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌等，共計147種[22]。不同種類的芽胞桿菌特性差異很大，并非所有的芽胞桿菌都具有降解陽離子染料的能力。目前蠟狀芽胞桿菌在降解環(huán)境污染物中的研究較多，如四環(huán)素、有機磷農藥和芘污染物等[23-25]。但就作者所知，尚未見有關蠟狀芽胞桿菌對陽離子藍染料脫色的研究報道。

本研究篩選出的蠟狀芽胞桿菌ZHT-3能夠對陽離子藍快速脫色，在脫色12 h后對300 mg/L陽離子藍的脫色率達84.5%。隨后脫色率緩慢增加，直至在30 h達到最大脫色率98.8%。沈明等[26]提出，陽離子染料含有很復雜的芳香基團，其偶氮雙鍵還原為胺基而脫色產(chǎn)生的胺基類中間產(chǎn)物毒性比較大，對菌株生長有抑制作用，這可能是造成脫色后期脫色率增長緩慢的主要原因。

研究菌株ZHT-3降解特性時發(fā)現(xiàn)，對于500 mg/L以內的高濃度染料有非常好的脫色效果及耐受能力。隨著初始陽離子藍濃度的增加，對菌體生長的抑制作用更明顯，菌株的脫色速率逐漸有所降低，雖然高濃度的脫色速率比低濃度的脫色速率低，但到后期脫色穩(wěn)定后基本持平。如若對菌株在高濃度下進行長期馴化，很可能繼續(xù)提高菌株的耐受能力及脫色性能，更有利于其作為工程菌使用，為降解陽離子染料廢水高濃度有機污染物提供有用的菌源。陽離子染料廢水pH低，菌株ZHT-3在pH 5～8，30～40 ℃范圍內都有良好的脫色性能。Kale等[12]利用堿性藍41篩選出的假單胞菌AAB3在pH 6～ 7，37 ℃時脫色率達到80%。李玲玉等[15]篩選出的棒桿菌51#在pH為 7，30 ℃下脫色率最高為61.6%，對脫色條件要求嚴格。與上述菌株相比，ZHT-3對環(huán)境的適應能力更好。同時ZHT-3在靜置或振蕩條件下脫色率均在92.1%以上。彌補了以往菌株脫色所需時間較長、脫色條件單一、脫色濃度過低等方面的局限。

關于連續(xù)脫色對微生物脫色性能的影響研究很少。在實際廢水處理中，隨著脫色反應的進行，由于源源不斷的污染物負荷以及有毒物質產(chǎn)生等均會導致微生物脫色性能的下降，使得微生物在染料廢水生物處理中存在很大的局限性。本研究中菌株ZHT-3 連續(xù)脫色2次后的脫色率由85.8%上升至95.4%，這是由于菌株ZHT-3無法以染料作為唯一碳源并加以利用，只能通過外加碳源為菌體生長提供所需能量和電子供體，從而合成偶氮還原酶使染料降解脫色。在初次脫色時碳源充足，其代謝調控被碳源所抑制，降低合成偶氮還原酶的能力，而第二次脫色時碳源處于低水平濃度，在該條件下更有利于酶的合成，促進菌株的脫色[27]。菌株ZHT-3連續(xù)脫色3次其脫色率仍保持在79.2%，而王震文[16]通過紫外誘變得到的菌株YZU1每隔24 h 接入100 mg/L的活性黑5進行連續(xù)脫色2次后，脫色率已降至58%。尹亮[28]利用混合菌群共培養(yǎng)對100 mg/L的直接藍289連續(xù)脫色3次脫色率為76.4%。由此可見，菌株ZHT-3的連續(xù)持久脫色能力明顯優(yōu)于已報道的單一菌株和混合菌群，培養(yǎng)條件相對簡單，有利于工業(yè)應用。

菌株ZHT-3主要通過生物降解作用實現(xiàn)對陽離子藍的脫色，能夠使陽離子藍的偶氮鍵斷裂，從而破壞陽離子藍的生色團，達到脫色效果。有關陽離子藍脫色產(chǎn)物的結構及毒性、降解機制有待進一步研究，以期為染料廢水處理提供科學參考。