綿羊iPS細(xì)胞誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

張譯元，郭延華，王聰慧，唐 紅，南海艷，王立民，周 平

(1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000；2.陜西西安市閻良區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，西安 710000)

0 引 言

【研究意義】在綿羊的遺傳育種與品種改良進(jìn)程中，快速、定向選育具有某些優(yōu)質(zhì)性狀的新品種或品系，是綿羊種質(zhì)資源保護(hù)和綿羊生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。以往轉(zhuǎn)基因技術(shù)克隆成功率低，且獲得的轉(zhuǎn)基因后代個(gè)體往往存在繁殖障礙。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPS)。iPS細(xì)胞是一類具有無限增殖能力[1]和多向分化潛能[2]的細(xì)胞類群，可塑性強(qiáng)，能夠高效實(shí)現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入、敲除和改造。iPS最初是由日本科學(xué)家山中伸彌(Takahashi, Yamanaka, 2006)通過病毒載體將OCT4(Octamer binding transcription factor 4)、SOX2(SRY(sex determining region Y)-box2)、KLF4(Kruppel-like factor 4)、c-Myc(Myelocytomatosis oncogene)這四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入小鼠成纖維細(xì)胞中，使之重編程構(gòu)建出來的。如果把iPS細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)和基因打靶技術(shù)、細(xì)胞核移植技術(shù)、嵌合體技術(shù)相結(jié)合，對(duì)綿羊的轉(zhuǎn)基因育種和生產(chǎn)意義重大。【前人研究進(jìn)展】迄今為止，有關(guān)人(Homosapiens)[3,4]、小鼠(Musmusculus)[5]、大鼠(Rattusnorvegicus)[6]、猴子(Macacamulatta)[7]、豬(Susscrofa)[8]、綿羊(Ovisaries)[9]的iPS細(xì)胞系構(gòu)建均已有研究報(bào)道。2006年Takahashi和Yamanaka將小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞，并通過四倍體囊胚嵌合技術(shù)，進(jìn)一步證實(shí)小鼠iPS細(xì)胞能夠發(fā)育成完整的個(gè)體[10]。2007年Thomson和Yamanaka兩實(shí)驗(yàn)室又分別將人體皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞[3,4]。在綿羊iPS細(xì)胞系研究方面，Bao等[5]和Liu等[11]先后獲得了能形成畸胎瘤和擬胚體并具有正常核型的綿羊iPS細(xì)胞系。Liu等[11]將綿羊iPS細(xì)胞注射到二倍體或四倍體胚胎中，形成了內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的部分結(jié)構(gòu)，但未形成嵌合體。Sartori等[12]將Oct4、Sox2、 Klf4、c-Myc四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(OSKM)轉(zhuǎn)入綿羊成纖維細(xì)胞，形成了具有正常核型的iPS細(xì)胞，并形成畸胎瘤和擬胚體；將獲得的iPS細(xì)胞植入到胚胎后，生出了嵌合體小羊?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】綿羊iPSCs誘導(dǎo)技術(shù)取得了階段性進(jìn)展，但綿羊iPSCs形態(tài)特征及鑒定方法并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，誘導(dǎo)方法及培養(yǎng)條件也形色各異。目前，綿羊iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)基本采用病毒載體轉(zhuǎn)染的方式，存在一定安全風(fēng)險(xiǎn)；其次，由于物種不同，多能性基因、信號(hào)通路也會(huì)不同[13]，重編程因子的選擇對(duì)iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率會(huì)造成一定影響。因此，如何提高誘導(dǎo)效率、降低致癌率和抑制iPSCs的分化是目前綿羊iPSCs急需解決的問題。試驗(yàn)以綿羊成纖維細(xì)胞為基礎(chǔ)材料，通過電轉(zhuǎn)，導(dǎo)入五種轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、KLF4、l-Myc、Lin28，構(gòu)建綿羊iPS細(xì)胞系；在此基礎(chǔ)上結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)重點(diǎn)對(duì)不同誘導(dǎo)時(shí)期的iPS細(xì)胞進(jìn)行高通量測序?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析相關(guān)因子在誘導(dǎo)不同階段的表達(dá)變化，研究差異基因所涉及的信號(hào)通路，選擇更為適合綿羊iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的重編程因子，為豐富綿羊iPS建系機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)資料，為綿羊轉(zhuǎn)基因育種及動(dòng)物種質(zhì)資源保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)動(dòng)物來自新疆農(nóng)墾科學(xué)院轉(zhuǎn)基因種羊場。

重組質(zhì)粒：PCXLE-Hoct3/4-shp53(Oct3/4)、PCXLE-hSK(Sox2, Klf4)、PCXLE-hul(l-Myc, lin28)等，均購自美國Addgene公司，Lonza 4D-Nucleofector電轉(zhuǎn)儀與P2電轉(zhuǎn)染試劑盒購自德國LONZA公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購自TAKARA公司；堿性磷酸酶試劑盒、免疫熒光染色所用抗體購自上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司，DAPI 染料購自ROCHE公司。

1.2 方 法

1.2.1 綿羊iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)及培養(yǎng)

離心收集對(duì)數(shù)期的綿羊成纖維細(xì)胞，細(xì)胞密度至5×106mL-1；添加20 μL電轉(zhuǎn)液和重組質(zhì)粒，重懸細(xì)胞，選擇EH-100程序進(jìn)行電轉(zhuǎn)；靜置10 min，加入80 μL細(xì)胞培養(yǎng)液(10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)，混勻后全部移至培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)9～12 h后更換培養(yǎng)液，36 h時(shí)觀察細(xì)胞的貼壁情況。3 d后換成iPS細(xì)胞培養(yǎng)液(20% KSR、0.1 mol/L β-巰基乙醇、0.02 mol/L谷氨酰胺、0.01 mol/L非必需氨基酸(NEAA)、0.005 g/L b FGF的Knockout DMEM培養(yǎng)基)，培養(yǎng)液中添加終濃度為0.05 mg/L VC，隔天換液。

1.2.2 堿性磷酸酶(AP)染色

用4%(M/V)多聚甲醛固定iPS克隆樣細(xì)胞，15 min后棄固定液，PBS洗滌2次，滴加染色液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，待染色液掩蓋孔底，室溫避光15～20 min，棄染色液，PBS洗滌1次，顯微鏡下觀測染色結(jié)果。

1.2.3 免疫熒光染色

4%(W/V)多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，1×PBS浸洗2次，無水乙醇浸泡2次，每次20 min；1×PBS浸洗2次，吸水紙吸干PBS，在細(xì)胞上滴加5%(W/V)牛血清白蛋白(BSA)，37℃封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液，不洗，滴加足夠量稀釋好的一抗，4℃過夜孵育，PBST浸洗細(xì)胞3次，每次5 min；吸水紙吸干細(xì)胞上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，37℃孵育1 h，PBST浸洗細(xì)胞3次，每次5 min。復(fù)染核：滴加1 μg/mL的DAPI避光孵育5 min， PBST 5 min×3次洗去多余DAPI，吸水紙吸去細(xì)胞上殘余液體，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

提取細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以綿羊GAPDH基因(F: ACGGGAAGCTCACTGGCATGG R: GCCAGCCCCAGCATCGAAG)為靶標(biāo)，對(duì)Oct4(F: TACACTGTACTCTTCGGTCCCATT R: AGCATCATTGAACTTCACCTTCCC)、Sox2(F:TACGGTAGGAGCTTTGCAGAAAGT R: TGCACGTTTGCAACTGTCCTAAAT)、Nanog(F:CAAGTATTTCAGTTCCCAGCAGCA R: TGCACGTTTGCAACTGTCCTAAAT)基因使用LightCycler? 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche公司)進(jìn)行熒光定量PCR檢測，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，反應(yīng)進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，65℃再延伸1 min并在這一過程中進(jìn)行熔解曲線分析?；虻南鄬?duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算，使用GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理分析。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組測序

分別收集誘導(dǎo)0、10、20和30 d的細(xì)胞，由北京華諾生物科技有限公司提供測序服務(wù)，使用Illumina HiseqTM2000平臺(tái)測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序所得數(shù)據(jù)稱之為raw reads，將其測序接頭序列末端質(zhì)量低于20 bp的堿基、含N比率大于5%和質(zhì)量較低的reads去除，去除后的數(shù)據(jù)稱為clean reads。對(duì)clean reads使用Trinity軟件進(jìn)行De novo組裝得到Unigene，然后使用Tgicl軟件對(duì)這些序列進(jìn)行同源轉(zhuǎn)錄本聚類，得到最終的Unigene。之后將Unigene序列與蛋白數(shù)據(jù)庫NR、Swiss-Prot、KEGG和COG作blastx比對(duì)(evalue<0.000 01)，獲得相應(yīng)的注釋信息。針對(duì)Unigene表達(dá)量的計(jì)算，使用FPKM法(Fragments Per kb per Million fragments)。以FDR≤ 0.001且倍數(shù)差異在2倍以上的基因定義為差異表達(dá)基因，將所得到的差異基因GO數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫富集進(jìn)行注釋與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

該細(xì)胞排列緊密，呈圓形或不規(guī)則集落狀生長，形似鳥巢，在集落邊緣可見部分分化細(xì)胞。堿性磷酸酶染色(AP)呈強(qiáng)陽性。圖1

圖1 A：綿羊成纖維細(xì)胞；B：綿羊iPSC克??；C:綿羊iPSC克隆堿性磷酸酶染色
Fig.1 A: sheep fibroblast cells; B: OiPSC colony ; C: AP staining

2.2 免疫熒光檢測

對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)的綿羊iPS細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測，結(jié)果顯示克隆多能性蛋白SOX2、OCT4和表面標(biāo)記SSEA-1呈陽性。圖2

圖2 綿羊iPS細(xì)胞蛋白免疫熒光檢測
Fig.2 The immune fluorescence identification of OiPSC

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

隨機(jī)選取4個(gè)綿羊iPS細(xì)胞，以綿羊成纖維細(xì)胞為陰性對(duì)照，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測OCT4、SOX2、Nanog的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：綿羊iPS細(xì)胞中多能性基因的表達(dá)水平極顯著高于成纖維細(xì)胞(P< 0.01)。圖3

圖3 OiPSCs的Oct4、Sox2、Nanog基因的qPCR檢測
Fig.3 The quantitative PCR analysis of Oct4, Sox2 and Nanog in OiPSCs

2.4 轉(zhuǎn)錄組測序

2.4.1 不同誘導(dǎo)時(shí)期細(xì)胞RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)拼接

統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)0、10、20和30 d Unigenes數(shù)量，分別獲得55 795、47 416、48 069和48 927條Unigenes序列。

2.4.2 不同誘導(dǎo)時(shí)期差異基因的表達(dá)

不同誘導(dǎo)時(shí)期差異基因的表達(dá)水平(圖4A-B)。以誘導(dǎo)0 d的細(xì)胞作為對(duì)照，誘導(dǎo)30 d的細(xì)胞共獲得9 465個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因6 987個(gè)，下調(diào)基因2 478個(gè)。利用Blast2GO軟件，按照參與的細(xì)胞組分(Cellular Component)、分子功能(Molecular Function)和生物過程(Biological Process)(圖4C)對(duì)30和0 d的差異基因進(jìn)行分類注釋。經(jīng)比對(duì)共有5 374個(gè)差異基因?qū)Ρ鹊紾O數(shù)據(jù)上。在參與的生物學(xué)過程中，細(xì)胞過程(cellular process)所占比例最多，占12.6%，其次為單體過程(single-organism process)和代謝過程(metabolic process)，分別占10.5%和10.4%；在細(xì)胞成分(cell component)分類中，細(xì)胞組分(cell part)所占比例最多，占18.7%，其次是細(xì)胞(cell)和細(xì)胞器(organelle)，分別占18.6%和15.9%；在分子功能(molecular function)分類中，分子綁定(binding)所占比例最高，占49.3%，其次是催化活性(catalytic activity)和酶調(diào)節(jié)活性(enzyme regulator activity)，分別占25.6%和4.5%。圖4

圖4 30和0 d細(xì)胞中基因差異表達(dá)
Fig.4 Different UniGene expression profiles between 30 cell and 0 d cell

2.4.3 部分干性相關(guān)基因誘導(dǎo)0和30 d表達(dá)量差異性比較

利用Cufflinks軟件，計(jì)算每個(gè)Unigene在各個(gè)樣本中的表達(dá)量FPKM值，F(xiàn)PKM法能消除基因長度和測序量差異對(duì)計(jì)算基因表達(dá)的影響，計(jì)算得到的基因差異表達(dá)量可直接用于比較不同樣本間的基因表達(dá)差異。l-Myc、Sox2、Oct4在綿羊成纖維細(xì)胞重編程過程中基因表達(dá)量均呈上調(diào)趨勢，其中，l-myc和Sox2基因表達(dá)量差異性顯著，Oct4基因差異不顯著。圖5

2.4.4 誘導(dǎo)30和0 d細(xì)胞差異表達(dá)基因的KEGG富集

將已注釋的差異表達(dá)基因與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，共有5 773個(gè)基因比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫，共涉及到259條通路，其中富集通路最多的是剪接體通路，其次是卵母細(xì)胞成熟分裂通路和P53信號(hào)通路，說明這三條通路在綿羊多潛能干細(xì)胞誘導(dǎo)過程中最活躍。表1

圖5 RNA-Seq分析綿羊成纖維細(xì)胞重編程的基因表達(dá)
Fig.5 Gene analyses in reprogramming of Ovis fibroblasts using RNA-seq表1 差異表達(dá)基因KEGG代謝途徑分類
Table 1 KEGG classification of differentially expressed genes

序號(hào)NO.代謝通路Pathway差異基因的數(shù)量Count占差異基因通路注釋比例(%)通路IDPathway IDP值P value1剪接體1662.88Ko030407.726 391e-142卵母細(xì)胞成熟分裂881.52Ko041148.033 686e-133P53信號(hào)通路741.28Ko041155.583 583e-054同源重組300.52Ko034401.572 978e-055血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路480.83Ko043700.000 101 272 8

3 討 論

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞是經(jīng)體細(xì)胞重編程形成的，但重編程的分子調(diào)控機(jī)制至今尚未完全清楚，尤其是在大動(dòng)物的iPSCs的研究略有滯后。在綿羊iPSCs誘導(dǎo)技術(shù)方面最為成熟的是iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化成三胚層，并且能檢測到iPSCs的標(biāo)記。Li等[14]成功將慢病毒介導(dǎo)的Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四因子轉(zhuǎn)入綿羊成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)14 d后出現(xiàn)類似人胚胎干細(xì)胞樣形態(tài)的克隆，經(jīng)堿性磷酸酶染色、畸胎瘤三胚層組織學(xué)鑒定均證明是干細(xì)胞。Bao等[5]將四環(huán)素誘導(dǎo)慢病毒系統(tǒng)介導(dǎo)的Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)補(bǔ)充添加Nanog、Lin28、SV40 large T和人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶hTERT轉(zhuǎn)染至胎羊成纖維細(xì)胞，用Knockout血清替代品(Knockout serum replacement, KSR)代替胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞，11～20 d出現(xiàn)克隆，形態(tài)類似小鼠胚胎干細(xì)胞，經(jīng)堿性磷酸酶染色，Oct4、 Sox2、 Nanog、SSEA-1、Tra1-60以及Tra-1-81這些標(biāo)記物染色都為陽性。另有研究表明，盡管Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc這四個(gè)限定因子具有高度的保守性，但iPSCs的形態(tài)、增殖能力和相應(yīng)的分子機(jī)制存在種屬差異。譬如，人和小鼠的iPS細(xì)胞形態(tài)和自我更新的分子機(jī)制具有明顯的差異。與人和小鼠相比，綿羊iPSCs較難獲得[9]。一般認(rèn)為，Oct3/4 和 Sox2 是誘導(dǎo)多能性所需的核心因子，而Klf4 和 c-Myc則能提高Oct3/4和Sox2的誘導(dǎo)效率[15]。Esteban等[16]認(rèn)為，四因子誘導(dǎo)法中，去除c-Myc可獲得較好的iPS，建系成功率也顯著提高。Nakagawa等[17]研究表明，去除c-Myc誘導(dǎo)iPS細(xì)胞時(shí)，誘導(dǎo)時(shí)間較長且效率較低，但特異性強(qiáng)。這說明c-Myc的作用可能是促進(jìn)細(xì)胞的增殖而不是細(xì)胞的重編程[18]。研究采用Oct4、Sox2、Klf4、l-Myc、lin28五因子誘導(dǎo)法，結(jié)果顯示，在其他條件一致的情況下，選擇質(zhì)粒濃度質(zhì)量比1∶1∶1時(shí)，更有利于形成AP+克隆[19]。常見的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法包含病毒載體法、脂質(zhì)體法和電轉(zhuǎn)法等，鑒于電轉(zhuǎn)保護(hù)劑既能降低細(xì)胞死亡率，又能提高電轉(zhuǎn)效率，試驗(yàn)采取電轉(zhuǎn)法并且使用KSR代替胎牛血清培養(yǎng)綿羊iPS細(xì)胞，細(xì)胞傳代明顯增強(qiáng)，可傳至第4代。

細(xì)胞表面標(biāo)記能有效識(shí)別和區(qū)分多能干細(xì)胞，是鑒定多能干細(xì)胞重要的工具。SSEAs作為一種表面標(biāo)記物被廣泛用于監(jiān)測胚胎干細(xì)胞的多能性，它包括SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4。 Dattena等[20]報(bào)道，綿羊胚胎干細(xì)胞表達(dá)SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4，Li等[14]研究顯示，綿羊iPSCs只表達(dá)Oct4、Sox2、Nanog、SSEA-4，未表達(dá)SSEA-1和SSEA-3；而試驗(yàn)顯示綿羊iPSCs只表達(dá)Sox2、Oct4、SSEA-1，部分轉(zhuǎn)染的基因表現(xiàn)沉默。這可能與不同實(shí)驗(yàn)室采用的誘導(dǎo)方案及誘導(dǎo)產(chǎn)生iPSCs重編程程度有關(guān)，也有可能是其他一些因素影響了細(xì)胞狀態(tài)，尚需進(jìn)一步的試驗(yàn)佐證。Chin等[21]通過比較不同代數(shù)人iPS細(xì)胞和人胚胎干細(xì)胞的基因表達(dá)圖譜，結(jié)果顯示，代數(shù)高的人iPS細(xì)胞(第54～61代)比代數(shù)低的人iPS細(xì)胞(第5～9代)更接近于胚胎干細(xì)胞。由此推測，持續(xù)培養(yǎng)的過程對(duì)完善iPS細(xì)胞重編程意義重大。從試驗(yàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果來看，綿羊iPS細(xì)胞中多能性基因Oct4，Sox2，Nanog的表達(dá)量均顯著增高，和RNA-Seq的結(jié)果相一致，初步證實(shí)了獲得的iPS細(xì)胞具有一定的多能性。

比較綿羊iPSCs和用于重編程的成纖維細(xì)胞之間基因的表達(dá)情況對(duì)于了解綿羊多能性干細(xì)胞誘導(dǎo)的分子過程是非常重要的。高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)為揭示研究動(dòng)、植物基因表達(dá)及調(diào)控發(fā)揮了重要作用，尤其在側(cè)重了解動(dòng)物發(fā)育某一方面的基因表達(dá)，挖掘差異表達(dá)基因備受關(guān)注[22]。研究利用高通量測序技術(shù)構(gòu)建了誘導(dǎo)0、10、20和30 d細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組文庫，獲得了大量基因信息。重點(diǎn)針對(duì)誘導(dǎo)30和0 d的陽性細(xì)胞測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，篩選到的差異表達(dá)基因顯著富集在卵母細(xì)胞成熟分裂、同源重組、P53信號(hào)通路等通路上。其中，顯著富集的P53信號(hào)通路參與細(xì)胞的生長調(diào)控過程。已有研究證實(shí)，P53基因的突變和刪除與一系列腫瘤相關(guān)聯(lián)；P53基因編碼的蛋白在細(xì)胞損傷的情況下可誘導(dǎo)激活下游的P21蛋白，觸發(fā)DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡，P53～P21蛋白通路能抑制干細(xì)胞的分化和增殖，因此，抑制P53基因的表達(dá)可提高重編程的效率[23]。研究表明，敲除P53蛋白的和ASF1A蛋白能夠提高綿羊腎臟細(xì)胞重編程的效率[24]。有趣的是，不同于成熟細(xì)胞中的低水平P53，這種蛋白在ESC和iPSCs中呈高豐度表達(dá)[25]。研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了綿羊成纖維細(xì)胞在向著iPSC轉(zhuǎn)變。

4 結(jié) 論

利用電轉(zhuǎn)法將Oct4、Sox2、Klf4、l-Myc、Lin28五個(gè)轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入至綿羊成纖維細(xì)胞中，經(jīng)AP染色、細(xì)胞免疫熒光及熒光定量PCR檢測，細(xì)胞均呈陽性，且表達(dá)Oct4、Sox2、SSEA-1等多種ES細(xì)胞的多能性標(biāo)記基因；轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果獲得了大量的綿羊候選功能基因，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞組分、分子結(jié)合、細(xì)胞過程等諸多生理生化過程，同時(shí)參與多種信號(hào)通路，其中，P53信號(hào)通路顯著富集，且其在干細(xì)胞增殖方面起著非常重要的作用，獲得了綿羊誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。

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