鹽穗木根際土壤產ACC脫氨酶細菌的篩選與鑒定

張 盼，王偉楠，樊永紅

(新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046)

0 引 言

【研究意義】過度使用化肥、不合理的灌溉和植被大量的遭到破壞，鹽堿地每年都有增長的趨勢[1]。由于新疆特殊的地理和氣候條件，鹽堿地面積大[2]，可耕地的次生鹽堿化程度越來越高。在新疆，鹽穗木 (Halostachyscaspica) 一般生長在荒漠地區(qū)的鹽堿地[3]，它屬于藜科 (Chenopodiaceae) 鹽穗木屬半灌木鹽生植物，它是鹽堿地優(yōu)勢種[4]。具有ACC脫氨酶活性的植物根際促生菌可以在重金屬污染、鹽脅迫或干旱等逆環(huán)境下提高植物的抗逆性，促進植物的生長。從鹽穗木根際土壤中篩選出的產ACC脫氨酶活性較高菌株，為研究產ACC脫氨酶的關鍵基因提供原材料，為PGPR促進植物生長提供一定的前期基礎。這對于改良新疆的鹽堿地等地區(qū)的生態(tài)環(huán)境的修復具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】植物根際的土壤中存在一些細菌，這類細菌可以調節(jié)或促進植物生長發(fā)育，這些細菌被稱為植物根際促生細菌( plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR )，研究表明，PGPR能合成植物的某些生長激素或酶等調節(jié)和促進植物的生長[5]。植物根際促生細菌還能夠通過固氮、解磷和解鉀等特性改變土壤的理化性質，增加植物根系的吸收能力，提高植物對養(yǎng)分的吸收率,也能抑制土地中農作物致病菌的生長，并可以產生促進植物生長的一些重要激素[5]。PGPR還可以間接的分泌部分離子載體和產生抗逆性物質等方式切斷和終止植物致病菌對植物產生的負影響，通過產生植物激素，酶降解來減少乙烯含量水平等方式刺激與調節(jié)植物的生長。Glick等[6]研究發(fā)現(xiàn)細菌中能具有產1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶活性(1-aminocyclopropane-1-carboxylate，簡稱為ACC脫氨酶)功能的菌株分泌的ACC脫氨酶可以將植物體內過量的乙烯的直接前體ACC分解為a-丁酮酸和氨，降低乙烯的含量，調節(jié)或促進植物正常生長。植物在逆環(huán)境下受到脅迫時，根系處乙烯代謝會顯著性增強，而乙烯含量異常增加會抑制植物正常的生理生長，如加快葉片成熟、衰老和死亡，降低葉片光合作用，從而降低作物產量，并且會阻礙植株在脅迫因子消除后的復原[7-9]。【本研究切入點】在新疆，鹽穗木 (Halostachyscaspica) 一般生長在荒漠地區(qū)的鹽堿地[8]，它屬于藜科 (Chenopodiaceae) 鹽穗木屬的半灌木鹽生植物，它是鹽堿地的優(yōu)勢種[9]，采用篩選培養(yǎng)基定向富集的方法，目的是篩選到產ACC脫氨酶活性菌株。從其的根際土壤中篩選出的產ACC脫氨酶活性較高的菌株，為研究產ACC脫氨酶的關鍵基因提供原材料，以及為后續(xù)PGPR促進植物生長提供一定的前期基礎。這對于改良新疆的鹽堿地等地區(qū)的生態(tài)環(huán)境的修復具有重要的意義。【擬解決的關鍵問題】從新疆鹽穗木的根際土壤中篩選到產ACC脫氨酶活性較高的菌株，對其進行掃描電鏡的形態(tài)學觀察；革蘭氏染色、芽孢染色，硝酸鹽還原試驗、檸檬酸鹽利用等部分生理生化試驗，使用Biolog Gen III微孔板鑒定和16S rDNA序列同源性分析對分離的菌株進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鹽穗木

供試土樣采集于新疆五家渠荒漠鹽堿地的鹽穗木根際的土壤，土壤樣品儲存在-20℃冰箱備用。

1.1.2 主要試劑

TSB液體培養(yǎng)基、TSB固體培養(yǎng)基、PAF培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、DF培養(yǎng)基、ADF培養(yǎng)基，參照Penrose和張國壯等方法[10-11]。

1.1.3 主要儀器設備

Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)、電動移液器、濁度儀(Gen III MicroStation，美國Biolog公司)；臺式高速冷凍離心機(Neofuge 13R 德國)；顯微鏡(CX21FS1，OLYMPUS)；超凈工作臺(SW-CJ-IF，蘇州安泰空氣技術有限公司)；不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋(XXQ-SG46-28OS 上海搏迅安業(yè)有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(PYX-DHS-50×65 上海躍進醫(yī)療器械一廠)。

1.2 方 法

1.2.1 產ACC脫氨酶菌株的分離與篩選

采距離鹽穗木根系1～2 cm處的土壤，過60目篩 ，去除樹根等雜質，即得到根際土壤。分離篩選菌株的方法參照張國壯等[11]的方法進行。稱量2 g鹽穗木根系的土壤置于100 mL 無菌的PAF 液體培養(yǎng)基中，在 30℃ 、150 r/min條件下振蕩24 h；吸取2 mL 的菌懸液加入PAF 液體培養(yǎng)基，在 30℃ 、150 r/min條件下重復培養(yǎng)24 h，目的是使細菌富集。取2 mL富集培養(yǎng)液加入到100 mL的無菌DF液體培養(yǎng)基，在30℃ 、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h后再轉接培養(yǎng)一次；取上述轉接培養(yǎng)液2～100 mL無菌的含有3.0 mmoL/L ACC的液體 ADF培養(yǎng)基，在 30℃、150 r/min條件下重復篩選培養(yǎng)36 h后,梯度稀釋培養(yǎng)液，用無菌的玻璃涂布棒涂布于固體的ADF(加有3.0 mmoL/L ACC)培養(yǎng)基，長出菌落后，反復在固體的ADF培養(yǎng)基上分離純化，將純化后無雜菌的單菌落在TSB固體培養(yǎng)基的斜面上保存，并將含體積分數(shù)為15% 的甘油菌懸液放置于-20℃冰箱備用[12]。

1.2.2 ACC脫氨酶活性測定

參照Penrose和Glick等[10]的方法測定ACC脫氨酶的活性，ACC脫氨酶的單位酶活是指單位時間內ACC脫氨酶催化ACC生成α-丁酮酸的物質的量(μmoL)，即為一個單位酶活力(U)。以牛血清蛋白為標準蛋白，采用Bradford比色法測定蛋白質的含量[13]，每次試驗重復3次。

1.2.3 產ACC脫氨酶活性菌株鑒定

1.2.3.1 生長量

將篩選到的活性菌株的菌懸液按體積為1%比例加入滅菌的TSB液體培養(yǎng)基中，在 30℃ 、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h后測其生長量，生長量測定的方法采用吸光度比濁法，以無菌水為對照，在OD600測定[14]。

1.2.3.2 形態(tài)學的觀察、部分生理生化特征

將篩選分離的活性較高的菌株進行菌落形態(tài)學的觀察，生理生化的試驗，方法參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]和《微生物學實驗》[16]中與細菌相關的生理生化測定部分。

1.2.4 Biolog Gen III 微孔板鑒定

Biolog微生物的自動鑒定系統(tǒng) Gen III 板能對微生物進行94種表型的測試，包含：71種碳源利用的測試及23種化學敏感性的測試。測試的依據是根據四唑類氧化還原染料的色度變化來指示微生物對碳源的利用程度和對化學物質的敏感程度。在測試板上微生物所顯示出的特定的“表型指紋”被用來在種水平上進行鑒定[17-21]。

1.2.5 16S rDNA序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分

菌株分離純化后保存在TSB固體斜面上，放于-20℃冰盒中送往上海生物工程公司完成16S rDNA序列的測定。在GenBank數(shù)據庫中找到相似性最高的相關菌株的16S rDNA基因序列，進行Blast對比分析。采用MEGA6.0軟件中的鄰接法[22-24]。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

研究表明，1#、3#和5#菌株生存的土壤環(huán)境偏堿性，土樣A比土樣B的pH值要高出0.6；碳酸根離子含量 (g/kg)，重碳酸根離子(g/kg)，土樣A分別是土樣B的4倍和1.1倍；但是全鹽量(g/kg)，鈉離子(g/kg)，氯離子(g/kg)，鈣離子(g/kg)，鎂離子(g/kg)，硫酸根離子(%)土樣B分別是土樣A的2.10、1.78、2.65、11.17、5.29和2.29倍。5#菌株的生長所需要的各離子含量要比1# 和3# 菌株的生長所需要含量多。表1

表1 土壤理化性質
Table 1 Physical and chemical properties of soil

檢測項目Test itemsAB檢測項目Test itemsABpH值 pH value9.208.60 重碳酸根離子(g/kg)0.210.19全鹽量 Total salt (g/kg)16.2034.10鈣離子(g/kg)0.060.67鈉離子 Sodium ion (g/kg)4.528.06鎂離子(g/kg)0.422.22氯離子 Chloride ion (g/kg)4.9013.00硫酸根離子(%)0.491.12碳酸根離子 Carbonate ion (g / kg)0.240.06

2.2 產ACC脫氨酶菌株的篩選及其ACC脫氨酶活性

經過多次富集、分離純化，篩選三株具有ACC脫氨酶活性的菌株，編號為1#、3#、5#。分別取三株菌株2 mL的菌液加到無菌的TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在OD600測其生長量的變化，三株菌株培養(yǎng)2～6 h時，細菌快速的進入對數(shù)期，隨著培養(yǎng)時間的增加OD600緩慢的變化，在10 h后菌株緩慢的進入穩(wěn)定期。圖1

圖1 三株菌株生長曲線

Fig.1Growthcurveofthreestrains

經測定計算三株菌株的ACC脫氨酶的酶活力分別為0.186 1、0.176 3、0.249 0 μmoL，GraphPadPrism 5.0分析1# 與3# 之間酶活力差異不顯著，1# 與5#；3# 與5# 之間酶活力差異顯著 (P<0.05)，1#與3#之間酶活力差異不顯著，經計算1#、3#和5# 的酶比活力為0.012、0.012、0.014 U/mg。圖2

圖2 三株菌株酶活力
Fig.2 Enzyme activity of three strains

2.3 產ACC脫氨酶菌種鑒定

2.3.1 形態(tài)學的觀察、生理生化特征

三株菌株在ADF固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)均為圓形凸起，表面濕潤光滑，有光澤，邊緣整齊；1# 和3# 菌株菌落顏色為淡黃色，不透明的；5# 菌株菌落顏色為無色的，透明的。三株菌株均有芽孢，革蘭氏染色為陰性。硝酸鹽還原為陽性，能利用檸檬酸鹽。掃描電鏡圖中可以清晰的看到三株菌株均為短桿菌。表2，圖3，圖4

表2 三株產ACC脫氨酶細菌主要生理生化特征
Table 2 Main physiological and biochemical characteristics of three strains of ACC deaminase producing bacteria

測試項目Test items菌株 Strains1#3#5#測試項目Test items菌株 Strains1#3#5#檸檬酸鹽利用 Citric acid salt+++油脂水解---淀粉水解 Hydrolysis of starch+++甲基紅實驗---明膠液化 Gelatin liquefaction+++葡萄糖發(fā)酵+++淀粉水解 Aqueous solution+++蔗糖發(fā)酵+++石蕊牛奶 Lime cow milk+++乳糖發(fā)酵+++

注：“+”陽 性；-；陰 性

Note: "+" positive;-;negative

圖3 三株菌株菌落
Fig.3 Colony pictures of three strains

圖4 三株菌株的掃描電鏡

Fig.4Scanningelectronmicrographofthreestrains

2.3.2 Biolog法鑒定

菌株用專用的Biolog培養(yǎng)基培養(yǎng)1～2代后，在Biolog GenⅢ板微孔培養(yǎng)4～36 h后，用Biolog細菌鑒定系統(tǒng)進行快速的分析，用可能性(probability, PROB)、相似性(similarity, SIM)和距離 (distance, DIS) 三個參數(shù)來判斷鑒定結果，并在ID地址欄中顯示到最佳的匹配名稱。

研究表明，1#、3#和5# 在ID地址欄顯示出最佳的匹配名稱分別是Klebsiellapneumoniae，Klebsiellaoxytoca，Klebsiellaoxytoca。1#，PROB=0.503，SIM=0.503>0.5；

3#，PROB=0.596，SIM=0.596> 0.5；5#，PROB=0.939，SIM=0.689> 0.5。觀察三株菌株的代謝指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)三株菌株在GEN III 微孔板上對71不同碳源的利用情況是有所不同的，代謝指紋圖譜相應的也表現(xiàn)出明顯的差異。圖5

圖5 三株菌株在 Gen III板鑒定
Fig.5 Identification results of three strains in Gen III plates

2.3.3 16S rDNA基因測序的分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

根據16S rDNA序列測定可知1#、3#和5#菌株的DNA堿基對分別有1 446 bp、1 441 bp、1 355 bp。1#、3#和5# 菌株的核酸序列(BlastN)結果與克雷伯氏菌屬高度相似，判斷三株菌株均為克雷伯氏菌屬。表3

研究表明，1#和3#都聚在同一分支內,相似性達到98%，說明1# 和3# 為同一種菌，且與序列號為Y17657的菌株100%相似，因此，1#和3#菌株鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiellapneumoniae)；5#菌株與序列號為AF129440的菌株95%相似，相似性極高，因此，鑒定為5#菌株酸性克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)。圖6

表3 三株菌株的核酸序列(BlastN)比對
Table 3 Comparison of nucleic acid sequences (BlastN) of three strains

菌株Strain對同源性最高的菌株的描述(登錄號)Description of the strain with the highest homology (login number)最大值Max score總分Total score序列覆蓋Query cover(%)EE value相似度Ident1#Klebsiella pneumoniae strain 19051, complete genome(CP022023.1 )2 67121 254100%0.0100%3#Klebsiella pneumoniae strain MLST-15, complete genome(CP022127.1 )2 6621 186100%0.0100%5#Klebsiella oxytoca strain M1 16S ribosomal RNA gene,partial sequence(KC462193.1)2 4792 47999%0.099%

圖6 三株菌株的16S rDNA的序列系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.6 Sequence phylogenetic tree of 16S rDNA of three strains

3 討 論

微生物鑒定用傳統(tǒng)的方法費時費力，但鑒定結果準確性低等不足，而用Biolog可以快速的鑒定，并能大大縮短了試驗的周期，且鑒定系統(tǒng)會自動的顯示準確率較高的結果[25]，并結合16S rDNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，微生物鑒定的效率與準確性將大大的提高。然而在微生物鑒定中，Biolog微孔鑒定板的顯色受多種因素的影響，比如：微生物的種類，活性與數(shù)量，培養(yǎng)的溫度時間。在鑒定的過程中要嚴格按照Biolog GenⅢ 操作流程進行微生物的鑒定操作[26]，減少誤差。

國內外研究篩選的植物促生菌中部分菌株有生物防治的作用[27]，其中芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)被廣泛的研究，黎志坤等[28]篩選到一株番茄根際優(yōu)勢細菌YPP-9，其在番茄的根際有較好的定殖能力，并對植物青枯病菌茄科雷爾氏菌具有拮抗的作用。張冬冬等[29]從棉花土壤中分離的芽孢桿菌Z-5菌株，對棉花黃萎病有較高生物防治效果，能夠在棉花根際土壤及植株體內有效定殖。從鹽堿地篩選出的有ACC脫氨酶活性的PGPR能夠促進植物的生長，還能緩解鹽含量對植物的抑制作用[30-31]。Santoro等[32]篩選的PGPR能夠產IAA(吲哚乙酸)能力和溶磷能力，能提高香料作物的產量。龔鳳娟等[33]從杜仲根中篩選分離到具有ACC脫氨酶的菌株有Pseudomonaskoreensis、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)、變棲克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)和阿氏腸桿菌(Enterobacterasburiae)。張國壯等[11]從旱地小麥根系土壤中篩選分離到具有ACC脫氨酶的菌株，有阿氏腸桿菌(Enterobacterasburiae)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)，非脫羧勒克氏菌(Leclerciaadecarboxylata)?？梢园l(fā)現(xiàn)龔鳳娟，張國壯等[11]篩選到產ACC脫氨酶的菌株都以腸桿菌為主。

ACC脫氨酶能降低植物體內過量的乙烯，使植物在水澇、重金屬、干旱、鹽堿等逆環(huán)境下可以減少傷害正常的生長。在土壤中篩選產ACC脫氨酶活性的菌株，提高植物的抗逆性，促進或調節(jié)植物的生理生長，增加土壤鹽堿地的利用率，已成為國內外研究的熱點[34]。研究發(fā)現(xiàn)小麥種子用產ACC脫氨酶的細菌接種后，能明顯的減少干旱脅迫下對它生長的影響[35]。從生長于鹽漬土壤的油菜根際中篩出的產ACC脫氨酶細菌，研究表明這些細菌有助于提高油菜的耐鹽性[36-37]。

篩選出的三株產ACC脫氨酶細菌對農作物病原菌的抑菌活性，對植物的促生試驗，對農作物幼苗生長的促生作用和耐鹽堿試驗還需通過盆栽實驗驗證。

4 結 論

利用ACC為唯一的氮源，以鹽穗木根際土壤為樣品，定向富集，分離篩選到三株具有產ACC脫氨酶的菌株，進行菌落形態(tài)觀察和生理生化試驗，用Biolog和16S rDNA分子生物學這兩種方法對分離的三株菌株鑒定的結果中1#和5#菌株相吻合，1# 鑒定克雷伯氏菌屬(Klebsiellapneumoniae)，5#屬于酸性克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)，而3#菌株用兩種方法鑒定的結果不一致，16S rDNA分子生物學的方法鑒定的是克雷伯氏菌屬(Klebsiellapneumoniae)，但用Biolog GenⅢ 板鑒定，在ID地址欄中顯示到最佳的匹配名稱為酸性克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)，排在第二位的是克雷伯氏菌屬的Klebsiellapneumoniae，原因可能是在Biolog鑒定過程中由于操作不規(guī)范造成的，或是培養(yǎng)條件的原因引起的，經過生理生化試驗和形態(tài)學的觀察，綜合分析，3# 菌株最終鑒定為克雷伯氏菌屬的Klebsiellapneumoniae。

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