一次巧克力中沙門氏菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證結(jié)果與分析

◎ 孫 葳，趙 虹，胡 嵩，王 超

（1.遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧省疾病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110005）

沙門氏菌病是由沙門菌屬引起的疾病總稱，在世界各地的細(xì)菌性食物中毒事件中，沙門氏菌食物中毒排在首位，臨床表現(xiàn)多為敗血癥型和腸炎型，感染沙門氏菌的帶菌者排泄物可污染食品，進(jìn)而引起食物中毒、敗血癥、慢性腸炎等疾病[1]。能引起食物中毒的沙門氏菌血清型有很多，這次能力驗(yàn)證中檢查出一株雙相亞利桑那沙門氏菌，現(xiàn)結(jié)合多年檢驗(yàn)工作經(jīng)驗(yàn)分析此次能力驗(yàn)證工作，以期為未來檢驗(yàn)工作提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

由國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局組織，中國(guó)食品藥品檢定研究院發(fā)放的2018年NIFDC-PT-135巧克力中沙門氏菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證考核樣品3份，編號(hào)分別為CODE0461、CODE0593、CODE0615。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

①BPW增菌液、BS平板、SC增菌液、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（干粉）、沙門氏菌篩選顯色平板、TTB增菌液、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（干粉），購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。②氧化酶試劑、API 20E，購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司。③沙門氏菌診斷血清OMG、O60、He，n，x，購(gòu)自泰國(guó)S& A reagentsLab Ltd, part。④沙門氏菌診斷血清Hr、Hz15、HMC，購(gòu)自丹麥Statens Serum Institut。以上所用培養(yǎng)基及試劑均在保質(zhì)期內(nèi)，并已經(jīng)質(zhì)控合。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的處理

玻璃瓶的開啟應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。準(zhǔn)備90 mL預(yù)熱至45℃的滅菌BPW：首先取20 mL滅菌BPW加入檢樣瓶?jī)?nèi)，待巧克力樣品融化后加入無菌均質(zhì)袋內(nèi)。取20 mL滅菌BPW清洗檢樣瓶，將洗液加入均質(zhì)袋內(nèi)，再取20 mL滅菌BPW重復(fù)清洗一次，最后向均質(zhì)袋內(nèi)加入30 mL滅菌BPW，充分均質(zhì)混勻，制成1∶10稀釋液。依此方法，分別對(duì)3件樣品進(jìn)行前處理。樣品的融化參照GB/T 4789.24-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)糖果、糕點(diǎn)、蜜餞檢驗(yàn)》進(jìn)行。

1.2.2 增菌

①前增菌。將上述3份BPW增菌液，于（36±1）℃培養(yǎng)18 h。②選擇性增菌。輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)后的3份前增菌樣品溶液，分別移取1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL TTB，于（42±1）℃培養(yǎng)24 h。同時(shí)，分別另取1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL SC內(nèi)，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h。

1.2.3 分離

將上述選擇性增菌液劃線分離于沙門顯色平板、BS平板。BS平板（36±1）℃培養(yǎng)48h，沙門顯色平板（36±1）℃培養(yǎng)24 h，各平板上的菌落特征見表1。

表1 不同增菌液增菌后在沙門菌顯色平板和BS平板上菌落形態(tài)表

按照GB 4789.4-2016對(duì)各平板菌落特征分析判斷，將各可疑菌落編號(hào)為CODE0461-①～⑤、CODE0593-①～⑤、CODE0615-①～⑤，以上可疑菌繼續(xù)如下試驗(yàn)。

1.2.4 初步鑒定

將可疑菌接種三糖鐵瓊脂，（36±1）℃培養(yǎng)24 h；同時(shí)接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)，（36±1）℃培養(yǎng)24 h后染色鏡檢并做氧化酶試驗(yàn)?？梢删淙氰F試驗(yàn)及染色鏡檢、氧化酶試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 可疑菌落三糖鐵試驗(yàn)及染色鏡檢、氧化酶試驗(yàn)結(jié)果表

1.2.5 生化鑒定

將 CODE0461-① ～ ⑤、CODE0593-① ～ ⑤、CODE0615-①～⑤、做API 20E生化鑒定，鑒定結(jié)果如下：

CODE0461-①③④⑤：

?

編碼：0775000，鑒定為奇異變形菌，鑒定為：最好的鑒定%id=98.8

CODE0461-②：

ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA＋ ＋－－＋＋－－－－－＋＋＋＋＋＋＋＋＋

編碼：3604773，鑒定為枸櫞酸桿菌，鑒定為：最好的鑒定%id=99.9

CODE0593-①：

ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA－－－＋＋＋＋＋＋＋－＋－ － －－－－－－

編碼：0775000，鑒定為奇異變形菌，鑒定為：最好的鑒定%id=98.8

CODE0593-②③④⑤：

ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA＋－＋＋＋ ---－-－＋＋－＋＋ -＋－＋

編碼：5304552，鑒定為亞利桑那沙門氏菌，鑒定為：最好的鑒定 %id=83.6

CODE0615-①③④⑤：

ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA－－－＋＋＋＋＋＋＋－＋－－－－－－－－

編碼：0775000，鑒定為奇異變形菌，鑒定為：最好的鑒定%id=98.8

CODE0615-②：

ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA＋－＋＋－－－－＋－－＋＋－＋＋－＋－＋

編碼：5144552，鑒定為大腸桿菌，鑒定為：最好的檢定%id=99.9

1.2.6 血清學(xué)鑒定

將生化鑒定為沙門氏菌屬的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物做沙門氏菌的O抗原與H抗原血清凝集試驗(yàn)，先做O多價(jià)，再做H多價(jià)凝集，用0.5%瓊脂含量營(yíng)養(yǎng)瓊脂傳代培養(yǎng)后再作H多價(jià)凝集試驗(yàn)及H因子血清試驗(yàn)，血清試驗(yàn)結(jié)果如下：CODE0593-②③④⑤：O 多價(jià)OMG：++++，O:60: ++++，H 多 價(jià) HMC:++++，Hr: ++++，He,n,x：++++，He，n，z15：++++，HZ15:++++， 生理鹽水對(duì)照：-。

鑒定為：雙相亞利桑那沙門氏菌O:60：H1相r，H2相 e,n,x,z15。

1.2.7 實(shí)驗(yàn)過程質(zhì)控

將陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)菌株鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028及陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希氏菌ATCC 25922作為實(shí)驗(yàn)過程質(zhì)控，陽性對(duì)照檢出沙門氏菌，陰性對(duì)照未檢出。

1.2.8 實(shí)驗(yàn)方法比對(duì)

在傳統(tǒng)的方法的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行了全自動(dòng)免疫熒光分析（VIDAS）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（BAX Q7）、全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（VITEK 2），以及MALDI-TOF-飛行質(zhì)譜的方法比對(duì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)方法一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果

CODE0461用SC進(jìn)行2次增菌后，在沙顯平板上的無色小菌落鑒定為奇異變形桿菌、綠色中等大菌落鑒定為枸櫞酸桿菌，在BS平板上黑色小菌落鑒定為奇異變形桿菌；用TTB進(jìn)行2次增菌后，在沙顯平板上的無色小菌落鑒定結(jié)果為奇異變形桿菌，BS平板上的黑色小菌落鑒定為奇異變形桿菌。

CODE0593用SC進(jìn)行2次增菌后，在沙顯平板上的無色小菌落鑒定為奇異變形桿菌，藍(lán)綠色中等菌落鑒定為亞利桑那沙門氏菌，在BS平板上黑色有金屬光澤菌落鑒定為亞利桑那沙門氏菌；用TTB進(jìn)行2次增菌后，在沙顯平板上的藍(lán)綠色中等菌落鑒定結(jié)果為亞利桑那沙門氏菌，BS平板上的黑色有金屬光澤菌落鑒定為亞利桑那沙門氏菌。

CODE0615用SC進(jìn)行2次增菌后，在沙顯平板上的無色小菌落鑒定為奇異變形桿菌、綠色中等大菌落鑒定為大腸桿菌，在BS平板上黑色小菌落鑒定為奇異變形桿菌；用TTB進(jìn)行2次增菌后，在沙顯平板上的無色小菌落鑒定結(jié)果為奇異變形桿菌，BS平板上的黑色小菌落鑒定為奇異變形桿菌。

2.2 分析與討論

實(shí)驗(yàn)室在收到能力驗(yàn)證樣品后，首先應(yīng)檢查樣品包裝是否完好，仔細(xì)閱讀組織者提供的作業(yè)指導(dǎo)書，包括樣本如何保存等信息。實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)嚴(yán)格按照作業(yè)指導(dǎo)書的要求制訂檢驗(yàn)流程，認(rèn)真做好前期準(zhǔn)備工作[2]。

2.2.1 樣品的處理

樣品的前處理一定要嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行，因巧克力融化比較困難，所以一定要提前將培養(yǎng)基預(yù)熱，而且實(shí)際操作中，巧克力融化過程也較慢，一定要待巧克力完全融化后再將液體移入均質(zhì)袋中，檢樣瓶也應(yīng)反復(fù)慢慢沖洗，防止轉(zhuǎn)移和溶解過程中液體溢出。還應(yīng)注意的是檢樣瓶中的白色小球?yàn)楦稍飫?，如果干燥劑和巧克力粘連，應(yīng)待巧克力融化后再將干燥劑取出。

2.2.2 增菌與分離

因考核樣品中可能有干擾菌的存在，所以在2次增菌后，增菌液產(chǎn)生的分層現(xiàn)象和均勻渾濁現(xiàn)象都屬正常情況，不可輕易做出判斷。

平板劃線分離過程非常重要[3]，要把目標(biāo)菌盡量多地表達(dá)出來，應(yīng)分離出單個(gè)純菌落，并盡量多挑取可疑菌落，防止漏檢。應(yīng)以營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的純培養(yǎng)菌進(jìn)行生化試驗(yàn)[4]。

在分離過程中，樣品中某些干擾菌如奇異變形桿菌在BS培養(yǎng)基上與目標(biāo)菌菌落形態(tài)相似，因此各種形態(tài)的菌落均應(yīng)進(jìn)行后續(xù)生化鑒定以防止漏檢情況發(fā)生。常規(guī)判斷沙門氏菌在顯色培養(yǎng)基上為紫紅色菌落[5]，此次能力驗(yàn)證檢出沙門氏菌在顯色培養(yǎng)基上為藍(lán)綠色菌落，與大腸桿菌等干擾菌在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上形態(tài)相似，固應(yīng)引起重視。

2.2.3 血清型鑒定

本次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中使用的是進(jìn)口血清，在血清學(xué)鑒定之前，一定要用標(biāo)準(zhǔn)菌株做好質(zhì)控，確定無質(zhì)量問題后再使用。在血清凝集時(shí)，難點(diǎn)在于H抗原的第2相誘導(dǎo)[6]。本次實(shí)驗(yàn)第1項(xiàng)H抗原凝集后，進(jìn)行了位相變異實(shí)驗(yàn)，烘干0.4%半固體瓊脂平板表面水分，挑取H1相凝集血清1環(huán)，滴在半固體平板中間，待血清吸收后，在血清部位的中央點(diǎn)種待檢菌株，培養(yǎng)后，在蔓延生長(zhǎng)的菌苔邊緣取菌進(jìn)行H2相凝集試驗(yàn)[7-8]。

3 結(jié)論

在沙門氏菌檢測(cè)中，為避免漏檢現(xiàn)象的發(fā)生，應(yīng)對(duì)亞利桑那沙門氏菌與常見沙門氏菌的不同特征引起重視。建議盡量多選取不同特征的菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)，同 時(shí) 結(jié) 合 如 BAX Q7、VITEK2、VIDAS、MALDITOF-飛行質(zhì)譜等進(jìn)行比對(duì)，絕不能就單一平板上的菌落形態(tài)作出判斷。通過能力驗(yàn)證，可有效地檢驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平，同時(shí)在本次實(shí)驗(yàn)中，檢驗(yàn)人員的檢測(cè)水平和檢測(cè)質(zhì)量得到很大提高。