褪黑素激活大鼠大腦中動脈BKCa通道的受體依賴和非受體依賴途徑*

陳 渝， 徐召霞， 張慧榮， 吳 迎， 石麗君

(北京體育大學(xué)運動與體質(zhì)健康教育部重點實驗室， 北京 100084)

褪黑素(melatonin，MT)是松果腺分泌的主要激素，具有廣泛的生物學(xué)作用，如調(diào)節(jié)生物的晝夜節(jié)律、提高免疫力、改善睡眠、抗炎、抗氧化、抗衰老、抗高血壓等[1-3]。褪黑素通過調(diào)節(jié)動脈血管的內(nèi)徑，影響動脈血壓和局部器官及組織的血流量[4, 5]。大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large-conductance Ca2+-activated K+channels，BKCa)在血管平滑肌細(xì)胞膜上分布廣泛，與血壓密切相關(guān)[6]。當(dāng)其開放時，K+外流增加引起膜電位超級化，導(dǎo)致電壓依賴性鈣離子通道關(guān)閉，Ca2+內(nèi)流減少，使血管舒張[7]；相反，鉀通道關(guān)閉，引起膜電位去極化，[Ca2+]i升高，導(dǎo)致血管收縮。由于BKCa通道電流和KV通道電流是全細(xì)胞K+電流最主要的兩種成分，因此，加入特異性KV通道阻斷劑4-AP后，剩余電流為BKCa電流，加入特異性BKCa通道阻斷劑IbTX后，剩余電流為Kv通道電流。

褪黑素受體共三種亞型MT1，MT2和MT3受體。MT1，MT2受體屬于G蛋白耦聯(lián)受體，有7個跨膜段，均存在于心血管系統(tǒng)，且在腦動脈平滑肌細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中大量表達(dá)，表現(xiàn)為高親和力，具有飽和性、可逆性等特點[8]。褪黑素受體對血管壓力的調(diào)節(jié)作用主要是通過MT1和MT2受體進(jìn)行介導(dǎo)。前期有關(guān)腦動脈的研究表明，褪黑素對腦動脈的收縮起調(diào)節(jié)作用，這是由MT1和/或MT2受體激活后通過抑制BKCa通道介導(dǎo)的[9, 10]。盡管褪黑素對心血管的作用已被廣泛報道，但褪黑素對腦動脈平滑肌細(xì)胞上BKCa通道的直接作用即非受體依賴性作用卻知之甚少。褪黑素作為一種高脂溶性激素，可迅速擴(kuò)散到各組織器官，因此，褪黑素調(diào)節(jié)血管張力的效應(yīng)很可能是多種活性共同作用的結(jié)果。因此，我們推斷褪黑素可能通過受體依賴途徑和非受體依賴途徑對BKCa通道產(chǎn)生作用。鑒此，本實驗通過研究褪黑素對大腦中動脈BKCa通道電流的影響，旨在探討褪黑素通過BKCa通道介導(dǎo)血管張力變化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物模型

8周齡SPF級雄性Wistar大鼠，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，溫度控制在24°C左右，12∶12晝夜節(jié)律人工控制光照，以國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食水。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：褪黑素(melotonin)，2-苯基-N-乙酰色胺(luzindole)，4-氨基吡啶(4-AP)，蝎毒素(IbTX)，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，牛血清蛋白(BSA)，木瓜蛋白酶(papain)，二硫蘇糖醇(DTT)，F(xiàn)型膠原酶(collagenase F)，蛋白酶K (K-Asp)，腺苷-5'-三磷酸二鈉鹽(Na2ATP3)，乙二胺四乙酸(EGTA)均購自Sigma-Aldrich公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

溶液配制：分離緩沖液(mmol/L)：NaCl 137，KCl 5.6，MgCl21，Glucose 10，HEPES 10，Na2HPO40.42，NaH2PO40.44，NaHCO34.2，NaOH調(diào)pH至7.4。酶液(mg/ml)：BSA 2.0，papain 4.0，DTT 1.0，collagenase F 0.2溶于分離緩沖液中。全細(xì)胞記錄細(xì)胞外液(mmol/L)：NaCl 134，KCl 6，MgCl21，CaCl21.8，glucose 10，HEPES 10，用KOH調(diào)pH至7.4。全細(xì)胞記錄電極內(nèi)液(mmol/L)：K-Asp 110，KCl 30，EGTA 1，Na2ATP3，CaCl20.85，glucose 10，HEPES 10，KOH調(diào)pH至7.2。單通道記錄浴液(mmol/L)：KCl 45，K-Asp 100，EGTA 1，HEPES 10，glucose 5，KOH調(diào)PH值至7.4。單通道記錄電極內(nèi)液(mmol/L)：KCl 100，K-Asp 45，EGTA 1，HEPES 10，glucose 5，KOH調(diào)PH值至7.4。

主要儀器：垂直拉制儀(PC-10，Narashige，Japan)，數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(Axon Instruments，Digidata 1440，USA)，膜片鉗放大器(Axon Instruments，MultiClamp 700B，USA)，數(shù)據(jù)采集分析軟件(Axon Instruments，pClamp10.4，USA)

1.3 實驗設(shè)計

實驗以急性分離的大鼠腦中動脈平滑肌細(xì)胞作為研究對象，使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄K+電流，加入特異性KV通道阻斷劑4-AP (3 mmol/L)后記錄的電流為BKCa通道電流，加入特異性BKCa通道阻斷劑IbTX (100 nmol/L)后記錄的電流為KV通道電流。待電流幅值不再發(fā)生變化時加入褪黑素(100 μmol/L)觀察BKCa通道和KV通道的電流變化，確定褪黑素對BKCa通道的作用；加入褪黑素受體阻斷劑luzindole (1 μmol/L) 檢測褪黑素(100 μmol/L)對BKCa通道全細(xì)胞記錄模式的電流幅值和貼附式記錄模式不同電壓Po值的影響，觀察褪黑素激活BKCa通道的受體依賴途徑；采用內(nèi)面向外記錄模式檢測不同濃度褪黑素(1 μmol/L，100 μmol/L)對BKCa平均單通道電導(dǎo)(G)，Po值，To值和Tc值的影響，觀察褪黑素激活BKCa通道的非受體依賴途徑。

1.4 電生理記錄

1.4.1 急性腦中動脈平滑肌細(xì)胞分離 將全腦至于4℃分離緩沖液中。用鑷子將大腦中動脈剝離，剪成約1.5 mm的小段，放入酶液中，37℃水浴消化約25 min后用分離液漂洗3次，輕柔吹打后將所得細(xì)胞置于4℃冰箱，貼壁備用。

1.4.2 全細(xì)胞鉀電流記錄 將貼壁細(xì)胞換以全細(xì)胞記錄外液。電極采用垂直拉制儀兩步拉制，電極充灌電極內(nèi)液后，阻值為2～6 MΩ。采用傳統(tǒng)電壓膜片鉗技術(shù)記錄腦動脈平滑肌全細(xì)胞K+電流。將細(xì)胞鉗制在-70 mV，從-70 mV給予連續(xù)電壓刺激到+70 mV，階躍10 mV，刺激時間400 ms。加入3 mmol/L 4-氨基吡啶(4-AP)或者100 nmol/L IbTX測定KV通道和BKCa通道的電流幅值，在此基礎(chǔ)上，加入100 μmol/L的褪黑素，記錄電流幅值。

1.4.3 單通道BKCa通道電流記錄 采用貼附式和內(nèi)面向外模式記錄BKCa單通道電流，細(xì)胞內(nèi)外液采用對稱性高K+(145 mmol/L)溶液。電極充灌電極內(nèi)液后阻值為10～15 MΩ。采用通道的鉗制數(shù)量(N)和通道開放率(Po)的乘積NPO作為通道穩(wěn)態(tài)活性的指標(biāo)。 NPO標(biāo)準(zhǔn)化為通道最大開放概率。BKCa通道的數(shù)量是通過較高電壓和/或浴液Ca2+濃度對應(yīng)的最大電流水平進(jìn)行測定的。采用pClamp10.4軟件分析BKCa通道的Po值，幅值和動力學(xué)特征。NPO-voltage(V)關(guān)系采用Boltzmann方程進(jìn)行擬合：

PO=1/{1+exp[-ZF/RT(V-V1/2)]}

V1/2表示半數(shù)通道激活的膜電位，F(xiàn)表示法拉第常數(shù)，R為氣體常數(shù)，T為絕對溫度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 褪黑素增加大腦中動脈平滑肌全細(xì)胞BKCa通道電流

加入BKCa通道特異性阻斷劑IbTX (100 nmol/L)或KV通道特異性阻斷劑4-AP (3 mmol/L)后，再加入褪黑素(100 μmol/L)所得電流如圖1所示。為避免細(xì)胞表面積不同對全細(xì)胞K+電流大小產(chǎn)生影響，本文采用膜電容進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，即電流密度(pA/pF)。將細(xì)胞鉗制在+70 mV時，4-AP作用后電流幅值降低為原來的78.41%±6.85%，IbTX作用后電流幅值降低為原來的28.14%±3.11%，表明外向K+電流主要包含4-AP敏感的KV通道電流和IbTX敏感的BKCa通道電流。

4-AP孵育后，加入100 μmol/L褪黑素后，BKCa通道電流密度峰值增加至(37.81±3.50) PA/PF。而IbTX孵育后，加入相同濃度褪黑素后KV通道電流密度峰值無顯著變化，表明褪黑素激活BKCa通道，但不激活KV通道。

Fig.1Effects of melatonin on whole-cell IK

A: Whole-cell IKrecorded in the presence of 4-AP (3 mmol/L) or IbTX (100 nmol/L); B: Bar chart summarizing the inhibition of IKamplitudes after 4-AP and IbTX application (n=6); C: Current-voltage relationship showing the effect of melatonin (100 μmol/L) on the whole-cell IKdensity in the presence of 4-AP or IbTX; 4-AP: 4-aminopyridine; IbTX: Iberiotoxin; Mel: Melatonin

*P<0.05vscontrol

2.2 褪黑素通過MT1/MT2受體激活BKCa通道

為明確BKCa通道的激活是否由MT1/MT2受體介導(dǎo)，全細(xì)胞K+電流加入4-AP后余下BKCa通道電流，加入褪黑素受體抑制劑2-苯基-N-乙酰色胺(luzindole，1 μmol/L)作用細(xì)胞后再加入褪黑素(圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，luzindole對BKCa通道電流幅值無顯著影響，褪黑素使BKCa通道峰值電流密度從22.94±2.50 pA/pF增加至28.18±2.50 pA/pF。與未加luzindole對照組(從21.58±2.20 pA/pF增加至39.92±4.00 pA/pF)相比，褪黑素引起的電流密度峰值增加幅度顯著被抑制。表明褪黑素激活BKCa通道部分是由MT1/MT2受體介導(dǎo)。

Fig.2Melatonin activates BKCachannel through MT1/MT2 receptor

A: Currents of melatonin on whole-cell BKCachannels with or without MT1/MT2 receptor blocker (Luz, 1 μmol/L); B and C: Current-voltage relationship showing the effects of melatonin (100 μmol/L) on the whole-cell BKCacurrent density in the presence of 4-AP; C: Current-voltage relationship showing the effect of melatonin (100 μmol/L) on the whole-cell BKCacurrent density in the presence of 4-AP together with vehicle or Luz (n=6); Luz: Luzindole

2.3 褪黑素增加大腦中動脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道電壓敏感性

褪黑素對BKCa通道活性的影響采用細(xì)胞貼附記錄模式進(jìn)行觀察。如圖3所示，細(xì)胞內(nèi)外液采用對稱性高K+(145 mmol/L)溶液，細(xì)胞鉗制階躍電位從0 mV到+50 mV ([Ca2+]free=1 μmol/L)。結(jié)果顯示，隨著膜電位增加，BKCa單通道Po值顯著增加。褪黑素(100 μmol/L)顯著增加Po值。Po-電壓曲線采用Boltzmann方程進(jìn)行擬合，計算通道開放半數(shù)所對應(yīng)的電壓(V1/2)。與未加藥(V1/2=48.87±0.41 mV)相比，加入100 μmol/L褪黑素(V1/2= 40.27±0.66 mV)后V1/2顯著下降，但加藥前后斜率無顯著變化。

為確定褪黑素激活BKCa通道是否通過MT1/MT2受體，加入luzindole (1 μmol/L)后，將細(xì)胞鉗制在+40 mV，100 μmol/L褪黑素使通道Po增加1.71±0.21倍，顯著低于未加藥對照組(4.62± 0.50倍)，而單獨加入luzindole對BKCa通道的活性無顯著影響。表明luzindole能顯著抑制褪黑素引起的BKCa通道Po增加。

Fig.3Effects of melatonin on BKCachannels in cell-attached patch-clamp configuration

A: Single-channel currents of melatonin acting on BKCachannels at different membrane voltage; B: Effects of melatonin on voltage sensitivity of BKCachannels. Curves were fitted with the Boltzmann equation; C: Melatonin acting on single BKCacurrents with and without Luzindole at the holding potential of +40 mV; D: Bar chart summarizing the melatonin-induced increase of Po (fold of control) between groups (n=6) ; Po: Open probability

*P<0.05vsmelatonin-only treated group

2.4 褪黑素增加腦動脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道開放概率

如圖4所示，采用內(nèi)面向外膜片鉗記錄模式觀察褪黑素對BKCa通道活性和門控特性的影響。在含0.1 μmol/L Ca2+對稱的145 mmol/L K+溶液中加入1 μmol/L，100 μmol/L的褪黑素，線性擬合平均單通道電導(dǎo)(G)為285.70±25.30 pS(n=6)，表明褪黑素對通道電導(dǎo)無顯著影響。

為進(jìn)一步了解不同濃度褪黑素對BKCa通道門控特性的影響，將細(xì)胞鉗制在+40 mV，褪黑素使Po值顯著增加，并呈濃度依賴性。 褪黑素作用后通道平均開放時間(To)14.63±1.88 ms (1 μmol/L)，8.83±1.08 ms (100 μmol/L)，均較未加褪黑素組(25.78±3.30 ms)顯著減少。平均關(guān)閉時間(Tc)為88.47±15.39 ms (1 μmol/L)，31.75±5.96 ms (100 μmol/L)，也均較未加褪黑素組(218.71± 36.50 ms)顯著減少，但Tc減少幅度顯著高于To減少幅度。因此，褪黑素顯著增加BKCa單通道的Po值。

Fig.4Effects of melatonin on BKCachannels in inside-out patch-clamp configuration

A: Representative recordings of single-channel currents at a membrane voltage of +40 mV in the presence or absence of melatonin (0, 1 and 100 μmol/L); B: Summary of the conductance, Po, dwell time of open state and closed state (n=6)

*P<0.05vscontrol (0 μmol/L melatonin);#P<0.05vs1 μmol/L melatonin

3 討論

本研究結(jié)果表明，褪黑素通過直接和結(jié)合MT1/MT2受體間接激活大腦中動脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道。這是褪黑素在腦動脈循環(huán)中第一次被發(fā)現(xiàn)通過非受體依賴途徑和受體依賴途徑激活BKCa通道介導(dǎo)血管舒張功能。

腦血管疾病和腦循環(huán)密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)短暫性腦缺血發(fā)作患者顱內(nèi)血管病變中大腦中動脈最多，主要為大腦中動脈狹窄。因此，本研究選取大腦中動脈作為研究對象。褪黑素對血管張力的影響目前已有大量研究報道，但其結(jié)果并不一致。如Régrigny等人[10]發(fā)現(xiàn)褪黑素引起麻醉大鼠的微小腦動脈收縮，而Geary[11]和Lew[12]等則發(fā)現(xiàn)褪黑素單獨作用對大鼠尾動脈血管張力無顯著影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)褪黑素激活BKCa通道，使膜超極化，這與前人研究結(jié)果不同。褪黑素產(chǎn)生不同結(jié)果的原因目前仍不清楚。我們推測這可能與實驗方法不同有關(guān)，Régrigny等人將大鼠麻醉后，在體研究褪黑素對腦動脈血管張力的影響，Geary和Lew等采用離體尾動脈觀察褪黑素對血管張力的影響，均是對血管組織進(jìn)行研究。而本研究采用細(xì)胞實驗觀察褪黑素對單個血管平滑肌細(xì)胞BKCa通道的影響，未從血管組織層面觀察褪黑素的整體影響，這可能是產(chǎn)生不同結(jié)果的原因。此外，褪黑素引發(fā)的不同結(jié)果與動脈的不同有關(guān)。Geary和Lew采用大鼠尾動脈作為研究對象，雖然本研究與Régrigny等人的研究對象均為大鼠腦動脈，但Régrigny等人主要以血管壁較薄的微小動脈作為研究對象，而本研究則主要側(cè)重于大腦中動脈，這也可能是產(chǎn)生不同結(jié)果的原因。

研究發(fā)現(xiàn)褪黑素具有較強的抗氧化應(yīng)激作用[3]。褪黑素的舒血管作用在L-NAME存在時下降[13]，表明褪黑素可能通過抗氧化作用增強eNOS活性，進(jìn)而增強血管舒張作用。eNOS催化左旋精氨酸產(chǎn)生NO，血管內(nèi)皮中NO的產(chǎn)生對BKCa通道起調(diào)節(jié)作用[14, 15]。為避免內(nèi)皮細(xì)胞對BKCa通道產(chǎn)生影響，本文采用大腦中動脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行研究。非生理條件或者藥物干預(yù)可顯著增加血清褪黑素水平，因此本研究參考Anwar[16]和Da[17]等人采用較高濃度的褪黑素進(jìn)行觀察，較高濃度的褪黑素顯著性激活BKCa通道。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)運動顯著增加高血壓大鼠褪黑素水平，景會鋒等人也報道運動提高2型糖尿病大鼠褪黑素水平，這為運動調(diào)節(jié)血管張力提供一定的理論依據(jù)。此外，褪黑素常作為藥物治療高血壓，腦缺血，抑郁等疾病，本研究采用較高濃度褪黑素進(jìn)行細(xì)胞實驗，為外源性褪黑素的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。BKCa電流加入褪黑素后電流密度峰值顯著增加，而KV通道電流加入褪黑素后無顯著影響，表明褪黑素激活BKCa通道，但對KV通道無顯著影響。

由于褪黑素具有高親脂性，能迅速通過細(xì)胞膜[18]，因此，我們推測褪黑素不僅通過褪黑素受體間接激活BKCa通道，也有可能直接作用BKCa通道，引起血管舒張。為探討褪黑素激活BKCa通道的受體依賴途徑，本研究采用全細(xì)胞和單通道貼附式記錄模式觀察褪黑素受體阻斷劑對BKCa通道的影響。在褪黑素受體阻斷劑luzindole作用BKCa通道后，BKCa通道電流無顯著影響，表明luzindole本身對BKCa通道無影響，而luzindole孵育后加入褪黑素發(fā)現(xiàn)BKCa通道電流增加幅值較未加抑制劑組顯著減小，表明褪黑素引起的腦中動脈血管舒張部分是通過MT1/MT2受體激活BKCa通道。這與前人關(guān)于褪黑素通過G-蛋白-耦聯(lián)的膜受體，MT1和MT2兩種受體亞型影響血壓的研究結(jié)果相同[19]。細(xì)胞貼附式記錄結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Luzindole抑制褪黑素引起的BKCa通道Po值增加，這與全細(xì)胞記錄結(jié)果一致。為了確定褪黑素激活BKCa通道的非受體依賴途徑，本研究采用單通道內(nèi)面向外記錄模式觀察褪黑素對BKCa通道的直接作用。將細(xì)胞鉗制在+40 mV，褪黑素使BKCa通道Po值顯著增加，并呈濃度依賴性。這與貼附式記錄模式結(jié)果一致。

綜上所述，褪黑素可通過受體依賴途徑和非受體依賴途徑激活腦動脈BKCa通道，介導(dǎo)大腦中動脈血管舒張。