有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合破壁蛋白核小球藻對(duì)高脂膳食大鼠脂代謝某些指標(biāo)的影響*

張 靜， 繆 剛， 曹建民， 周海濤△， 牛衍龍， 張 岳 ， 任 奕 ， 包欣悅 ， 邢雅雯

(1. 北京聯(lián)合大學(xué)， 北京 100023， 2. 北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100191； 3. 北京體育大學(xué)， 北京 100084； 4. 贛南醫(yī)學(xué)院, 江西 贛州 341000)

改革開(kāi)放以來(lái)，人民健康水平和身體素質(zhì)持續(xù)提高。但隨著我國(guó)工業(yè)化、城鎮(zhèn)化、人口老齡化進(jìn)程不斷加快，居民生活方式、生態(tài)環(huán)境、食品安全狀況等對(duì)健康的影響日益凸顯。慢性病發(fā)病、患病和死亡人數(shù)不斷增多，群眾經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)日益沉重。我國(guó)居民不良的飲食習(xí)慣和生活方式長(zhǎng)時(shí)間、大范圍的存在，導(dǎo)致肥胖人群數(shù)量激增。研究證明，日常飲食中過(guò)量攝入的熱量不僅不能為機(jī)體充分、有效地消耗與利用，還會(huì)引發(fā)體內(nèi)脂肪合成及游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)的異常增多。FFA的增多可以誘發(fā)機(jī)體脂毒性和肥胖慢性炎癥，導(dǎo)致代謝性疾病的發(fā)病機(jī)率上升。FFA刺激體內(nèi)脂肪組織釋放多種炎癥因子。在FFA和炎癥因子共同作用下，機(jī)體各主要器官長(zhǎng)期處于低度炎癥狀態(tài)，最終形成以胰島素抵抗為主要特征的糖、脂代謝紊亂狀態(tài)，出現(xiàn)以腹型肥胖、血脂紊亂、糖尿病和高血壓等聚集傾向的代謝綜合征癥候群，引起機(jī)體多種代謝性疾病的發(fā)生，對(duì)人類(lèi)健康造成極大的威脅[1]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)此給予高度的關(guān)注。其中肥胖引發(fā)的“脂毒性炎癥反應(yīng)”正成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。運(yùn)動(dòng)和營(yíng)養(yǎng)是健康的兩個(gè)支柱。小球藻含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和保健作用。研究表明小球藻能夠增強(qiáng)免疫低下動(dòng)物的細(xì)胞免疫功能，并具有抗脂質(zhì)血癥與抗動(dòng)脈粥樣硬化等生物活性作用[2]。但小球藻對(duì)脂代謝及肝臟脂毒性的影響尚有待于進(jìn)一步的深入研究和探討。本研究采用有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合破壁蛋白核小球藻對(duì)高脂膳食大鼠進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠Lee’s指數(shù)，血清、肝臟組織FFA，血清白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、甘油三脂(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)，肝臟白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)含量的比較與分析，探討有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合小球藻改善高脂膳食大鼠脂代謝及對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用，對(duì)于積極、有效地預(yù)防和延緩因肥胖導(dǎo)致的代謝性疾病的發(fā)生與發(fā)展具有重要意義。同時(shí)也為蛋白核小球藻的深度開(kāi)發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)55只雄性Wistar大鼠，42 d齡，平均體重(194.13±13.24)g[北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，合格證編號(hào)SCXK(京)2006-0008]。

1.2 試驗(yàn)用藥

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，產(chǎn)自山東濱州，東營(yíng)倍康生物科技有限公司購(gòu)得，批號(hào)17042807。將已經(jīng)采用低溫高速氣流破碎法破壁的蛋白核小球藻(以下簡(jiǎn)稱(chēng)小球藻)勻質(zhì)器粉碎后以無(wú)菌蒸餾水配制成所需濃度，4℃存放備用。

1.3 主要儀器

STAT FAX 2100全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)阿尼朗斯)；FA2004N電子天平(上海精密儀器有限公司)、ALCYON300全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)雅培)；LG 10-3A高速冷凍離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；SHH.W21.Cr600型三用電熱恒溫水箱(北京市東霞科學(xué)儀器廠)；Light Cycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士羅氏)。

1.4 動(dòng)物分組

55只實(shí)驗(yàn)大鼠在經(jīng)過(guò)適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后，進(jìn)行為期3 d、20 min/d的游泳訓(xùn)練，篩選淘汰5只不適應(yīng)游泳訓(xùn)練的大鼠后，將剩余的50只大鼠按體重以數(shù)字隨機(jī)分組法分為5組(直接標(biāo)號(hào)法編號(hào))：普通膳食+安靜對(duì)照組(C組)、高脂膳食+安靜對(duì)照組(H組)、高脂膳食+小球藻+安靜對(duì)照組(HC組)、高脂膳食+有氧運(yùn)動(dòng)組(HM組)、高脂膳食+有氧運(yùn)動(dòng)+小球藻組(HMC)，每組10只。各組大鼠每天自由攝食飲水。C組大鼠以普通飼料(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)啃齒類(lèi)動(dòng)物飼料，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供)常規(guī)喂養(yǎng)；其余各組以高脂飼料(60%脂肪熱量比飼料，北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司提供)喂養(yǎng)；HC組和HMC組大鼠每天在訓(xùn)練前半小時(shí)采用專(zhuān)業(yè)灌胃器灌胃小球藻1次，灌胃劑量為3.9 g/(kg·d)，相當(dāng)于成人推薦劑量的30倍(預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳劑量)，灌胃體積為5 ml/kg，其余各組ig等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》規(guī)定對(duì)待實(shí)驗(yàn)用大鼠。實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)溫度和相對(duì)濕度分別控制在(22±2)℃和55%～75%，光照時(shí)間隨自然變化。HM、HMC組大鼠按照表1的訓(xùn)練方案進(jìn)行無(wú)負(fù)重游泳訓(xùn)練[3]，其他組不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)。大鼠在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中如出現(xiàn)數(shù)秒內(nèi)未迅速浮上水面等疲勞現(xiàn)象，即刻撈出休息5～10 min，待恢復(fù)后再繼續(xù)完成規(guī)定訓(xùn)練時(shí)間。

Tab. 1 Swimming training program in rats[2](min)

1.5 Lee’s 指數(shù)測(cè)定

1.6 生化指標(biāo)測(cè)定

ELISA法檢測(cè)血清IL-6、TNF-α、FFA及肝臟組織FFA、IL-10。GPO-PAP法檢測(cè)TG、TC，直接法檢測(cè)HDL-C和LDL-C，以上各指標(biāo)的測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，計(jì)算公式等詳見(jiàn)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。

各組在末次訓(xùn)練24 h后，禁食(不禁水)12 h，乙醚適度麻醉，從頸總動(dòng)脈處取5 ml全血。迅速取肝臟置于預(yù)冷的4℃生理鹽水中充分洗滌以洗凈血污，剝掉表面結(jié)締組織的脂肪，濾紙吸干表面水份后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

組織勻漿制備：精確稱(chēng)取100 mg 肝臟組織，其放入玻璃勻漿管口剪碎。按W(g)組織塊重量/V(ml)勻漿介質(zhì)為1 / 9 的比例加取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(0.9 %的生理鹽水)進(jìn)行勻漿。

血清制備：37℃自然凝固，待血清出現(xiàn)后，放入冰箱24 h后，4℃、3 000 r/min離心10 min，得到的上清液即為血清。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

根據(jù)2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析，將H組、HC組、HM組及HMC組大鼠的Lee’s指數(shù)、血清和肝臟相關(guān)生化指標(biāo)等數(shù)據(jù)納入分析。對(duì)于交互作用，檢驗(yàn)結(jié)果P<0. 05，表明有氧運(yùn)動(dòng)和破壁蛋白核小球藻之間存在交互作用。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Lee’s 指數(shù)的變化

實(shí)驗(yàn)前，各組大鼠Lee’s指數(shù)無(wú)顯著性差異；實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠Lee’s指數(shù)均呈不同程度的升高趨勢(shì)。至第6周末，與C組比較，H組顯著升高(P<0.01)；與H組比較，HC組、HM組、HMC組均顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與HC組、HM組比較，HMC組均顯著性降低(P<0.05，表2)。

2.2 各組大鼠血清及肝臟FFA，血清IL-6、TNF-α，肝臟IL-10含量的變化

至第6周末，血清、肝臟FFA含量，血清IL-6、TNF-α，肝臟IL-10含量，與C組比較，H組均顯著升高(P<0.01)；與H組比較，HC、HM、HMC組均顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與HC組、HM組比較，HMC組均顯著降低(P<0.05，表3)。

2.3 各組大鼠血脂的變化

高脂飼料喂養(yǎng)及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練、營(yíng)養(yǎng)干預(yù)6周后，與C組比較，H組血清TC、TG、血清LDL-C水平均顯著升高(P<0.01)；血清HDL-C水平顯著降低(P<0.01)。與H組比較，HC、HM、HMC組血清TC、TG、血清LDL-C水平均顯著降低(P<0.05或P< 0.01)，血清HDL-C水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與HC組、HM組比較，HMC組血清TC、TG、血清LDL-C水平均顯著降低(P<0.05)；血清HDL-C水平顯著升高(P<0.05，表4)。

Tab. 2 Changes of Lee's index of each group n=10)

C: Normal diet +quiet control; H: High fat diet; HC: High fat diet + Chlorella + quiet control; HM: High fat diet + aerobic exercise; HMC： High fat diet + Chlorella +aerobic exercise

*P<0.05，**P<0.01vsgroup C;#P<0.05，##P<0.01vsH;△P<0.05，△△P<0.01vsHMC

Tab. 3 Changes of serum, liver FFA, serum IL-6,TNF-α, liver IL-10 content in rats of each n=10)

C: Normal diet +quiet control; H: High fat diet; HC: High fat diet + Chlorella + quiet control; HM: High fat diet + aerobic exercise; HMC： High fat diet + Chlorella +aerobic exercise

*P<0.05，**P<0.01vsgroup C;#P<0.05，##P<0.01vsH;△P<0.05，△△P<0.01vsHMC

Tab. 4 Changes of blood lipid in rats of each group(mmol/L, n=10)

C: Normal diet +quiet control; H: High fat diet; HC: High fat diet + Chlorella + quiet control; HM: High fat diet + aerobic exercise; HMC： High fat diet + Chlorella +aerobic exercise

*P<0.05，**P<0.01vsgroup C;#P<0.05，##P<0.01vsH;△P<0.05，△△P<0.01vsHMC

3 討論

當(dāng)人體日常飲食中攝入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所提供的能量與自身能量消耗無(wú)法收支平衡時(shí)，過(guò)剩的能量將會(huì)以脂肪和糖原的形式貯存于體內(nèi)。脂肪組織是這部分剩余能量最好的儲(chǔ)存位置。但過(guò)多的脂肪堆積會(huì)造成脂肪細(xì)胞體積增大，數(shù)量增多。同時(shí)，多余的能量超出脂肪組織的貯存容量后，會(huì)引發(fā)能量的溢出，并以FFA的形式釋放進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)。當(dāng)血液中FFA水平超過(guò)脂肪組織的儲(chǔ)藏和組織對(duì)脂肪酸氧化的能力時(shí)，過(guò)多的FFA就會(huì)轉(zhuǎn)入對(duì)機(jī)體有害的非氧化代謝途徑并沉積于心臟 、肝、骨骼肌等非脂肪組織器官。異常增多的FFA具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性并可刺激體內(nèi)脂肪組織釋放更多炎癥因子，二者的共同作用，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，可引發(fā)組織細(xì)胞功能障礙或凋亡，導(dǎo)致脂肪肝等脂代謝疾病的發(fā)生[4]。醫(yī)學(xué)上將這一現(xiàn)象稱(chēng)之為“脂毒性”。異常增多的FFA是脂毒性作用的主要因素[5]。同時(shí)FFA在非脂肪細(xì)胞內(nèi)會(huì)激活非氧化通路脂化為T(mén)G，并形成“異位沉積”，對(duì)肝臟等非脂肪組織器官造成損傷。TNF-α和IL-6是公認(rèn)的評(píng)價(jià)炎癥反應(yīng)的有效指標(biāo)[6-7]。IL-10則可以通過(guò)有效地抑制炎癥細(xì)胞分泌、產(chǎn)生IL-1、IL-6等多種炎癥因子，調(diào)節(jié)和控制炎癥反應(yīng)，預(yù)防和控制炎癥損傷的發(fā)生與發(fā)展，保護(hù)組織。Lee’s指數(shù)可以作為反映大鼠肥胖程度的良好指標(biāo)[8]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明H組大鼠由于能量收支不平衡，過(guò)剩的能量?jī)?chǔ)存于脂肪組織，脂肪細(xì)胞體積及數(shù)量均發(fā)生改變，出現(xiàn)明顯的腹型肥胖及Lee’s指數(shù)和血脂升高。增大的脂肪細(xì)胞貯存容量和能力有限，脂肪組織代謝分解釋放大量FFA進(jìn)入血液后經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)流經(jīng)門(mén)靜脈及肝臟時(shí)，血液中FFA 水平的急劇升高超過(guò)肝臟組織氧化脂肪酸的能力，肝臟組織中FFA水平升高。過(guò)多的 FFA轉(zhuǎn)入對(duì)機(jī)體有害的非氧化代謝途徑，刺激體內(nèi)脂肪組織釋放過(guò)量的TNF-α、IL-6等炎癥因子，并在 FFA 和炎癥因子共同作用下，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，對(duì)肝臟細(xì)胞產(chǎn)生毒性損害作用。肝臟組織分泌產(chǎn)生大量IL-10以抵御炎癥反應(yīng)。同時(shí)異常增多的FFA增加肝臟脂質(zhì)合成和TG的異位沉積，脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和TG代謝能力明顯降低，大鼠出現(xiàn)脂肪肝和高脂血癥。這一結(jié)果與其他學(xué)者的研究相一致[9]。

HC組采用小球藻對(duì)高脂膳食大鼠進(jìn)行干預(yù)，有效地抑制血液及肝臟中FFA濃度的升高和TG代謝能力的降低，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，降低“脂毒性”作用和相關(guān)炎癥因子的過(guò)量生成和釋放，保護(hù)肝臟。其機(jī)制可能為：(1)小球藻中含有其它微藻所不具有的物質(zhì)-小球藻生長(zhǎng)因子(chlorella growth factor，CGF)。GCF中的糖蛋白具有增強(qiáng)免疫力和促進(jìn)白血球吞噬細(xì)菌的機(jī)能。增強(qiáng)免疫力的同時(shí)可以有效地降低血清中膽固醇含量[10]。(2)小球藻中含有的多種活性物質(zhì)(多種維生素(包括維生素C、維生素E)、小球藻多糖、類(lèi)胡蘿卜素)?；钚晕镔|(zhì)可以有效地增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，阻止集體炎癥反應(yīng)的發(fā)生，調(diào)解體內(nèi)代謝的動(dòng)態(tài)平衡的作用，抑制過(guò)量FFA對(duì)機(jī)體特別是肝臟的損傷[11-13]。(3)小球藻中含有的高度不飽和脂肪酸，可以有效地降低血液中TC和LDL-C的含量及血液粘稠度[14]。(4)小球藻可以通過(guò)對(duì)肝臟內(nèi)核糖核酸的作用促進(jìn)機(jī)體核蛋白的合成，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，并具有抗脂質(zhì)血癥與抗動(dòng)脈粥樣硬化活性等作用[2]。

HM組采用有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食大鼠進(jìn)行干預(yù)，有效地抑制血液及肝臟中FFA濃度的升高和TG代謝能力的降低，降低“脂毒性”作用和相關(guān)炎癥因子的過(guò)量生成和釋放，保護(hù)肝臟。其機(jī)制可能為：(1)有氧運(yùn)動(dòng)可以提高機(jī)體能量消耗水平[15]。(2)有氧運(yùn)動(dòng)可以有效地加強(qiáng)肌肉組織對(duì)FFA、TG等的攝取和利用，減少脂質(zhì)在非脂肪組織器官上的沉積，降低血脂，預(yù)防和控制代謝性疾病[16]。(3)有氧運(yùn)動(dòng)可以預(yù)防和控制TNF-α、IL-6等炎癥因子在脂肪組織的聚集、浸潤(rùn)及脂肪組織炎癥因子釋放，降低促炎因子在血液循環(huán)及組織器官中的數(shù)量，緩解炎癥應(yīng)激。而HMC組較單一有氧運(yùn)動(dòng)或小球藻干預(yù)更為有效。

有氧運(yùn)動(dòng)和破壁蛋白核小球藻干預(yù)能夠不同程度改善高脂膳食大鼠脂代謝，降低肥胖對(duì)肝臟造成的脂毒性，保護(hù)肝細(xì)胞。其中聯(lián)合干預(yù)較單一干預(yù)更為有效。本研究對(duì)于積極、有效地預(yù)防和延緩因肥胖導(dǎo)致的代謝性疾病的發(fā)生與發(fā)展具有重要意義。同時(shí)也為蛋白核小球藻的深度開(kāi)發(fā)與利用提供理論依據(jù)。