厄貝沙坦對糖尿病大鼠心肌損傷中Notch1信號通路的影響*

張 恒， 陶 敏,2， 康品方,2， 郭建路，2， 宣 玲， 高 琴， 唐 碧， 李路佳， 王洪巨Δ

(1. 蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管科， 安徽 蚌埠 233004； 2. 蚌埠醫(yī)學院科研中心， 安徽 蚌埠 233030; 3. 蚌埠醫(yī)學院生理學教研室， 安徽 蚌埠 233030； 4. 蚌埠醫(yī)學院臨床醫(yī)學院， 第一分黨委， 安徽 蚌埠 233030)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)被認為是一種來自大血管和冠狀動脈粥樣硬化的獨立心肌病[1]，在1974年由Hamby首次提出，它是指由糖尿病引起心臟微血管病變、心肌纖維化等所致的心肌廣泛結構異常一種疾病狀態(tài)，最終可引起左心室肥厚、舒張期和(或)收縮期功能障礙；其機制涉及心肌代謝紊亂、氧化應激、腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的激活、鈣平衡的破壞、線粒體功能障礙等，其中心肌 RAS活性增高是導致DCM發(fā)生發(fā)展的重要因素。血管緊張素Ⅱ(angiotensin II，Ang II)是RAS的重要成員，被認為是加重糖尿病心肌損傷的有害介質，其最主要的作用是可誘導細胞肥大、血管增生和細胞外基質蛋白的沉著而引起心室重構。厄貝沙坦是臨床上應用較廣的AngⅡ受體的抑制劑；我們前期研究發(fā)現，厄貝沙坦可通過調節(jié)基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs) 信號通路中的相關因子減輕糖尿病大鼠所致的肺損傷[2]，但厄貝沙坦改善DCM心肌損傷的機制并不十分清楚。

Notch1信號通路是現階段各種疾病機制的研究熱點，它參與內環(huán)境的信息傳遞、細胞間通訊及細胞命運選擇等生理過程，同時參與維持心血管系統(tǒng)的正常功能。近年研究表明，其在受損心肌保護和心肌再生方面也可發(fā)揮重要作用。Zhang[3]等研究發(fā)現，Notch1信號通路被激活后，可增強心肌細胞活力，抑制高糖誘導的心肌細胞凋亡。Jiang[4]等也報道，激活Notch1信號通路可抑制血管內皮細胞的增殖。厄貝沙坦是否通過影響Notch1通路在糖尿病心肌損傷中發(fā)揮有益作用，目前鮮有報道。

因此，本實驗擬采用高脂喂養(yǎng)+小劑量鏈脲佐菌素(streptocozin，STZ)腹腔注射的方法建立T2DM大鼠模型[2]，探討厄貝沙坦改善DCM的作用，觀察厄貝沙坦心肌保護是否通過Notch1信號通路介導，從而為糖尿病患者的治療提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 復制2型糖尿病大鼠模型

SD雄性大鼠共30只，適應性喂養(yǎng)1周，隨機分成4組：正常對照組(Control，CON，n=6)、高糖高脂組(High calorie，HC，n=6)、糖尿病組(Diabetes mellitus，DM)和厄貝沙坦+糖尿病組(Irbesartan + Diabetes group，Ir+DM)。糖尿病組和厄貝沙坦+糖尿病組統(tǒng)稱為實驗組(n=9)。CON組大鼠常規(guī)飲食，其余組大鼠高糖、高脂、高膽固醇飲食(67%基礎飼料+20%白砂糖+10%豬油+2.5%膽固醇+0.5%膽酸)，4周后實驗組大鼠禁食12 h，腹腔一次性注射STZ30 mg·kg-1，建立2型糖尿病模型[5]。72 h后尾靜脈采血測空腹血糖，隨機血糖連續(xù)3天≥16.7 mmol/L者模型復制成功。給予同等劑量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射CON組、HC組大鼠。剔除不合格大鼠，將成功模型隨機分為糖尿病組(DM組，n=6)，厄貝沙坦+糖尿病組(Ir+DM，n=6)。Ir+DM組大鼠給予厄貝沙坦50 mg/(kg·d)連續(xù)灌胃，其余組大鼠給予同等劑量的生理鹽水灌胃，灌胃至8周。本實驗中，實驗組出現“三多一少”典型癥狀，隨機血糖持續(xù)≥16.7 mmol/L提示糖尿病模型構建成功。高糖高脂組、糖尿病組和厄貝沙坦+糖尿病組TG、TC、FBG一直維持在較高水平，提示糖尿病模型出現脂代謝異常，在高血脂的基礎上糖尿病模型復制并成功維持。

1.2 大鼠血漿TG、TC、FBG水平

大鼠麻醉后，腹主動脈采血2 ml，3 000 r.min-1離心后5 min后，取血漿在自動生化分析儀上測定甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)及空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)水平。

1.3 大鼠H/B、LVWI水平

4%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉，固定大鼠后行氣管插管，打開心腔，迅速取出心臟，預冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱取全心質量，剪除心表面血管及心房，立即稱取左心室質量，以全心質量與體質量之比作為心臟指數(heart weight/body weight，H/B，mg/g)，以左室質量與體質量之比作為左室重量指數(left ventricular weight index，LVWI，mg/g)。

1.4 大鼠心肌組織SOD活性、MDA含量變化

大鼠麻醉后，各組大鼠取左心室心肌組織約0.1 g，-80℃冰箱保存，在冰上將心肌組織制成10%組織勻漿，3 000 r.min-1離心15 min后取上清，按試劑盒說明書以酶標儀分別測定心肌組織SOD活性及MDA含量。

1.5 免疫組化檢測心肌組織Bcl-2及Bax的蛋白表達

大鼠麻醉后，各組大鼠取左室心肌組織約0.1 g收集放在4%多聚甲醛或10%甲醛溶液中固定，將正常心臟及糖尿病心臟組織標本經過石蠟包埋、切片、抗原修復，加入顯色劑等一系列處理后晾干加入顯色劑等一系列處理后晾干。顯微鏡下觀察讀片，Bcl-2、Bax蛋白以細胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性，采用HPLAS-2000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)對Bcl-2、Bax蛋白表達進行定量分析，以單位面積中陽性反應的總面積/單位面積中細胞的總面積為陽性面積率。

1.6 Western印跡分析檢測心肌組織Notch1、Hes-1及Jagged-1的蛋白表達

大鼠麻醉后，取左心室心肌組織約0.1 g，-80℃冰箱保存，實驗開始時將0.1 g心肌組織進行裂解獲取組織勻漿，4℃離心(12 000 r·min-1，15 min)，取上清，蛋白定量后，經15%SDS-PAGE分離，隨后，電轉膜至PVDF膜，先后加入Notch1、Hes-1、Jagged-1或β-acin一抗，4℃過夜。次日洗滌并加入HRP的二抗IgG 孵育，ECL試劑盒進行曝光成像。凝膠成像系統(tǒng)進行條帶的灰度值測量，計算Notch1/β-actin、Hes-1/β-actin、Jagged-1/β-actin蛋白表達的相對量。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠H/B、LVWI水平比較

與CON組相比，HC組H/B、LVWI無明顯變化；與CON組、HC組相比，DM組大鼠H/B、LVWI顯著增加(P<0.01)；與DM組相比，Ir+DM組的H/B、LVWI明顯降低(P<0.01, 表1)。

GroupH/BLVWICON2.70±0.031.47±0.04HC2.74±0.031.51±0.04DM3.99±0.08??##2.14±0.05??##Ir+DM3.20±0.04△△1.79±0.04△△

CON： Control group； HC: High calorie group; DM： Diabetes group； Ir+DM: Irbesartan + diabetes group； H/B: Heart weight/body weight; LVWI: Left ventricular weight index

**P<0.01vsCon;##P<0.01vsHC；△△P<0.01vsDM

2.2 各組大鼠血漿TG、TC、FBG變化

與CON組相比，HC組大鼠血漿TG、TC含量均顯著增高(P<0.01)，FBG無明顯變化，DM組及Ir+DM組大鼠血漿TG、TC、FBG明顯升高；與HC組相比，DM組及Ir+DM組大鼠血漿TG、TC變化不明顯；FBG明顯升高(P<0.01)；與DM組相比，Ir+DM組的TG、TC、FBG均無明顯改變，提示Ir干預后并不影響大鼠血糖和血脂水平(表2)。

GroupTGTCFBG CON0.65±0.251.38±0.215.23±0.27HC7.72±0.62??4.88±0.39??6.12±0.54DM7.65±0.85??4.84±0.52??23.43±3.19??##Ir+DM7.48±1.39??4.82±0.30??21.62±2.37

CON： Control group； HC: High calorie group; DM： Diabetes group； Ir+DM: Irbesartan + diabetes group; TG: Triglyceride; TC: Total cholesterol; FBG: Fasting blood glucose

**P<0.01vsCon;##P<0.01vsHC

2.3 各組大鼠心肌組織SOD活性、MDA含量變化

與CON組相比，HC組大鼠心肌組織SOD活性降低，MDA含量增高(P<0.01，P<0.05)，提示高糖髙脂干預引起心肌氧化應激損傷；與CON組、HC組相比，DM組SOD活性進一步降低，MDA含量增高明顯(P<0.01)，提示心肌氧化應激損傷加重；與DM組相比，Ir+DM組的SOD活性增加，MDA含量降低，提示Ir可減輕糖尿病引起的氧化應激損傷(表3)。

GroupSOD(U/mg-prot)MDA(nmol/mg-prot)CON10.82±0.901.18±0.36 HC8.05±0.84??2.10±0.56?DM3.76±0.73??##4.17±0.76??##Ir+DM7.46±0.91??△△2.59±0.67??△△

CON： Control group； HC: High calorie group; DM： Diabetes group； Ir+DM: Irbesartan + diabetes group; SOD: Superoxide dismutase; MDA: Malondialdehyde

*P<0.05，**P<0.01vsCon;##P<0.01vsHC;△△P< 0.01vsDM

2.4 免疫組化檢測心肌組織Bcl-2及Bax的蛋白表達

與CON組相比，HC組Bcl-2的表達降低，而Bax的表達增加；與CON組相比，DM組Bcl-2的表達明顯降低，Bax的表達明顯增加，Ir+DM組Bcl-2的表達明顯增加，Bax的表達降低；與DM組相比，Ir+DM組大鼠心肌Bcl-2的表達明顯增加，而Bax的表達減少，提示Ir干預后可使細胞凋亡減輕(圖1，表4，圖1見彩圖頁Ⅲ)。

GroupBcl-2 Bax Bcl-2/Bax CON0.81±0.080.16±0.035.40±1.12HC0.65±0.05??0.26±0.04??2.60±0.24??DM0.42±0.04??##0.40±0.04??##1.10±0.09??##Ir+DM0.59±0.05??△△0.28±0.05??△△2.17±0.36??△△

CON： Control group； HC: High calorie group; DM： Diabetes group； Ir+DM: Irbesartan + diabetes group; Bcl-2: B-cell lymphoma-2; Bax: Bcl-2 associated X protein

**P<0.01vsCON;##P<0.01vsHC;△△P<0.01vsDM

2.5 Western印跡分析檢測心肌組織Notch1、Hes-1及Jagged-1的蛋白表達

與CON組相比，HC組Notch1、Hes-1及Jagged-1的蛋白表達降低；與CON組相比，DM組Notch1、Hes-1及Jagged-1的蛋白表達明顯降低，Ir+DM組Notch1、Hes-1及Jagged-1表達有所增加；與DM組比較，Ir+DM組大鼠心肌Notch1、Hes-1及Jagged-1的表達明顯增加，提示Ir的心肌保護作用與Notch1信號通路密切相關(圖2，表5)。

A: Expression of Notch1 detected by Western blot; B: Expression of Hes-1 detected by Western blot; C: Expression of Jagged-1 detected by Western blot; CON： Control group； HC: High calorie group; DM： Diabetes group； Ir+DM: Irbesartan + diabetes group

GroupConHCDMIr+DMNotch10.55±0.010.44±0.02??0.38±0.01??##0.66±0.06??△△Hes-10.45±0.010.32±0.01??0.26±0.01??##0.66±0.05??△△Jagged-10.41±0.010.34±0.02??0.30±0.01??##0.69±0.06??△△

CON： Control group； HC: High calorie group; DM： Diabetes group； Ir+DM: Irbesartan + diabetes group

**P<0.01vsCON;##P<0.01vsHC;△△P<0.01vsDM

3 討論

糖尿病是一種胰島素分泌減少或其生物作用受損所引起的代謝紊亂性疾病，DCM是一種獨立的糖尿病并發(fā)癥,主要表現為左心室肥厚和舒張功能降低[6,7]。DCM不僅有心肌細胞的病理改變，且存在間質纖維化與心室重塑。長期高糖狀態(tài)可導致心肌細胞代謝異常，誘導心臟功能障礙，本實驗在高脂血癥的基礎上成功復制了2型糖尿病模型，8周時FBG水平顯著高于正常組，提示模型復制且維持成功，DM大鼠心臟H/B，LVWI增加，TG、TC增加明顯，SOD、Bcl-2/Bax表達降低、MDA升高，提示糖尿病可引起心肌重構，使細胞氧化應激和凋亡增加。

MDA是反映脂質過氧化程度的常用檢測指標之一，SOD增加可對抗機體氧化應激損傷[8]。Bcl-2家族中Bcl-2抑制細胞凋亡發(fā)生，Bax是Bcl-2家族中促進細胞凋亡的成員之一[9]。氧化應激與凋亡之間存在著密切聯(lián)系，氧化應激可通過多種途徑誘導細胞凋亡的發(fā)生，同時氧化應激也可調控其他因素介導的細胞凋亡[10]。本實驗中，我們觀察到，與對照組相比，DM組心肌組織SOD活性降低，MDA含量增加明顯，Bcl-2/Bax比值降低，提示糖尿病可明顯加重心肌細胞氧化應激和細胞凋亡。與DM組相比，給予厄貝沙坦治療后，糖尿病大鼠心肌SOD活性增加明顯、MDA含量降低明顯，大鼠心肌Bcl-2/Bax比值增加，心臟H/B，LVWI降低明顯，提示厄貝沙坦可抑制心肌重構，減輕心肌組織氧化應激和細胞凋亡。

RAS在DCM的發(fā)病機制中起著重要作用[11]，血管緊張素II(angiopoietin II，AngⅡ)可阻斷胰島素信號、加速氧化應激。厄貝沙坦作為AngⅡ受體抑制劑，可通過抑制血管壁的氧化應激，減少動脈粥樣硬化斑塊的形成，減輕心肌梗死所致的缺血/再灌注損傷[12，13]；Liu[1]等發(fā)現厄貝沙坦可能通減弱蛋白激酶D和內質網應激改善糖尿病所致的心室重塑；Jiang[4]等過表達Notch1后發(fā)現血管內皮細胞增殖受到抑制，同時AngII的表達也減少；我們前期實驗觀察到，厄貝沙坦可減輕糖尿病誘導的心肌纖維化[5]。在此基礎上，我們進一步觀察糖尿病狀態(tài)下，厄貝沙坦是否通過Notch1信號通路發(fā)揮心肌保護作用。

Notch1信號通路屬于進化保守的信號轉導系統(tǒng)，可通過調節(jié)發(fā)育過程中細胞增殖、分化和凋亡等的發(fā)生[14]。它由受體、配體(Jagged-1)和轉錄因子三部分組成，當Notch配體和相應的受體結合后，可調節(jié)磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K-Akt)、Bcl-2等信號分子的表達。Hes-1基因是調控Notch信號通路主要的靶基因之一，通過檢查Hes-1的表達可反映Notch1通路的活化程度。研究發(fā)現：Notch1信號可調節(jié)心肌細胞損傷，Notch1/Jagged1激活后可顯著減少早期心肌細胞凋亡，受抑制時可加速心肌細胞肥大、變性和壞死[15，16]；Uros等報道，轉基因小鼠過表達Notch1/Jagged-1后，可減輕心臟壓力負荷誘導的心肌肥厚[17]。本實驗中，DM大鼠氧化應激和細胞凋亡增加的同時，心肌組織Notch1及其配體Jagged-1蛋白表達減少，下游靶基因Hes-1蛋白表達降低，提示Notch1通路的抑制可能參與糖尿病引起的心肌損傷。給予厄貝沙坦治療后，糖尿病大鼠H/B，LVWI、MDA含量均降低，SOD活性、Bcl-2/Bax比值均增加，同時觀察到Notch1、Jagged-1表達增加，Hes-1蛋白表達亦增加明顯，提示Notch1通路受到活化，我們推測，厄貝沙坦可能通過激活Notch1信號通路對抗糖尿病心肌損傷。

因此，厄貝沙坦干預后可降低心肌細胞氧化應激，減少細胞凋亡，抑制心肌重構；對抗糖尿病大鼠所致的心肌損傷，這一現象可能與厄貝沙坦激活Notch1通路的表達有關。當然，DCM的發(fā)病原因極其復雜，具體機制尚有待進一步明確。