辛伐他汀對大鼠糖尿病所致心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制*

李凡璐， 宛 欣， 王 茜， 劉 鑫， 吳亞俐， 陳還珍， 崔香麗△

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)生理系省部共建細(xì)胞生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 太原 030001； 2. 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心血管內(nèi)科， 太原 030001)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一組慢性高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病心肌損傷是由糖尿病導(dǎo)致的心肌結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化的病變狀態(tài)，可進(jìn)展為糖尿病心肌病。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)獨(dú)立于缺血性心臟病、高血壓或其他心臟疾病，是糖尿病患者最常見的并發(fā)癥，也是糖尿病人群心衰甚至死亡的主要原因之一[1]。研究表明氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡在糖尿病心肌病的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[2-3]。目前對于該病的治療主要集中在改善心功能方面，并沒有明確針對干預(yù)其發(fā)病機(jī)制的有效治療手段。他汀類作為臨床常用調(diào)節(jié)脂代謝異常的一類藥物，除了具有降脂作用外，它還能有效的穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊、保護(hù)內(nèi)皮、減少凋亡、清除自由基、抗炎、抗血管和心肌組織增生等，近年來常被用來防治糖尿病患者出現(xiàn)的心血管系統(tǒng)疾病[4-6]。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀對糖尿病并發(fā)急性低血糖造成的心肌損傷具有保護(hù)作用，且與抑制NF-κB表達(dá)有關(guān)[7]，但辛伐他汀對糖尿病心肌保護(hù)的分子機(jī)制尚不清楚，本課題采用STZ建立糖尿病大鼠模型，給予辛伐他汀灌胃，來研究辛伐他汀對糖尿病所致心肌損傷保護(hù)作用及可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠180～220 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK-(軍)2012-0004。實(shí)驗(yàn)動物在室溫22～25℃、濕度50%～60%，明暗交替12 h的環(huán)境分籠飼養(yǎng)，允許自由飲水?dāng)z食，保持墊料干燥，在動物觀察室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品及試劑

辛伐他汀(杭州默沙東制藥公司)，鏈脲佐菌素(Sigma公司)，無醇蘇木素染液，伊紅染液 (Jiancheng Biotech)，SABC免疫組化染色劑試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，濃縮型DAB試劑盒(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)，總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)、脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒、BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(KeyGEN BioTECH)，Phospho-p53(Ser15)Antibody、Anti-Mouse IgG antibody(WB)(cell signaling)，p53 polyclonal antibody(WB/IHC)、β-actin monoclonal antibody(proteintech)，Anti-Rabbit IgG HRP(WB)(TRANS)，Protein Marker (10-250KD)(BIO-RAD)。

1.3 大鼠糖尿病模型的建立與分組

將24只SD雄性大鼠(180～220 g)隨機(jī)分為對照組(control組，n=8)和模型組(n=16)。避光條件下將鏈脲佐菌素(STZ)溶于pH 4.5的0.1mol/L檸檬酸緩沖液，將大鼠稱重，模型組按55 mg/kg劑量單次腹腔注射STZ檸檬酸緩沖液建立糖尿病模型，對照組大鼠給予腹腔注射等劑量的檸檬酸緩沖液。72 h后從大鼠尾靜脈采血測量血糖，隨機(jī)血糖連續(xù)3 d≥16.7 mmol/L提示糖尿病模型制備成功。然后隨機(jī)將模型組分為糖尿病組(DM組，n=8)和糖尿病給予辛伐他汀組(DM+S組，n=8)，DM+S組給予辛伐他汀生理鹽水40 mg/(kg·d)灌胃四周，其余兩組給予的等量生理鹽水灌胃至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)過程，每天固定時間點(diǎn)記錄各組大鼠的體重，每三日對各組大鼠進(jìn)行一次血糖檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠斷頭處死，迅速取左心室，1/2經(jīng)生理鹽水沖洗后10%福爾馬林保存，1/2 -80℃保存用于Western blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)測定

按照總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)、脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒說明書要求，測定各組大鼠心肌組織脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

1.5 大鼠心臟組織HE染色

心臟組織在10%的福爾馬林中固定3 d后石蠟包埋并切片，切片厚度約5 μm。將切片浸入二甲苯進(jìn)行脫蠟，并依次浸入100%、95%、90%、80%、70%的乙醇。再依次進(jìn)行蘇木素染色和伊紅染色，脫水和透明化后，中性樹膠封片。HE染色后顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)。

1.6 TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測

TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒用來檢測細(xì)胞在凋亡過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況，其原理是生物素(Biotin)標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂 DNA的 3′-OH 末端，并可與連接辣根過氧化酶的鏈霉親和素(Streptavidin-HRP)特異結(jié)合，在辣根過氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺(DAB)的存在下，產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)(呈深棕色)，特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，各組石蠟切片常規(guī)脫蠟，60℃烘片1 h后，依次滴加1%Triton X-100 通透液通透、3%H2O2封閉、TdT酶反應(yīng)液連接、Streptavidin-HRP工作液標(biāo)記，再經(jīng)DAB工作液顯色，蘇木素染液復(fù)染，中性樹脂封片晾干后在普通顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。心臟切片任選5個非重疊400倍高倍鏡視野，計(jì)數(shù)心肌細(xì)胞總數(shù)和凋亡數(shù)，心肌細(xì)胞凋亡率(cardiomyocyte apoptosis index,CAI)(%)=心肌細(xì)胞凋亡數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100% ，計(jì)數(shù)并且計(jì)算后，比較每組實(shí)驗(yàn)大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率。

1.7 大鼠心臟組織免疫組織化學(xué)檢測

各組大鼠心臟采用HE染色相同方法固定、包埋、切片、烘片及脫蠟，再經(jīng)過抗原修復(fù)，封閉，孵育單克隆小鼠抗兔p53一抗(1∶1 000 )，SABC染色劑試劑盒以及DAB顯色劑顯色后，鏡下觀察p53的分布以及表達(dá)情況；按照人工定量或者半定量的評分方法進(jìn)行判定，著色范圍和著色強(qiáng)度計(jì)數(shù)結(jié)果的乘積為評分結(jié)果，每張切片至少隨機(jī)取6個100倍的視野范圍[8]。

1.8 Western blot檢測p53，p53-phospho-serine 15，Bax，Bcl-2等蛋白的表達(dá)

各組大鼠心肌組織分別取約50 mg用RIPA裂解液充分裂解，離心取上清液，采用BCA法，根據(jù)待測樣品OD值，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的蛋白含量(μg)，計(jì)算各組蛋白樣品的濃度。用Eppendorf ThermoStat C 100℃煮沸5 min，使蛋白變性，于-20℃冰箱中保存。隨后依次進(jìn)行SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺)凝膠(10%～12%分離膠，5%濃縮膠)電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，再分別孵育一抗抗β-actin(1∶1 000 )、抗p53(1∶2 000 )、抗p53-phospho-serine 15(1∶1 000 )、抗Bax(1∶500 )和抗Bcl-2(1∶500 )抗體，4℃過夜，次日室溫孵育山羊抗兔二抗(1∶2 000 )1 h后置于ChemiDocMP Imaging 系統(tǒng)顯影成像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重和血糖的變化

各組大鼠的體重在STZ造模前無明顯差異，給予辛伐他汀灌胃四周后，DM組和DM+S組體重較control組的小，但無差異。血糖結(jié)果顯示，各組大鼠的血糖造模前無差異，給予STZ腹腔注射制備糖尿病模型后，DM組和DM+S組血糖明顯上升，且在實(shí)驗(yàn)過程中基本保持穩(wěn)定(圖1)。

Fig.1The changes of body weight (A) and blood glucose (B) in experimental rats

2.2 辛伐他汀對大鼠心肌組織SOD，MDA的影響

結(jié)果顯示DM組大鼠心肌組織SOD活性較control組明顯下降(P<0.01)，MDA含量較control組顯著升高(P<0.01)，給予辛伐他汀后，SOD活性增加明顯，MDA含量下降，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。證明糖尿病可增加氧化應(yīng)激的發(fā)生，辛伐他汀可增加SOD活性、抑制MDA的產(chǎn)生。

GroupnSOD(U/mg pro)MDA(μmol/mg pro)Control8105.16±8.793.47±0.49DM656.94±7.39??14.63±0.52??DM+S882.62±2.70##5.66±0.50##

DM: Diabetes mellitus group; DM+S: Diabetes mellitus+Simvastatin group; SOD: Superoxide dismutase; MDA: Malondialdehyde

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDM

2.3 辛伐他汀對大鼠心肌形態(tài)學(xué)的影響

HE染色觀察各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變。鏡下可見control組的心肌細(xì)胞排列整齊，心肌纖維完整，結(jié)構(gòu)清晰，無細(xì)胞水腫，無炎性細(xì)胞浸潤；DM組的心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌纖維斷裂，結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞明顯水腫、空泡變性、有大量炎性細(xì)胞浸潤；和DM組相比，DM+S組的心肌細(xì)胞病變明顯減輕，心肌細(xì)胞排列較整齊，結(jié)構(gòu)基本清晰，無明顯水腫，炎性細(xì)胞減少(圖2，見彩圖頁Ⅳ)。證明辛伐他汀可以改善糖尿病大鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)。

2.4 辛伐他汀對大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果顯示，與control組相比，DM組心肌組織凋亡細(xì)胞陽性率顯著增加(P<0.01)，給予辛伐他汀治療后，DM+S組細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯降低(與DM組相比較，P<0.01，圖3，表2，圖3見彩圖頁Ⅳ)

2.5 免疫組織化學(xué)結(jié)果

與control組相比，DM組大鼠心臟p53表達(dá)量顯著增加(P<0.01)，且p53在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)；給予辛伐他汀治療后，p53表達(dá)量均明顯下降，p53在細(xì)胞質(zhì)和核中均有表達(dá)，但核內(nèi)表達(dá)量減少(與DM組相比較，P<0.01，圖4，表2，圖4見彩圖頁Ⅴ)

GroupApoptosis indexIHC scoreControl0.11±0.023.33±0.76DM0.85±0.07??11.25±0.75??DM+S0.30±0.03##5.67±0.58##

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDM

2.6 Western blot檢測結(jié)果

DM組大鼠p53，p53-phospho-serine15，Bax表達(dá)量明顯高于control組(P<0.01)，Bcl-2表達(dá)量較control組低(P<0.01)；給予辛伐他汀后，p53(P<0.01)，p53-phospho-serine15(P<0.01)，Bax(P< 0.05)表達(dá)量明顯下降，Bcl-2(P<0.05)表達(dá)量增加(圖5，表3)。

Fig.5The expressions of p53, p53-phospho-serine 15, Bax and Bcl-2 in rat heart tissues tested by Western blot

GroupP53p-p53BaxBcl-2Control0.44±0.050.15±0.030.30±0.020.31±0.04DM0.72±0.09??0.35±0.09??0.45±0.02??0.20±0.04??DM+S0.49±0.05##0.23±0.07##0.40±0.04#0.25±0.02#

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsDM

3 討論

成熟的心肌細(xì)胞是終末分化的，缺乏再生能力。糖尿病引發(fā)的高血糖可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，心肌纖維化，甚至心功能不全等[9]。因此，對糖尿病引起的心肌損傷的研究具有重要的臨床意義。高糖誘導(dǎo)活性氧簇(ROS)大量生成，是糖尿病心肌病發(fā)生和發(fā)展的重要因素。大量ROS的產(chǎn)生，可作用于細(xì)胞膜脂質(zhì)，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物MDA，引起細(xì)胞損傷，MDA含量可反映細(xì)胞氧化損傷程度；超氧化物歧化酶(SOD)是重要的抗氧化酶，可清除ROS，其活性反映細(xì)胞的抗氧化能力。因此，丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)是評價(jià)氧化應(yīng)激程度的常用標(biāo)記物。他汀類藥物對多種疾病的發(fā)病率和死亡率均有臨床益處，尤其是糖尿病[10-12]。已有報(bào)道稱，他汀類藥物的多效性能降低重癥糖尿病患者的死亡率[13-15]，在糖尿病心肌病中，他汀類藥物可以預(yù)防心血管重構(gòu)的發(fā)展，同時也限制葡萄糖不耐癥的進(jìn)展以及炎癥/纖維化細(xì)胞因子生成[16]。本研究采用SD大鼠作為觀察對象，給予鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立糖尿病模型來觀察糖尿病對大鼠心肌細(xì)胞造成的損傷。我們的結(jié)果顯示DM組大鼠心肌組織SOD活性較control組明顯下降(P<0.01)，MDA含量較control組顯著升高(P<0.01)；心肌細(xì)胞明顯排列紊亂，結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞出現(xiàn)水腫、空泡變性、有大量炎性細(xì)胞浸潤；心肌組織凋亡細(xì)胞陽性率顯著增加(P<0.01)，證實(shí)糖尿病引起的高血糖確實(shí)引起了大鼠心肌細(xì)胞的損傷、炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的發(fā)生。給予辛伐他汀后，DM+S組大鼠心肌SOD活性明顯增加，MDA含量下降，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)清晰狀態(tài)，病理損傷明顯改善；細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯降低(與DM組相比較，P<0.01)，證實(shí)辛伐他汀可明顯減輕大鼠糖尿病所致心肌損傷程度，緩解心肌的炎癥反應(yīng)、抑制氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，起到對心肌的保護(hù)作用。

ROS產(chǎn)物的積聚和氧化應(yīng)激在心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展中有重要作用。p53作為核轉(zhuǎn)錄因子，激活多種基因并參與細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡，是細(xì)胞存活和死亡的關(guān)鍵因素[17]。p53的多個磷酸化位點(diǎn)中，ser-15位點(diǎn)的氨基末端的絲氨酸磷酸化p53磷酸化可增加p53的穩(wěn)定性和細(xì)胞凋亡活性[18]。有報(bào)道稱[19]，高血糖引起的ROS的產(chǎn)生，可激活p53，p53激活后磷酸化，激活絲氨酸15位點(diǎn)，并從胞質(zhì)向細(xì)胞核移位，隨后引起凋亡的發(fā)生。p53蛋白可通過調(diào)節(jié)參與線粒體凋亡通路的多種凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2，Bax是p53和NF-κB的下游蛋白。p53能增加Bcl-2的表達(dá)，降低Bax的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2阻止線粒體細(xì)胞色素C釋放。Bax增強(qiáng)細(xì)胞色素C從線粒體向血漿的釋放，誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換[20]。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)方法檢測了三組大鼠心肌組織中p53蛋白的分布與表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p53主要表達(dá)于核內(nèi)，與control組相比，糖尿病組大鼠p53表達(dá)均明顯增加(P<0.01)，給予辛伐他汀治療后p53表達(dá)減少，且p53在胞核內(nèi)分布明顯減少(P<0.01)；Western blot結(jié)果顯示糖尿病組較control組p53，p53-phospho-serine15, Bax的表達(dá)增加(P<0.01)，Bcl-2表達(dá)減少(P<0.01)，給于辛伐他汀后p53(P<0.01)，p53-phospho-serine15(P<0.01),Bax(P<0.05)表達(dá)明顯減少，Bcl-2(P<0.05)表達(dá)增加，進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫組織化學(xué)的結(jié)果。綜上所述，辛伐他汀可通過增加SOD活性、抑制MDA的產(chǎn)生，降低p53，p53-Phospho-Serine15,Bax，增加Bcl-2蛋白的表達(dá)來抑制糖尿病引起的心肌細(xì)胞凋亡，從而改善心肌結(jié)構(gòu)異常、緩解糖尿病造成的心肌損傷。本實(shí)驗(yàn)通過探究辛伐他汀對糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制的作用，為臨床預(yù)防和治療DCM提供新思路。