人乳頭瘤病毒16/18型E6和E7蛋白在宮頸上皮內(nèi)病變中的表達水平及臨床價值

原亞莉，賀桂芳，馬 莉，張浩軍，卞美璐，楊文艷，張 媛

（1.清華大學第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100016；2.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029；3.中日友好臨床醫(yī)學研究所 藥理室；4.北京大學中日友好臨床醫(yī)學院，北京 100029）

持續(xù)的高危型人乳頭瘤病毒感染是導致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要原因[1，2]。目前常用的HPV 病毒檢測為HPV-DNA 分型檢測，2012年指南提出HPV 16/18 型感染者應直接行陰道鏡檢查，然而大多數(shù)學者認為一過性感染致癌的可能性小，且其他高危型別中也有可能發(fā)展為宮頸癌的高危人群，因此HPV 分型檢測不能區(qū)別一過性感染和真正發(fā)生宮頸癌的高風險人群。在HPV 病毒基因組中，E6/E7 基因是主要的致癌基 因[3～5]，E6/E7 蛋白在初始感染階段即一過性感染階段只有低水平表達，在持續(xù)感染階段有較高水平表達[6]。本研究擬通過E6/E7 蛋白檢測來篩選出真正可能發(fā)展為宮頸癌的高風險人群，提高病變的檢出率，避免不必要的陰道鏡檢查帶來的創(chuàng)傷。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2015年11月～2017年11月期間中日友好醫(yī)院婦產(chǎn)科宮頸病變門診就診及住院的進行液基細胞學檢測（LCT）、高危型HPV-DNA 檢測以及于陰道鏡檢查下行活體組織病理檢查或?qū)m頸錐切病理檢查的400 例患者。根據(jù)組織病理學結(jié)果分為正常/炎癥45 例，CIN-1 91 例，CIN 2-3 220例，宮頸癌44 例?；颊吣挲g22～71 歲，平均年齡40.32 歲。所有患者均知情同意。

從上述400 例選取于門診就診的53 例HPV 16/18 型陽性患者的液基細胞學檢測剩余標本重新制片進行免疫細胞化學染色，另取10 例HPV陰性的正常人作為對照，檢測E6 和E7 蛋白的表達水平，分析其表達水平與組織病理學結(jié)果符合情況。

1.2 實驗方法

1.2.1 液基細胞學檢查

于宮頸鱗柱交界部位取材，放入專用的保存液中，在去除血液、粘液以及大多數(shù)炎性細胞后，制片染色，通過顯微鏡閱看載玻片分析結(jié)果。細胞學診斷采用TBS（The Bethesda system）分級系統(tǒng)。

1.2.2 人乳頭瘤病毒DNA 檢測

采用熒光PCR 技術對上述400 例患者進行HPV分型檢測。按照高危人乳頭瘤病毒基因分型檢測試劑盒（上海之江生物科技股份有限公司）提供的操作要求進行病毒核酸提取和擴增試劑的配制，可檢測出13 種高危型亞型及2 種低危型亞型。

1.2.3 陰道鏡活組織檢查

陰道鏡檢查前應排除陰道毛滴蟲、淋病奈瑟菌等感染?；颊呷“螂捉厥?，窺器暴露宮頸，用宮頸鉗取醋白上皮或碘不著色區(qū)等多點部位送病理檢查。根據(jù)病變的嚴重程度將病理診斷分為：慢性宮頸炎、CIN 1 級、CIN 2 級、CIN 3 級及浸潤性癌。

1.2.4 免疫細胞化學染色

采取上述所選53 例患者和10 例正常人的LCT 剩余保存液，重新制片行免疫細胞化學染色檢測E6/E7 蛋白。HPV l6/18 E6 單克隆抗體（稀釋濃度：1：100）、HPV 16 E7 單克隆抗體（稀釋濃度：1：400）均購自Abcam 公司。用已知陽性的宮頸癌病例作陽性對照，用PBS 替代一抗作陰性對照。陽性細胞： 細胞核中或細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色染色視為E6/E7 蛋白陽性。確定陽性標準：任選10 個高倍鏡視野，按陽性細胞所占上皮細胞的百分比劃分。分為4 組：陰性，0～9%；輕度，10%～25%；中度，26%～50%；重度，＞51%陽性細胞。至少需要2位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生雙盲法觀察，陽性細胞率≥10%者為陽性。

1.3 觀察指標

以宮頸組織病理學診斷結(jié)果作為金標準，分析HPV 各亞型的分布情況，觀察HPV E6 和E7蛋白的表達水平與組織病理學結(jié)果符合情況。在不同級別宮頸病變（≤CIN1 組與≥CIN2 組之間）比較HPV-DNA 檢測與E6/E7 蛋白檢測的臨床應用價值。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22 軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料用百分數(shù)（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 年齡分布

以宮頸組織病理學診斷結(jié)果作為標準，CIN1及以上者視為陽性。陽性355 例：年齡＜30 歲53例（14.9%）；30～39 歲133 例（37.5%）；40～49 歲89例（25.1%）；50～59 歲57 例（16.1%）；≥60 歲23例（6.5%）。可知宮頸上皮內(nèi)病變發(fā)病高峰在30～39 歲。其中宮頸癌患者44 例：年齡＜30 歲4 例（9.1%）；30～39 歲8 例（18.2%）；40～49 歲11 例（25.0%）；50～59 歲14 例（31.8%）；≥60 歲7 例（15.9%）。宮頸癌發(fā)病高峰在50～59 歲。

2.2 HPV 各亞型的分布情況

HPV 陰性的患者中，組織病理學為正?；蜓装Y者占31.3%（10/32）； 感染HPV-16 型的患者中，病理診斷為高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌者（≥CIN 2）占87.9%（145/165），感染HPV-18 型的患者中，病理診斷為高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌者占70.8%（17/24），最低的亞型為HPV-66 20.0%（5/25）。在炎癥、CIN 1 中HPV-16/18 型感染所占的比例較低；在CIN 2-3 中，HPV-16 型感染占50.4%，HPV-18 型感染占4.7%；在宮頸癌患者中，HPV-16 型占63.4%，HPV-18 型占14.6%。本研究資料得出78.0%的宮頸癌是由HPV-16/18型引起的，9.8%（4/41）由HPV 其他型別引起。在所有患者中，HPV 各亞型感染率從高到低依次為16＞52/58＞56/51/31/66/18（見表1）。因400 例患者中大部分為住院患者，所以并不是在HPV 陰性患者中5/32 會致宮頸癌。一般從宮頸上皮內(nèi)病變發(fā)展為浸潤癌需10～15年，且宮頸癌5年存活率低。按人次來統(tǒng)計，因有部分混合型感染的患者，所以總計人數(shù)大于400 例。

2.3 HPV E6 和E7 蛋白的表達水平與組織病理學結(jié)果符合情況

10 例正常人的HPV（-），E6/E7 蛋白也為陰性。組織病理診斷為炎癥或CIN1 的15 例患者中，E6 蛋白的陽性率為20.0%，E7 蛋白的陽性率為26.7%；病理診斷為CIN 2-3 或癌癥的38 例患者中，E6 蛋白的陽性率為71.1%，E7 蛋白的陽性率為84.2%。研究結(jié)果顯示，隨著病變級別的增加，HPV E6/E7 蛋白的陽性表達率也逐漸增加，在不同級別宮頸病變（≥CIN 2 組與≤CIN 1 組）間表達水平具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）（見表2～4）。

E6 蛋白檢測高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌（≥CIN 2）的靈敏度、特異度、陽性及陰性預測值分別為71.1%、80.0%、90.0%、52.2%；E7 蛋白的靈敏度、特異度、陽性及陰性預測值分別為84.2%、73.3%、88.9%、64.7%（見表5）。LCT 檢測高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌的靈敏度、特異度、陽性及陰性預測值分別為63.2%（24/38）、86.7%（13/15）、92.3%（24/26）和48.1%（13/27）。HPV-DNA 檢測的陽性預測值為71.7%（38/53）。結(jié)果表明，HPV E6 蛋白和E7 蛋白檢測的靈敏度與陰性預測值均高于LCT 檢測，陽性預測值均高于HPV-DNA 檢測（分別為90.0% vs 71.7%，88.9% vs 71.7%）。

表1 不同組織病理學病變中HPV 各亞型的分布情況（n）

表2 不同組織病理學檢查結(jié)果的患者HPV E6 蛋白的陽性表達情況（n）

表3 不同組織病理學檢查結(jié)果的患者HPV E7 蛋白的陽性表達情況（n）

表4 HPV E6/E7 蛋白在不同級別宮頸病變中的表達水平 n（%）

表5 HPV-16/18 型陽性患者中E6、E7 蛋白表達對高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌的預測價值

3 討論

宮頸癌及癌前病變的篩查方法主要是LCT與HPV 檢測，目前常用的HPV 檢測方式是HPV-DNA 檢測。本研究結(jié)果顯示：感染HPV 16型的患者中，病理診斷為高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌者（≥CIN 2）占87.9%；感染HPV 18 型的患者中，占70.8%。因此，HPV 16/18 型與宮頸癌關系尤為密切。2012年指南指出HPV 16/18 型感染者直接行陰道鏡檢查，但是一過性感染導致宮頸癌的可能性小，HPV-DNA 整合入宿主DNA 是宮頸癌發(fā)生的關鍵步驟[7，8]。

HPV-DNA 檢測是基于L1 片段（查病毒），而L1 不是致癌基因，且在整合過程中容易發(fā)生缺失，故以L1 區(qū)為目標檢測物的HPV 檢測存在假陰性風險[9]，不能區(qū)分一過性感染和真正發(fā)展為癌的高風險人群。E6/E7 才是使細胞發(fā)生永生化的致癌基因，其編碼的E6 和E7 蛋白通過降解p53 抑癌蛋白和干擾pRB 蛋白，破壞細胞衰老、凋亡和遺傳穩(wěn)定性的正常調(diào)控，導致細胞發(fā)生永生化[10～13]。故而很多學者提出E6/E7 基因是檢測高危型人乳頭瘤病毒的關鍵靶點[14，15]，其可直接檢測宮頸病變，而不僅僅是檢測HPV 病毒感染。

本研究結(jié)果顯示53 例HPV 16/18 型感染的患者中，E6 蛋白在炎癥、CIN 1、CIN 2-3 和宮頸癌中的陽性表達率分別為0%、37.5%、64.0%、84.6%，E7 蛋白的陽性表達率分別為14.3%、37.5%、80.0%、92.3%。隨著病變級別的增加，HPV E6/E7 蛋白的陽性表達率逐漸增加，不同級別宮頸病變（≤CIN 1 組比≥CIN 2 組）之間的表達水平具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。HPV E6 蛋白和E7蛋白檢測的靈敏度與陰性預測值均高于LCT 檢測，與Zhang 等[16，17]研究結(jié)果相符。HPV E6、E7 蛋白檢測的陽性預測值（90.0%、88.9%）均高于HPV-DNA 檢測（71.7%）。本研究中，在高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌（≥CIN 2）中，E6 蛋白的陽性率為71.1%，E7 蛋白的陽性率為84.2%，說明E6/E7 蛋白在診斷和預測高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌方面具有重要的參考價值。

因此，建議臨床行LCT 檢測或陰道鏡時，進行E6/E7 蛋白檢測，將其作為一個篩查的重要指標。本研究所選取的研究對象有限，有待深入研究進一步加以證實。