生姜瀉心湯對CT26荷瘤小鼠伊立替康相關毒性的防治作用研究

吳夢雨，鄧 博，賈立群?

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 中西醫(yī)結合腫瘤科，北京 100029）

伊立替康（Irinotecan，CPT-11）是半合成喜樹堿衍生物，在體內(nèi)經(jīng)羧酸酯酶轉化為7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN-38），通過抑制DNA 單鏈斷裂后的修復，干擾DNA 的復制和轉錄，發(fā)揮細胞毒作用，被廣泛應用于晚期結直腸癌、胃癌、胰腺癌患者[1]。但其劑量限制性毒性尤其是遲發(fā)性腹瀉和中性粒細胞減少癥嚴重影響患者生存質量，甚至威脅生命。目前西醫(yī)對伊立替康所致遲發(fā)性腹瀉尚無明確有效的標準治療手段，而多項臨床觀察和動物實驗均已證實生姜瀉心湯等中藥經(jīng)方以其多靶點的特性對CPT-11 導致的腹瀉具有明顯預防作用。本研究旨在對生姜瀉心湯防治荷瘤小鼠CPT-11 所致遲發(fā)性腹瀉和中性粒細胞減少癥的療效進行觀察，并對其作用靶點和機制做進一步的研究，為中藥預防化療相關毒性提供科學依據(jù)。

1 實驗材料和方法

1.1 動物和細胞

健康雌性BALB/c 小鼠，6 周齡，體重18～20g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司[合格證號：SCXK（京）2010-0001]，飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所動物室（SPF 級）；BALB/c 小鼠來源的CT-26 結腸癌細胞，引自中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所。

1.2 藥物與試劑

鹽酸伊立替康注射液（Pfizer 公司，批號：R99183）； 腫 瘤 壞 死 因 子-αELISA 試 劑 盒（e-Bioscince 公司，批號：20180123）、IL-10 ELISA 試劑盒（eBioscience 公司，批號：20180217）；蘇木素伊紅染色液（中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所）；瑞氏染色液（中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所）；中藥（生姜瀉心湯）：生姜12g、半夏9g、黨參9g、黃芩9g、干姜3g、黃連3g、甘草9g、大棗12g，購于中日友好醫(yī)院中藥房，水煎，濃縮至2g/ml。

1.3 方法

1.3.1 荷瘤小鼠模型的制備及分組

復蘇CT26 細胞，以5×106個/只接種于小鼠背部，7～10d 后形成腫瘤。取腫瘤生長旺盛且無潰破的動物，脫頸處死后消毒操作部位皮膚然后切開，選擇生長良好的瘤組織置于無菌平皿內(nèi)，將腫瘤組織剪成2～3mm3的小塊，用無菌玻璃研磨，磨勻后裝入無菌容器內(nèi)，加生理鹽水稀釋1：3～1：4的瘤細胞懸液，經(jīng)0.4%臺盼藍染色鏡檢細胞存活率≥95%后，接種于小鼠頸背部每只0.2ml（約5×106個）。待瘤體生長約100mm3隨機分為3 組，每組6 只，分別為對照組、模型組、生姜瀉心湯組。

1.3.2 遲發(fā)性腹瀉模型的建立及給藥方案

正常組腹腔注射生理鹽水，生姜瀉心湯組和模型組參考Lam W[2]方法造模，CPT-11 350mg/kg腹腔注射，生姜瀉心湯組小鼠在CPT-11 給藥前3d 予生姜瀉心湯10g/kg 灌胃，連續(xù)8d，模型組和對照組灌胃等量生理鹽水。

表1 小鼠腹瀉評分標準

1.3.3 標本采集

各組小鼠末次給藥后禁食12h，摘眼球取血，制備血涂片。然后取空腸、回腸、盲腸、結腸各2～3cm 以及肝臟。用于做病理學檢測的標本置于中性福爾馬林中固定48h；剩余標本保存于-80℃冰箱中備用。

1.4 檢測指標和方法

1.4.1 小鼠一般生活狀態(tài)觀察

給藥期間每天觀察小鼠的一般狀況（精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤、反應性等），測量小鼠體重、進食量。

1.4.2 腹瀉評分

注射伊立替康后每天將小鼠置于代謝籠正常飼養(yǎng)，下面鋪有濾紙以觀察大便情況。評分標準：參照Akinobu Kurita 的方法[3]，具體見表1。

1.4.3 中性粒細胞計數(shù)

小鼠取全血，滴在清潔載玻片上，立刻進行血涂片，使用瑞氏-吉姆薩染液染色法檢測中性粒細胞，光學顯微鏡下計數(shù)并取10 個視野下平均值，記錄并比較各組中性粒細胞數(shù)。

1.4.4 小鼠結腸組織病理形態(tài)學觀察

小鼠結腸組織經(jīng)福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋后進行3μm 切片，采用HE 染色法，在光學顯微鏡下觀察小鼠腸粘膜的病理形態(tài)學改變。

1.4.5 結腸TNF-α 和IL-10 檢測

取結腸組織，稱定質量，用9 倍生理鹽水勻漿，以3000r/min 的速率離心10min，得到腸組織勻漿上清，分離上清液，置無菌EP 管中，進行酶聯(lián)免疫吸附檢測法（ELISA）檢測，檢測方法和步驟嚴格按照試劑盒附件說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用方差分析進行組間比較，等級資料采用秩和檢驗進行分析。

2 結果

2.1 小鼠的一般狀態(tài)

對照組小鼠一般狀態(tài)良好，進食、飲水均正常，背部腫瘤增長迅速，行動稍遲緩，皮毛有光澤，肛門干燥，無紅腫；模型組小鼠注射化療藥后開始出現(xiàn)明顯的消瘦，活動、進食減少，弓背蜷縮、聚集角落、精神萎靡，皮毛污穢，肛門濕潤紅腫；生姜瀉心湯組小鼠狀態(tài)較模型組有所改善，部分出現(xiàn)毛發(fā)豎立、光澤下降，倦怠乏力等癥狀。如圖1所示，生姜瀉心湯改善了小鼠伊立替康化療后出現(xiàn)的體重下降。實驗d5 開始，模型組和生姜瀉心湯組小鼠體重開始降低，分別于d8 和d7 達到最低值，而后開始增長；從實驗d7 起，生姜瀉心湯組小鼠體重顯著高于模型組（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠體重變化（g）

表2 各組小鼠腹瀉評分變化（±s）

表2 各組小鼠腹瀉評分變化（±s）

注：* 與對照組比較，P＜0.05，** 與對照組比較，P＜0.01，△與模型組比較，P＜0.05，△△與模型組比較，P＜0.01。

組別 d5 d6 d7 d8對照組 0 0 0 0模型組 2.17±0.41 2.5±0.55 2.67±0.52 2.5±0.55生姜瀉心湯組 1.67±0.82** 1.5±0.55**△△ 1.5±0.55**△△ 1.33±0.52**△△

2.2 小鼠的腹瀉評分

注射伊立替康24h 后，模型組和生姜瀉心湯組小鼠分別出現(xiàn)不同程度的腹瀉，對照組大便正常，呈干燥顆粒狀，肛門干燥無紅腫。模型組小鼠給藥后腹瀉率達100%，肛周皮膚黏膜紅腫，大便濕軟不成形，部分呈水樣便。生姜瀉心湯組大便微濕軟，部分大便不成形，肛周濕潤微紅腫。模型組腹瀉評分均高于其他2 組（P＜0.05），而生姜瀉心湯組小鼠腹瀉評分較模型組顯著下降（P＜0.05）。

2.3 小鼠的中性粒細胞計數(shù)

模型組小鼠全血中性粒細胞數(shù)（1.83±0.75）個/視野，顯著低于對照組（5.67±0.82）個/視野（P＜0.01）。生姜瀉心湯組中性粒細胞數(shù)（4.83±0.75）個/視野與模型組相比顯著升高（P＜0.01），說明生姜瀉心湯能有效緩解小鼠因伊立替康化療所致的中性粒細胞減少癥。

表3 各組小鼠結腸TNF-α、IL-10 水平（±s）

表3 各組小鼠結腸TNF-α、IL-10 水平（±s）

注：與對照組比較，* P＜0.05，** P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 TNF-α IL-10對照組 30.28±11.9 80.05±10.37模型組 94.73±21.27** 22.06±8.48**生姜瀉心湯組 62.33±16.69**△△ 56.58±12.17**△△

2.4 小鼠結腸組織病理形態(tài)學觀察

圖2（見封二）示，對照組小鼠腸黏膜完整，腺體排列整齊，結構清晰，無水腫、充血及組織壞死，固有層內(nèi)未見炎癥細胞浸潤；模型組腸黏膜腫脹，腺體結構不規(guī)則，大量隱窩結構破壞和絨毛縮短或脫失，黏膜下水腫、充血及炎性細胞浸潤；生姜瀉心湯組可見腸絨毛形狀較完整、黏膜排列規(guī)整，少量炎性細胞浸潤。

2.5 生姜瀉心湯對小鼠結腸TNF-α、IL-10 水平的影響

與對照組比較，模型組小鼠結腸組織TNF-α含量顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，生姜瀉心湯組TNF-α 含量顯著降低（P＜0.01）。與對照組比較，模型組小鼠結腸組織IL-10 含量顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，生姜瀉心湯組IL-10 含量顯著增高（P＜0.01）。

3 討論

近年來研究表明[4，5]，伊立替康的活性代謝產(chǎn)物SN-38 是引起腸黏膜損傷、導致腹瀉的主要原因。CPT-11 在肝內(nèi)羧酸酯酶的作用下轉化為SN-38，其細胞毒性是伊立替康的100～1000 倍，隨膽汁排泄至腸腔，重吸收時對腸上皮造成損傷，引起腸黏膜炎，導致腸道菌群移位，加劇腹瀉的發(fā)生，并能進一步通過腸道菌群對氨基酸、膽汁酸等代謝造成影響。

遲發(fā)性腹瀉是指伊立替康化療后24h 之后出現(xiàn)的腹瀉，一般表現(xiàn)為大便次數(shù)增多、出現(xiàn)軟便或稀便或水樣便，伴有腹痛、腹部脹氣、乏力等[6]。根據(jù)遲發(fā)性腹瀉的表現(xiàn)，該病屬于中醫(yī)“泄瀉”、“下利”范疇?！毒霸廊珪ば篂a》云：“泄瀉之本，無不由于脾胃?！蹦[瘤患者素體正氣虛弱，加之化療藥物伊立替康為外來藥毒，使腫瘤患者脾胃功能更加虛損，脾胃運化失司，致使脾不升清，胃不降濁，水谷不化，生濕化熱，濕熱邪毒流注大腸而生腹瀉。因此化療所致遲發(fā)性腹瀉以脾虛濕盛為基本病機，多屬本虛標實之證，主要病位在腸，治療以健脾、化濕為主。臨床上伊立替康引起腹瀉的同時，常伴隨類似腹部痞滿不適的癥狀，屬中醫(yī)“痞證”范疇，與脾胃升降失調(diào)，中焦氣機紊亂相關。瀉心湯類方主治“心下痞”證，可能是通過調(diào)整脾胃氣機，改善胃腸功能實現(xiàn)。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)[7，8]，半夏瀉心湯可有效改善CPT-11 所致腹瀉，可能通過其中成分黃芩苷對細菌β-葡萄糖醛酸酶的抑制作用，減少腸道SN-38的累積而減少腹瀉的發(fā)生，或通過升高血清中IL-15 的水平，抑制炎癥反應，從而減輕腹瀉癥狀。生姜瀉心湯由半夏瀉心湯減干姜二兩加生姜四兩而成，同屬瀉心湯類方，組方攻補兼施、寒熱平調(diào)，減輕了燥熱之性，增強了散水氣之力。既往研究[9，10]表明，生姜瀉心湯可通過上調(diào)大鼠腸黏膜CD4+T 和CD8+T 淋巴細胞及SIgA 的表達，保護腸黏膜免疫屏障，抑制腸道細胞凋亡并促進腸道干細胞增殖，從而改善腸黏膜損傷程度，對CPT-11所致的遲發(fā)性腹瀉有一定預防作用。而其對荷瘤模型和血液毒性影響的研究卻鮮有報道。故本實驗欲探究生姜瀉心湯對結腸癌小鼠遲發(fā)性腹瀉的防治作用，并觀察其對伊立替康血液毒性的影響。

本實驗在成功復制伊立替康遲發(fā)性腹瀉荷瘤小鼠的基礎上，觀察到中藥生姜瀉心湯組小鼠給藥后，腹瀉次數(shù)減少，腹瀉評分較模型組明顯降低（P＜0.05）；CPT-11 化療后小鼠各段腸粘膜結構均有不同程度的損傷，且盲腸、結腸損傷更重，而生姜瀉心湯組小鼠腸道結構尚完整，絨毛和腸腺結構損傷較模型組改善； 生姜瀉心湯能降低小鼠TNF-α、升高IL-10 水平，并能有效緩解中性粒細胞減少癥。

TNF-α 主要由巨噬細胞產(chǎn)生，是調(diào)節(jié)炎癥反應的關鍵因子，能誘導細胞因子的分泌，提高巨噬細胞的吞噬能力[11]；IL-10 是由Th2 淋巴細胞分泌的一種活性物質，可抑制Th1 細胞的激活以及T細胞和NK 細胞分泌的細胞因子，從而達到限制炎癥反應的作用[12]。有研究報道[13]，IL-10 缺陷小鼠可自發(fā)結腸炎和其他擴大性炎癥反應，且IL-10 基因敲除小鼠是國際公認的克羅恩病小鼠模型，說明IL-10 在維持腸道黏膜免疫功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。而生姜瀉心湯中的芍藥有養(yǎng)血柔肝、緩急止痛之功，芍藥苷能夠升高IL-10 的表達、下調(diào)促炎因子的表達，從而調(diào)節(jié)腸道免疫反應，修復潰瘍性結腸炎大鼠腸組織潰瘍[14]。甘草的重要活性成分甘草酸苷，是高遷移率族蛋白-1 的天然抑制劑，其抗炎作用越來越受到關注，在感染、燒傷、胰腺炎和潰瘍性結腸炎等炎性疾病中發(fā)揮治療作用[15]。生姜瀉心湯對伊立替康血液毒性的影響，可能與其中的補益藥黨參有關。一項對42 例化療所致白細胞減少、造血功能障礙和貧血患者治療的臨床觀察顯示，黨參治療的總有效率為90.48%[16]。

綜上所述，生姜瀉心湯可能通過降低腸道促炎因子和升高抑炎因子水平，調(diào)整機體的免疫狀態(tài)、抑制炎癥反應，從而減輕對腸粘膜的損傷，維持腸道正常結構和功能，預防遲發(fā)性腹瀉的發(fā)生，還可緩解中性粒細胞減少癥。但其對腫瘤組織和CPT-11 血液毒性的影響的作用機制值得進一步探究。