蛋白質(zhì)組學(xué)在皮膚毛囊發(fā)育研究中的應(yīng)用

高麗霞，王高峰，劉志紅

（1.包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院乳品與農(nóng)牧技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014035；2.內(nèi)蒙古涼城縣家畜改良工作站，內(nèi)蒙古 涼城013750；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 動(dòng)物遺傳育種與繁殖自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，也是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者。功能基因組學(xué)是生命科學(xué)的研究對(duì)象，包括結(jié)構(gòu)基因組的研究和蛋白質(zhì)組的研究等。復(fù)雜的翻譯后的修飾、蛋白質(zhì)之間的相互作用等，這些現(xiàn)象幾乎無(wú)法從mRNA水平進(jìn)行判斷和解釋。從蛋白組進(jìn)行研究，將更清楚地闡明生命在生理或病理?xiàng)l件下的變化機(jī)制［1］。對(duì)皮膚毛囊的蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要集中在人和小鼠上，特別是人類(lèi)表皮不同基因的表達(dá)和調(diào)控研究上。

1 人類(lèi)皮膚毛囊蛋白質(zhì)組學(xué)研究

雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）技術(shù)與質(zhì)譜鑒定相結(jié)合，作為一個(gè)強(qiáng)大的工具在分析蛋白質(zhì)的表達(dá)模式上應(yīng)用，應(yīng)用這一工具進(jìn)行皮膚蛋白質(zhì)組學(xué)研究，識(shí)別目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)而用于皮膚相關(guān)疾病的治療。皮膚是身體最大的器官，由細(xì)胞和組織組成，能夠自行生長(zhǎng)、分化、再生。皮膚保護(hù)體內(nèi)器官和系統(tǒng)免受外界環(huán)境的侵襲。皮膚蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以了解皮膚蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾以及皮膚疾病發(fā)病機(jī)理等，進(jìn)而解決目前棘手的皮膚疾病問(wèn)題。

蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)研究的目的是通過(guò)角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)的定量定性信息收集，將基因表達(dá)的異常模式提供給研究人員，最終找出信號(hào)通路和不同皮膚疾病的發(fā)病機(jī)理。到1995年時(shí)，2-DE數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)增加到3 154個(gè)，已鑒定出的多肽增加到1 082個(gè)，在研究過(guò)程中進(jìn)一步結(jié)合了如下程序：①已知人類(lèi)蛋白的協(xié)同泳動(dòng)；②2-DE凝膠免疫組化；③考馬斯亮藍(lán)染色的微序列測(cè)序；④質(zhì)譜分析；⑤牛痘病毒的全稱(chēng)cDNA表達(dá)以及全長(zhǎng)cDNA的體外轉(zhuǎn)錄與翻譯［2］。在1993年，研究者將3 038個(gè)細(xì)胞蛋白質(zhì)列在了人類(lèi)皮膚蛋白質(zhì)雙向電泳數(shù)據(jù)庫(kù)中，大多數(shù)蛋白對(duì)應(yīng)有轉(zhuǎn)錄后的修飾，這些蛋白中已鑒定出來(lái)的蛋白多肽有763個(gè)，并附有SSP號(hào)、等電點(diǎn)、分子量、細(xì)胞定位和評(píng)價(jià)值。其中176個(gè)蛋白在數(shù)據(jù)庫(kù)中有微陣列記錄。

顏色和卷曲這些毛發(fā)的特征都是由基因決定的，Heywood等對(duì)發(fā)質(zhì)和頭發(fā)成分的差異是否受相關(guān)基因的控制展開(kāi)調(diào)查。研究292個(gè)女性的頭發(fā)，結(jié)果顯示一串66 kDa的蛋白質(zhì)與高質(zhì)量的頭發(fā)相關(guān)。中低分子量（14～29 kDa）的蛋白出現(xiàn)在染色劑的使用者以及低質(zhì)量的頭發(fā)試驗(yàn)群體中。所有受試者的氨基酸分析結(jié)果表明，毛發(fā)中絲氨酸和蘇氨酸的水平有雙峰頻率分布，暗示其與遺傳因素有關(guān)。研究數(shù)據(jù)表明，絲氨酸和蘇氨酸的高水平表達(dá)量影響毛發(fā)的感官質(zhì)量。此外，半胱氨酸水平較低與頭發(fā)顏色、質(zhì)量有關(guān)，高質(zhì)量的頭發(fā)可能更耐受染色劑的傷害。對(duì)頭發(fā)的彈性模型研究中揭示出，高質(zhì)量（4.65 GPa）毛發(fā)彈性顯著高于所有中、低質(zhì)量的頭發(fā)（4.30 GPa）。由此得出結(jié)論，頭發(fā)的成分和抗拉性能與頭發(fā)的質(zhì)量有關(guān)。由此假設(shè)頭發(fā)質(zhì)量可能是由基因決定的，了解頭發(fā)的組成及其特性之間的關(guān)系，可以在未來(lái)針對(duì)每個(gè)人的頭發(fā)組成，設(shè)計(jì)生產(chǎn)不同的產(chǎn)品［3］。

2 小鼠皮膚毛囊蛋白質(zhì)組學(xué)研究

皮膚毛囊中的大部分蛋白，主要是角蛋白和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白，通過(guò)變性可以將其提取出來(lái)，但由于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的交聯(lián)調(diào)控，15%～20%的角蛋白和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白難以得到。鳥(niǎo)槍法蛋白質(zhì)組學(xué)現(xiàn)在可以鑒別異構(gòu)肽蛋白質(zhì)組，甚至是翻譯后的修飾的蛋白質(zhì)組中300個(gè)以上的成分。來(lái)源于不同細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，表明交聯(lián)過(guò)程可以有效地利用可變資源產(chǎn)生有極大穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)。通過(guò)建立小鼠模型，研究異常毛發(fā)機(jī)理，了解蛋白組可以對(duì)蛋白缺失的毛干結(jié)構(gòu)的缺陷提供研究基礎(chǔ)。因此，通過(guò)毛發(fā)蛋白質(zhì)組學(xué)研究近交系小鼠，為人類(lèi)毛囊發(fā)育提供研究基礎(chǔ)。提供一些離散的和無(wú)創(chuàng)傷的人類(lèi)蛋白質(zhì)組樣本，通過(guò)對(duì)其皮膚附屬物蛋白組學(xué)研究進(jìn)而用于某些疾病的診斷治療［4］。

Huang等對(duì)小鼠皮膚進(jìn)行了比較蛋白組學(xué)研究，指出哺乳動(dòng)物的皮膚由于經(jīng)常暴露在不同的環(huán)境壓力下，從而對(duì)不同壓力、機(jī)體都會(huì)產(chǎn)生特異性的應(yīng)答，通過(guò)蛋白質(zhì)組分析可以評(píng)估機(jī)體蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。通過(guò)研究得到500多個(gè)蛋白點(diǎn)，建立了BALB/c小鼠皮膚的參考蛋白質(zhì)組圖譜，鑒定到了對(duì)應(yīng)于28個(gè)不同的皮膚蛋白質(zhì)的44個(gè)蛋白點(diǎn)。表皮中高表達(dá)的有25個(gè)蛋白質(zhì)，皮下組織中表達(dá)的有9個(gè)。研究得到了在有外界壓力的環(huán)境中特異性表達(dá)的功能多樣的蛋白，這些功能主要包括應(yīng)激反應(yīng)、生長(zhǎng)抑制、細(xì)胞凋亡、結(jié)構(gòu)完整性的保持、翻譯后的調(diào)控、鈣結(jié)合、能量代謝、膽固醇運(yùn)輸和自由基的清除［5］。

Huang在小鼠皮膚蛋白質(zhì)組學(xué)研究中得到了蛋白異構(gòu)酶、78 kDa的葡萄糖調(diào)控蛋白前體、熱激蛋白 60（heat shock protein 60，HSP60）、熱激蛋白70 （heat shock protein 70，HSP70）和熱激蛋白 27（heat shock protein 27，HSP27） 這 5個(gè)分子伴侶。蛋白異構(gòu)酶主要在皮下組織中表達(dá)，HSP27主要在表皮表達(dá)。HSP27、HSP60以及HSP70表達(dá)水平的變化反映了皮膚對(duì)熱或冷應(yīng)激，暗示皮膚對(duì)溫度壓力的反應(yīng)與這些分子伴侶有關(guān)。由此建立了大量的小鼠皮膚蛋白質(zhì)組圖譜參考標(biāo)記，奠定了未來(lái)對(duì)表皮和皮下組織的環(huán)境應(yīng)答機(jī)理的研究基礎(chǔ)［6］。

Robert等研究表明鳥(niǎo)槍法可以區(qū)分不同近交系的小鼠毛干軸。分析所提供的總毛干，發(fā)現(xiàn)在11個(gè)小鼠品系和5個(gè)突變體中，有100多個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)差異顯著。毛干缺陷與單基因突變相關(guān)。毛干提供了一個(gè)隨機(jī)的采樣物種的蛋白質(zhì)組，對(duì)整個(gè)表皮附屬物和整個(gè)身體的重要功能研究，毛干是很好的模型［6］。

3 羊皮膚毛囊蛋白質(zhì)組學(xué)研究

正皮質(zhì)、中間皮質(zhì)和副皮質(zhì)區(qū)是羊毛的3種不同皮質(zhì)層，其中有大量的細(xì)胞。研究表明，半胱氨酸濃度在副皮質(zhì)區(qū)高于正皮質(zhì)區(qū)。卵泡原位雜交研究表明，富含硫的蛋白最初在副皮質(zhì)纖維表達(dá)，之后逐漸均勻擴(kuò)散在整個(gè)纖維中表達(dá)，完成角質(zhì)化的過(guò)程。相反，甘氨酸和酪氨酸含量高的蛋白質(zhì)最初在正皮質(zhì)囊泡中表達(dá)。研究人員采用一系列方法分離皮質(zhì)層和副皮質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果顯示在副皮質(zhì)細(xì)胞中半胱氨酸水平更高。電泳研究發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)層和副皮質(zhì)層細(xì)胞中有許多差異蛋白的表達(dá)，但不清楚具體是哪種蛋白質(zhì)，似乎是副皮質(zhì)區(qū)包含超高硫類(lèi)蛋白質(zhì)的比例更高。

羊毛的角質(zhì)層賦予了羊毛纖維重要的特征，這些特征如手感和耐磨性均影響著羊毛纖維的內(nèi)在特性和紡織性能。由于羊毛角質(zhì)層中存在大量的二硫鍵和交聯(lián)多肽，導(dǎo)致科研人工分離純粹的羊毛角質(zhì)層以及提取蛋白質(zhì)的難度增加，清楚闡述羊毛角質(zhì)層蛋白質(zhì)組學(xué)非常困難。Michinari等利用2-DE技術(shù)，對(duì)韓國(guó)本地山羊羊絨進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了10種蛋白成分。質(zhì)譜鑒定其中的9種蛋白成分，有3種分子量在70～120 kDa，等電點(diǎn)為5.3，分別為角蛋白Ⅱ型纖維、角蛋白48 kⅠ型纖維復(fù)合物8c-1和細(xì)胞溶質(zhì)磷脂酶A2。另外3種蛋白成分分子量在42～50 kDa，表達(dá)量在冬季升高，分別是角蛋白Ⅰ型纖維47.6 kDa、角蛋白Ⅱ型纖維復(fù)合物7C和角蛋白Ⅱ型纖維復(fù)合物5。剩余的3種蛋白成分分子量低于17 kDa，分別是毛發(fā)角蛋白Ⅱ型中間纖維絲、角蛋白高硫基質(zhì)蛋白ⅢB2（等電點(diǎn)5.2和5.9各1種），這些蛋白與羊毛纖維的特性均有著重要的關(guān)系［7］。

Henning等采用化學(xué)和酶消化的方法對(duì)高純度的美利奴羊毛角質(zhì)層進(jìn)行蛋白組學(xué)研究，鑒定了108個(gè)蛋白點(diǎn)，結(jié)果表明這些蛋白點(diǎn)大部分屬于角蛋白和非角蛋白家族，它們?cè)诜肿咏M裝和細(xì)胞結(jié)構(gòu)中起重要的作用。表皮主要由角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（keratin associated proteins，KAPs）、中間纖維絲蛋白質(zhì)（intermediate filament proteins，IFPs）和細(xì)胞骨架角蛋白組成。非角蛋白結(jié)構(gòu)蛋白有組蛋白、微管蛋白和細(xì)胞橋粒。由此得出結(jié)論，不同蛋白組成了角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)和纖維，最重要的表皮層組成成分是角質(zhì)化的蛋白家族KAPs和IFPs。

4 展望

人類(lèi)一直在努力使羊毛與其他纖維特別是人工合成物相比更具競(jìng)爭(zhēng)力，因此需要深入了解羊毛的蛋白質(zhì)成分和羊毛性能之間的關(guān)系，進(jìn)而指導(dǎo)羊的育種。首先需要獲得羊毛蛋白質(zhì)組圖譜，通過(guò)凝膠和非凝膠技術(shù)及其他方法開(kāi)發(fā)可靠的定量蛋白質(zhì)表達(dá)方法。然而，要實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，面臨著很多的挑戰(zhàn)，如在羊毛蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用方面，包括公共訪問(wèn)數(shù)據(jù)庫(kù)中羊毛蛋白質(zhì)序列信息的相對(duì)缺乏；羊毛纖維中眾多的蛋白質(zhì)中，Ⅰ型和Ⅱ型角蛋白的高度同源性；角蛋白相關(guān)蛋白家族中高度的同源性和多態(tài)性；角蛋白超過(guò)其他羊毛蛋白的數(shù)量［8］。

參考文獻(xiàn)：

［1］張奉學(xué)，王新華.蛋白質(zhì)組學(xué)研究及其對(duì)中醫(yī)藥發(fā)展的啟示［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，21（6）：486-488.

［2］HUANG C M，F(xiàn)OSTER K W，DESILVA T，et al.Comparative proteomic profiling of murine skin ［J］.The Journal of Investigative Dermatology，2003，121 （1）：51-64.

［3］HEYWOOD D M， VRETTOU C， WOOD J，et al.Investigating the relationship between the hair fiber proteome and hair quality［J］.International Journal of Cosmetic Science，2004，26（5）：268.

［4］PLOWMAN J E， DEB-CHOUDHURY S， CLERENS S，et al.Unravelling the proteome of wool:towards markers of wool quality traits ［J］.Journal of Proteomic，2012，75（14）：4315-4324.

［5］HUANG C M，ELMETS C A，VAN KAMPEN K R，et al.Prospective highlights of functional skin proteomics［J］.Mass Spectrom Rev，2005，24（5）：647-660.

［6］RICE R H.Proteomic analysis of hair shaft and nail plate［J］.J Cosmet Sci，2011，62（2）：229-236.

［7］YOKOHAMA M，MASUDA T，AMANO T，et al.Proteome analysis of cashmere ［J］.Animal Science Journal，2004，75（5）：401-405.

［8］RICE R H，BRADSHAW K M，DURBIN-JOHNSON B P，et al.Differentiating inbred mouse strains from each other and those with single gene mutations using hair proteomics［J］.PLoS One，2012，7（12）：e51956.