銀藍調脂膠囊對巨噬細胞泡沫化的抑制作用及機制研究＊

黃丹娥，李茹月，蔡大可，姚 楠，甘海寧，曾曉會，陳玉興＊＊

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院 廣州 510095；2.廣州中醫(yī)藥大學廣東省第二中醫(yī)院 廣州 510275）

動脈粥樣硬化是一種脂質代謝紊亂和慢性炎癥并存的血管炎性病變疾病，是冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的共同病理基礎[1]。巨噬細胞泡沫化是動脈硬化形成的關鍵環(huán)節(jié)，也是動脈粥樣硬化形成的標志[2]。巨噬細胞通過清道夫受體無限制攝取氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）導致巨噬細胞脂質過載進而產生泡沫化，隨之分泌大量的炎癥因子。而炎癥因子的產生進一步加劇脂質的氧化修飾和局部炎癥反應，加速脂質流入巨噬細胞加劇細胞泡沫化過程[3]。巨噬細胞中多余的膽固醇可通過細胞表面的腺苷三磷酸結合轉運體（ABCA1）轉運至胞外，然后通過高密度脂蛋白的形式轉運至肝臟代謝排出體外，即通過膽固醇逆向轉運途徑（RCT）排出體外。大量研究表明配體激活肝X受體α（LXRα）上調ABCA1表達，促進RCT途徑，同時產生抗炎的藥理作用，是抗動脈粥樣硬化的熱點靶標。因此通過上調LXRα-ABCA1、抑制ox-LDL刺激巨噬細胞產生的炎癥反應是阻止巨噬細胞泡沫化的有效途徑。

銀藍調脂膠囊為課題組研發(fā)的調脂中藥新藥，由絞股藍、銀杏葉、化橘紅、蜂膠組成，前期研究發(fā)現(xiàn)該藥物具有明顯的降脂作用，并已順利獲得由CFDA頒發(fā)的新藥臨床批件（2012L01011)），用于氣滯血瘀型高脂血癥的治療[4]。前期通過計算機輔助藥物設計及ApoE-/-小鼠模型發(fā)現(xiàn)該藥物調控膽固醇逆向轉運關鍵基因和蛋白的表達，提示該藥物對可能對巨噬細胞泡沫化具有抑制作用[5]。因此本研究將基于炎癥及LXRα-ABCA1通路研究銀藍調脂膠囊對巨噬細胞泡沫化的抑制效果及其作用機制，為該復方臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器

電子分析天平（德國Sartorius公司）；5424型小型高速離心機（德國Eppendorf公司）；-80℃超低溫冰箱（美國Thermo公司）；IQTM5型熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；SmartSpec plus核酸蛋白測定儀（美國Bio-Rad公司）；Milli Q Plus超級純水儀（美國Millipore公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）；Varioskan Flash型全波長多功能酶標儀（美國Thermo公司）；Class II Type B2型生物安全柜（新加坡Esco公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；Cellometer Mini自動細胞計數(shù)儀（美國Nexcelom公司）；DMI8倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

1.1.2 藥品與試劑

銀藍調脂膠囊由廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院）制劑研究室提供；ox-LDL購自廣州奕源生物有限公司；油紅O測定試劑盒、總膽固醇含量測試試劑盒，購自南京建成科技有限公司；4%多聚甲醛，購自；LXRα抗體購自美國proteintech公司；ABCA1抗體購自美國Abcam，COX2抗體購自美國proteintech公司；iNOS抗體購自美國Abcam公司，βactin購自美國proteintech公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶和DPBS購自美國Gibco公司；總RNA提取試劑Trigol（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo公司）；MaximaTM SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix（2×）（美國Thermo公司）；特異性引物（上海英濰捷基貿易有限公司）；氯仿、異丙醇、無水乙醇均為分析純，購自廣州化學試劑廠，BCA蛋白含量測定試劑盒，購自美國Thermo fisher公司，PBS溶液購自美國Gibco公司。

1.1.3 細胞與動物

RAW264.7細胞系，購自中國科學院上海生科院細胞資源中心，SPF級SD大鼠20只，體質量220-250 g，由廣東省醫(yī)學動物實驗中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（粵）2008-0002，實驗動物質量合格證號No.44007200051918。實驗環(huán)境為廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院SPF級動物實驗室，SYXK（粵）2005-0059。

1.2 實驗方法

1.2.1 含藥血清制備方法

大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為4組，空白組、銀藍調脂膠囊高劑量組（5.148 g·kg-1）、中劑量組（2.547 g·kg-1）、低劑量組（1.278 g·kg-1），每組5只，灌胃給藥，每天一次，空白組給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥1周，于第8天給藥2h后腹主動脈采血，3000轉/min 4℃離心10 min分離血清，56℃滅活30 min后，于超凈工作臺經0.22 μM濾膜過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 含藥血清細胞毒性測試

采用MTT法測定空白血清、銀藍調脂膠囊高、中、低含藥血清對細胞存活率的影響。取RAW264.7細胞懸液，調整密度為5×104個/mL，接種于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基的96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)基，各組含藥血清按50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.56%加入細胞中，同時設置不含血清的陰性對照組，每個濃度設置3個復孔，24 h后，吸棄培養(yǎng)基，加入20 μL MTT（5 mg·mL-1），4 h后，將MTT溶液吸出，加入150 μL DMSO，震搖15 min后，于490 nM處讀取吸光值。以陰性對照組細胞吸光值為參考，各組細胞吸光值所占百分比即為細胞存活率。

1.2.3 泡沫細胞模型構建與給藥

參考文獻方法并加以改進[6]，取RAW264.7細胞懸液，調整密度為5×104個/mL，接種于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基的96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h后，細胞分為空白組、模型組、銀藍調脂膠囊含藥血清高、中、低劑量組，除空白組外，其余各組加入ox-LDL 25μg·mL-1誘導泡沫細胞，模型組加入10%空白血清，藥物干預組加入10%高、中、低劑量的含藥血清，24 h后油紅O染色，鏡下觀察。

1.2.4 油紅O染色與脂質定量分析

各實驗組干預24 h，PBS清洗細胞2次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，吸棄固定液，PBS清洗3次后根據油紅O染色試劑盒說明書進行染色操作。染色結束后吸凈染色液，用PBS洗兩遍，置于光學顯微鏡下觀察細胞泡沫化情況及油脂分布情況。因油紅O染料可在492 nm波長處吸收，且染色后脂質極易溶于異丙醇中，故本文脂質被油紅O染色后，于96孔板中加入異丙醇（每孔100 μL），至于搖床上萃取5 min，速度為140次/min，萃取完畢后于492 nm處讀取OD值，數(shù)值越大表明脂質含量越高。

1.2.5 總膽固醇含量測定

將RAW264.7接種于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基的6孔板中，接種密度為4×105個/mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h后，按照1.2.3項下加入供試品，干預24 h后，PBS洗細胞2次，棄掉PBS，加入100 μL PBS，用細胞刮刀掛取細胞，收集細胞于1.5 mL EP管中，超聲破碎后，每個樣品各取細胞5 μL按照BCA測試盒說明書操作，測定蛋白含量，其余細胞裂解液加入甲醇：氯仿（1∶3）200μL萃取膽固醇，揮干有機溶劑后，按照總膽固醇含量測試試劑盒的方法測定總膽固醇含量，最終以每g蛋白中膽固醇含量進行定量。

表1 擴增的基因引物信息

1.2.6 RT-qPCR檢測基因表達水平

RAW264.7接種于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基的6孔板中，接種密度為4×105個/mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h后，加入ox-LDL 25μg·mL-1誘導泡沫細胞，模型組加入10%空白血清、藥物干預組中加入10%含藥血清，24 h后實驗結束，PBS洗細胞2次，用Trizol法提取總RNA為模板，以OligodT為引物逆轉錄合成cDNA。引物設計利用Primer6.0生物軟件，基因的引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成。設計的引物信息如表1所示。引物信息如表1所示。

將cDNA 1μL、dd H2O：0.95 μL、特異性引物F和R各1μL、MaximaTMSYBR Green/Flurescien 12.5 μL混合后，以94℃×5 min；94℃x30 s→5℃×30 s→72℃×50 s（45個循環(huán)）；72℃×7 min進行擴增。運用，2-△△Ct法計算各組基因表達量。各組基因表達量以18S表達量作為內參進行比較，計算獲得相對表達量。

1.2.7 Western blot法檢測蛋白表達水平

將RAW264.7接種于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基的6孔板中，接種密度為4×105個/mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h后，加入ox-LDL 25μg·mL-1誘導泡沫細胞，模型組加入10%空白血清、藥物干預組中加入10%含藥血清，分別干預12 h、24 h、48 h后收集細胞進行實驗。

收集處理后的細胞，用預冷的PBS洗內皮細胞3遍。加預冷的裂解液，4℃裂解30 min并轉移至預冷的EP管中。10000 rpm離心10 min后，取上清，收集蛋白，BCA法測定濃度。取蛋白上樣量為45 μg，經SDSPAGE凝膠電泳后，電轉致PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，一抗4℃孵育過夜，用TBST漂洗3次，加入二抗室溫孵育1.5 h，TBST漂洗3次，用ECL化學發(fā)光法進行檢測。使用ImageJ圖形分析軟件分析條帶的光密度值除以對應的內參蛋白條帶β-actin的光密度，再以對照組所得光密度比值為參照（定為1），其他各組的光密度比值除以對照組光密度比值后所得百分數(shù)作為蛋白表達水平。

1.2.8 統(tǒng)計學處理

采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行多組間比較；組間均數(shù)兩兩比較，方差齊時采用SNK法；方差不齊時采用Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 銀藍調脂膠囊對細胞生長的影響

MTT測試結果如圖1所示，與陰性對照組（不加大鼠血清）比較，50%大鼠血清組顯著性降低細胞存活率（P＜0.02），但在該濃度下銀藍調脂膠囊高、中、低三個劑量組細胞存活率無顯著差異。與陰性對照組比較銀藍調脂膠囊高、中、低三個劑量組25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.56%含藥血清及空白組含藥血清對細胞存活率無顯著性影響，提示在25%及以下血清含量對細胞生長無影響。

2.2 銀藍調脂膠囊對ox-LDL所致巨噬細胞泡沫化的抑制作用

各實驗組按照油紅O染色法檢測細胞內脂質堆積情況。如圖2A所示，與正常對照組比較，模型組巨噬細胞經ox-LDL誘導24 h后，細胞內脂質堆積明顯增加，被油紅O染成深紫紅色，細胞泡沫化明顯；與模型組比較，銀藍調脂膠囊高、中、低劑量組均能降低細胞內脂質堆積，油紅O染色顏色隨著劑量增加逐漸變淺，泡沫化細胞減少。細胞內油紅O染色定量分析結果如圖2B顯示，與正常對照組比較，RAW264.7細胞經ox-LDL誘導24 h后，脂質堆積明顯升高，OD值由0.09升高到0.86（P＜0.01），而銀藍調脂膠囊高、中、低劑量含藥血清能顯著降低細胞內脂質水平，OD值分別為0.21（P＜ 0.01）、0.39（P＜ 0.01）和0.64（P＜ 0.01）。

2.3 銀藍調脂膠囊對ox-LDL所致泡沫細胞中膽固醇含量的影響

如圖3所示，與正常組相比，ox-LDL誘導后模型組總膽固醇（TC）顯著升高（P＜0.01），由正常組5.97 mmol·g-1升高到13.93 mmol·g-1。經銀藍調脂膠囊含藥血清干預后，與模型組相比，銀藍調脂含藥血清高、中、低劑量組均顯著降低胞內TC水平（P＜0.01），胞內TC含量分別為8.99mmol·g-1、10.03mmol·g-1和11.75mmol·g-1。

2.4 銀藍調脂膠囊對LXRα-ABCA1及炎癥mRNA表達水平的影響

RT-qPCR結果顯示（圖4），與空白組比較，經ox-LDL誘導后模型組LXRα、ABCA1 mRNA表達顯著降低（P＜0.01），而給予銀藍調脂膠囊含藥血清組中LXRα、ABCA1 mRNA均有顯著上調作用（P＜0.01）；與空白組比較，經ox-LDL誘導后模型組細胞炎癥因子COX2、iNOS mRNA表達升高（P＜0.01），而銀藍調脂膠囊含藥血清可顯著性降低炎性因子COX2和iNOS的mRNA表達（P＜0.01）。

圖1 含藥血清對細胞存活率的影響

2.5 銀藍調脂膠囊對LXRα-ABCA1及炎癥蛋白表達水平的影響

采用不同時間點12 h、24 h及36 h檢測藥物干預LXRα-ABCA1通路和炎癥因子蛋白表達的影響，結果如圖5所示。如圖5A、C、E所示，與0 h比較，LXRα、ABCA1在給予ox-LDL造模后蛋白水平均顯著降低（P＜0.01），銀藍調脂膠囊20%含藥血清在給藥12 h、24 h、36 h后，顯著增加LXRα、ABCA1蛋白表達用（P＜ 0.01）；如圖5B、D、F所示，與0 h比較，ox-LDL造模后細胞產生炎癥反應，顯著升高炎癥因子COX2和iNOS蛋白水平，銀藍調脂膠囊高、中、低三個劑量組10%含藥血清干預后炎癥因子COX2和iNOS蛋白表達水平顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）。

圖2 A為不同劑量銀藍調脂膠囊含藥血清抑制ox-LDL所致巨噬細胞泡沫化脂質堆積油紅O染色結果，隨著藥物劑量增加，染色程度逐漸減輕；B為細胞內萃取油紅O定量測定結果，測定波長為492 nm，與正常組比較：*P ＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P ＜0.01，##P ＜0.01。

圖3 各組樣品ox-LDL誘導泡沫細胞胞內膽固醇含量

3 討論

巨噬細胞通過清道夫受體途徑攝取膽固醇，膽固醇堆積引發(fā)巨噬細胞泡沫化，進而在炎癥因子刺激下誘發(fā)動脈粥樣硬化。當前大量研究表明ABC轉運體的轉運機制是介導膽固醇流出的限速步驟，其中ABC轉運體家族中的ABCA1和ABCG1協(xié)同完成單核細胞膽固醇的逆向轉運[7]。LXR是肝臟、腸道以及其他組織中豐富表達的一種核受體，對維持機體膽固醇的相對穩(wěn)定發(fā)揮重要作用，也是調節(jié)膽固醇逆向轉運的重要因素。研究表明，LXR被激活，將上調其下游基因如ABCAl和ABCG1表達，從而促進巨噬細胞胞內膽固醇的流出，加速膽固醇從外周組織流向肝臟，并在肝臟中經代謝成膽汁酸排出體外，從而防止泡沫細胞的形成[8,9]。

在動脈粥樣硬化早期階段，除了膽固醇堆積于巨噬細胞導致泡沫細胞產生之外，過多的脂質堆積刺激巨噬細胞誘發(fā)炎癥反應，導致動脈壁巨噬細胞粘附，生成脂質斑塊，引起平滑肌增殖、遷移，誘發(fā)形成動脈粥樣硬化[10,11]。因此抑制炎癥反應已經成為治療動脈粥樣硬化的新策略[12]。

銀藍由銀杏葉、絞股藍等中藥組成，具有益氣健脾、活血化瘀、祛痰利濕等功效，是經臨床十余年應用篩選并通過現(xiàn)代藥學制備而成的中藥六類新藥，主要適用于氣虛痰瘀阻痹型高脂血癥的治療。對高脂血癥具有明顯的降低血清中TC、TG的水平，提高LPL、總酯酶活性，降低 LDL-c、ApoA1、ApoB、FFA 的量，提高ApoA1/ApoB比值的作用效果，表現(xiàn)出良好的調節(jié)脂質代謝的作用[4]。

本研究結果提示銀藍調脂膠囊具有潛在的防治動脈粥樣硬化的藥理作用效果，主要體現(xiàn)在以下3個方面：（1）在泡沫細胞形成抑制方面，銀藍調脂膠囊能顯著性抑制ox-LDL導致的脂質在巨噬細胞中的堆積，并降低細胞中膽固醇的含量；（2）銀藍調脂膠囊上調LXRα基因和蛋白的表達，進而激活下游ABCA1基因和蛋白的表達，對膽固醇從巨噬細胞中排除并轉運至肝臟排出體外起到了促進的作用；（3）銀藍調脂膠囊干預后，ox-LDL誘導的細胞內炎癥因子COX2和iNOS的mRNA表達水平及蛋白表達水平下降。該研究結果表明銀藍調脂膠囊對巨噬細胞泡沫化的抑制作用可能與其激活LXRα上調ABCA1，降低炎癥因子COX2、iNOS表達水平有關。

圖4 銀藍調脂膠囊對RCT及炎癥相關基因表達影響結果

圖5 銀藍調脂膠囊對LXRα-ABCA1及炎癥相關蛋白表達影響結果，A、B圖所示為蛋白顯影結果，C、D、E、F為顯影條帶灰度分析結果，與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01，##P＜0.01，n=3。

本研究所發(fā)現(xiàn)的銀藍調脂膠囊在抗動脈粥樣硬化方面的潛力，為深入研究該復方作用機制以及該方進一步深入開發(fā)和臨床應用具有一定的指導意義，同時也為挖掘基于膽固醇外排和抗炎發(fā)現(xiàn)新型抗動脈粥樣硬化中藥提供了借鑒。