探究桂枝、附子配伍含藥血清的制備方案

簡旖沫 湯小虎 賴張鳳

【摘 要】目的：通過高效液相色譜法（HPLC）考察桂枝、附子配伍含藥血清的制備方案。方法：將35只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、單倍劑量組、5倍劑量組、10倍劑量組和20倍劑量組，每組7只。分別采用單倍、5倍、10倍、20倍的給藥劑量予桂枝、附子配伍灌胃，正常組予生理鹽水灌胃。于給藥后15，30，60，90，120，180，240 min肝門靜脈取血，采用甲醇沉淀法、乙腈沉淀法、三氯乙酸沉淀法以及乙酸乙酯沉淀法對血清進(jìn)行處理，通過HPLC技術(shù)對血清進(jìn)行檢測分析。結(jié)果：采用20倍劑量給藥60 min后取血，經(jīng)甲醇沉淀法處理制作的含藥血清可以檢測到入血成分較多，色譜峰的分離效果好、離子強(qiáng)度高且干擾小。結(jié)論：通過HPLC法考察含藥血清的制備方案可以為探討中藥配伍入血成分的物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；含藥血清；桂枝；附子；HPLC；采血時(shí)間；給藥劑量

【ABSTRACT】Objective：To investigate the preparation of medicated serum containing Guizhi（Cinnamomum cassia Presl） and Fuzi（Aconitum carmichaeli Debx）by high performance liquid chromatography（HPLC）.Methods：Thirty-five male Wistar rats were randomly divided into a normal group，a one-dose group，a five-dose group，a ten-dose group and a twenty-dose group，7 rats in each group.Rats in each treatment group were given intragastric administration with corresponding doses of Guizhi and Fuzi and those in the normal group were given intragastric administration with normal saline.Respectively after 15，30，60，90，120，180，and 240 minutes of administration，blood was collected from hepatic portal vein.Serum was treated by methanol precipitation，acetonitrile precipitation，trichloroacetic acid precipitation and ethyl acetate precipitation，detected and analyzed by HPLC.Results：Medicated serum was better in the twenty-dose group with blood taken after 60 minutes，whose chromatographic peaks had a good separation effect，with high ionic strength and little interference.Conclusion：The preparation scheme of medicated serum by HPLC can provide theoretical basis for exploring the compatible blood components of Chinese medicine.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid；medicated serum；Guizhi；Fuzi；HPLC；blood collection time；dose of administration

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是慢性、侵蝕性、全身性自身免疫性疾病，其基本病理改變?yōu)閷ΨQ性關(guān)節(jié)滑膜炎，血管翳形成，并逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的侵蝕與破壞，最終可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[1]。目前，治療RA的常用藥物為非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素和改善病情抗風(fēng)濕藥等，這些藥物的不良反應(yīng)較大，而生物制劑價(jià)格昂貴。結(jié)合我國幾千年中醫(yī)藥治療風(fēng)濕病的特色及云南吳佩衡扶陽學(xué)術(shù)思想，以溫陽通絡(luò)法治療風(fēng)濕病為切入點(diǎn)，開展中醫(yī)藥防治風(fēng)濕病，對提高人們健康水平具有重要的意義。通過臨床實(shí)踐及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，溫陽通絡(luò)法對風(fēng)寒濕痹型RA的臨床癥狀有明顯改善，可顯著降低C-反應(yīng)蛋白、紅細(xì)胞沉降率、類風(fēng)濕因子等指標(biāo)[2]。其中桂枝、附子作為主要藥物，具有溫經(jīng)通陽、散寒除濕之功，發(fā)揮蠲痹止痛之效[3-4]。藥物經(jīng)口服后通過消化道直接吸收入血，或經(jīng)消化酶及腸內(nèi)菌群分解成代謝產(chǎn)物被吸收入血。中藥的有效物質(zhì)最終都會(huì)以血液為媒介輸送到不同的作用靶點(diǎn)發(fā)揮藥效。建立中藥入血成分的譜效關(guān)系，可以為進(jìn)一步探討桂枝、附子溫經(jīng)通絡(luò)配伍治療RA的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供理論基礎(chǔ)。而含藥血清制備過程以及檢測技術(shù)等都沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過高效液相色譜法（HPLC），分別從給藥劑量、采血時(shí)間、血清處理方面考察含藥血清的制備方案，促進(jìn)中醫(yī)藥國際化、標(biāo)準(zhǔn)化。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠35只，體質(zhì)量（200±20）g；由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK（川）2013-24。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 中藥材桂枝、附子由云南省中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)云南省中醫(yī)醫(yī)院藥劑科鑒定全部合格。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；分析天平（瑞士Metter T-oledo公司）；Biofuge Primo R離心機(jī)（德國Thermo Scientific Heraeus公司）；QT-1渦旋機(jī)（上海琪特分析儀器有限公司）；MD200-2氮?dú)獯蹈善鳎ㄉ钲谌麅x器公司）；Elmasonic S 900 H超聲波清洗器（德國Elma公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 甲醇、乙酸乙酯、乙腈、三氯乙酸（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；苯甲酰新烏頭原堿（63238-67-5）、苯甲酰烏頭原堿（466-24-0）、苯甲酰次烏頭原堿（63238-66-4）、桂皮醛（89Z9-G2NP）、對甲氧基桂皮酸乙酯（XW99-CWBR）、肉桂酸（VUZS-DKSH）（中國藥品生物制品檢定所）。

1.5 檢測條件 ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；水為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，梯度洗脫程序?yàn)榧状嫉捏w積分?jǐn)?shù)1%（0～1.0 min），1%～3%（1.0～1.5 min），3%～32%（1.5～13.5 min），32%～60%（13.5～18.5 min），60%～90%（18.5～20.5 min）進(jìn)行梯度洗脫；柱溫25 ℃，流速5 μL·min-1；檢測波長254 nm。

2 方 法

2.1 分組與給藥 Wistar大鼠35只，隨機(jī)分為單倍、5倍、10倍、20倍劑量組和正常組，每組7只。根據(jù)云南扶陽流派臨床常用生藥劑量（桂枝20 g、制附子30 g）[5]，按照“人和動(dòng)物之間按體表面積折算的等效劑量比值表”計(jì)算出大鼠等效劑量[6]，實(shí)驗(yàn)組大鼠應(yīng)當(dāng)給生藥量4.5 g·kg-1，即單倍劑量組予4.5 g·kg-1，5倍劑量組予22.5 g·kg-1，10倍劑量組予45 g·kg-1，20倍劑量組予90 g·kg-1，給藥容積為1 mL·（100 g）-1。給藥前大鼠禁食12 h以促進(jìn)藥物吸收。正常組予等量生理鹽水。

2.2 供試品的制備 分別取附子、桂枝飲片，打粉過60目篩，精密稱定600 g，置圓底燒瓶中，按料液比1∶10加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇。附子予超聲清洗器中振蕩提取50 min，浸泡1 d，回流提取2 h，提取2次，過濾，合并提取液，測定浸膏得率，回收乙醇得浸膏，滅菌后置低溫處保存?zhèn)溆肹7-8]。桂枝予熱回流提取2 h，連續(xù)3次，合并濾液，測定浸膏得率，回收乙醇得浸膏，滅菌后置低溫處保存?zhèn)溆肹9]。

2.3 含藥血清和空白血清的制備 將大鼠麻醉后平躺固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，用蘸有水的紗布把腹部被毛浸濕，再用剪刀緊貼皮膚剪去腹部被毛，然后用酒精棉球消毒腹部，用剪刀沿腹縫線自下向上打開腹腔，用鈍器將腸等腹腔臟器分向一側(cè)，將肝葉向上翻起，以暴露肝門靜脈。用連接5 mL注射器的7號(hào)針頭自上向下刺入靜脈中，刺入瞬間慢慢抽拉注射器活塞桿直至取血完成。分別于給藥后15，30，60，90，120，180，240 min肝門靜脈取血0.5 mL。

待血液凝固后，置于離心機(jī)以4 ℃，12 000 r·min-1離心3 min分離血清，同組血清合并，分別采用甲醇沉淀法、乙腈沉淀法、三氯乙酸、乙酸乙酯沉淀法對血清進(jìn)行處理，經(jīng)0.22 μm微孔濾頭過濾即得，每支0.5 mL分裝，-80 ℃條件下保存?zhèn)溆?。正常組血清為空白血清。

2.4 對照品溶液的制備 分別精密稱定桂皮醛、肉桂酸、對甲氧基桂皮酸乙酯、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的對照品適量，加入甲醇制備成每毫升含10 μg·mL-1的溶液。

2.5 方法學(xué)考察 本研究為定性實(shí)驗(yàn)，通過記錄桂皮醛對照品、肉桂酸對照品、對甲氧基桂皮酸乙酯對照品、苯甲酰新烏頭原堿對照品、苯甲酰烏頭原堿對照品、苯甲酰次烏頭原堿對照品，以及空白血清的色譜圖，觀察相同保留時(shí)間處空白血清色譜圖是否檢測出對照品的色譜峰，考察分析方法的專屬性。如圖1所示，桂皮醛、對甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿，及大鼠血清內(nèi)源性物質(zhì)均實(shí)現(xiàn)基線分離，且在對照品色譜峰的“信號(hào)窗”（信號(hào)附近的有限范圍）內(nèi)沒有出現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)信號(hào)的干擾。

3 結(jié) 果

3.1 血清樣品處理方法的考察 精密吸取每組血清0.2 mL，分別加入甲醇、乙腈、三氯乙酸、乙酸乙酯至1 mL，按比例1∶5，渦旋混勻10 min，離心機(jī)以10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，氮?dú)獯蹈珊螅?00 μL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm濾膜濾過除菌，每支0.5 mL分裝，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩＝Y(jié)果顯示，通過甲醇沉淀法制備的血清樣品，可以檢測到的入血成分較多，色譜峰的分離效果好、離子強(qiáng)度高且干擾小。以20倍劑量組為例，各種沉淀法色譜圖見圖2。

3.2 給藥劑量的考察 分別將單倍、5倍、10倍、20倍劑量組含藥血清及正常組空白血清樣品通過甲醇沉淀法處理后，予HPLC進(jìn)行檢測分析。結(jié)果顯示，20倍劑量組血清樣品可以檢測到的入血成分較多，色譜峰的分離效果好、離子強(qiáng)度高且干擾小。見圖3。

3.3 采血時(shí)間的考察 分別將20倍劑量灌胃后15，30，60，90，120，180，240 min肝門靜脈取血的含藥血清及空白血清樣品通過甲醇沉淀法處理后，予HPLC進(jìn)行檢測分析。結(jié)果顯示，灌胃60 min后取血清樣品可以檢測到的入血成分較多，色譜峰的分離效果好、離子強(qiáng)度高且干擾小。見圖4。

4 討 論

RA是慢性、侵蝕性、全身性的自身免疫疾病。西藥不良反應(yīng)大，價(jià)格成本高，開展中醫(yī)藥對風(fēng)濕病的防治和提高人民群眾健康水平意義重大。桂枝具有發(fā)汗解肌、溫經(jīng)通脈、助陽化氣、散寒止痛的功效。附子具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛的功效。前期課題對促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6的調(diào)控作用進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，桂枝、附子配伍能不同程度降低風(fēng)寒濕痹膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型異常升高的TNF-α、IL-1β、IL-6，對關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生、炎癥浸潤及關(guān)節(jié)破壞有不同程度的抑制作用[10]。然而，中藥及復(fù)方的藥效發(fā)揮是多種化學(xué)成分相互作用的綜合效果。王喜軍[11]認(rèn)為，中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是衡量中藥有效性的基本標(biāo)志，建立中藥譜效關(guān)系是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化、國際化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12]。以中藥口服給藥后的血清為指標(biāo)，采用現(xiàn)代科技，從血清中分離、鑒定移行成分則能更直接、客觀地反映中藥藥代動(dòng)力學(xué)的特點(diǎn)，可以為進(jìn)一步探討桂枝、附子溫經(jīng)通絡(luò)配伍治療RA的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供理論基礎(chǔ)。

在近20年的發(fā)展中，中藥血清藥化學(xué)在方法學(xué)方面做了諸多改進(jìn)；但含藥血清制作過程評判等均沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果備受爭議。本課題分別從給藥劑量、采血時(shí)間、血清處理方面對含藥血清的制備進(jìn)行考察，做出綜合技術(shù)評定，監(jiān)測有效成分在各時(shí)間點(diǎn)血藥濃度的變化，對含藥血清的制備進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究。由于含藥血清中藥物成分含量低、內(nèi)源性物質(zhì)干擾以及儀器設(shè)備等客觀條件影響，低劑量給藥幾乎檢測不到血中移行成分，且不能無限制地增加取樣量，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及大鼠對藥物劑量的承受影響，故采用單倍、5倍、10倍、20倍劑量對大鼠灌胃進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20倍劑量給藥制作的含藥血清檢測到的血中移行成分的數(shù)量多。血液中含有大量的酶和蛋白，這些內(nèi)源性物質(zhì)可繼續(xù)降解血清中的藥物成分，干擾檢測，同時(shí)損害儀器。故血清樣品分析檢測前需去除蛋白等物質(zhì)，將與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物成分釋放出來，降低干擾，準(zhǔn)確地測定吸收入血的藥物原型成分以及代謝產(chǎn)物。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)顯示，常見的去除蛋白的方法有溶劑處理、酶水解處理及熱水浴處理法等。酶水解法不適用于堿性條件下容易水解的成分，而熱水浴法只能去除熱變性蛋白，故采用溶劑處理血清。加入與水相混溶的有機(jī)溶劑可使蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚，使蛋白質(zhì)結(jié)合的成分釋放出來[13]。目前，常見蛋白質(zhì)沉淀法主要有甲醇、乙腈、三氯乙酸、乙酸乙酯，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用甲醇沉淀法制備桂枝、附子的含藥血清，可以檢測到入血的藥物成分較多，且干擾少。中藥所含化學(xué)成分十分復(fù)雜，血清中不同藥物成分的達(dá)峰時(shí)間也不同。本實(shí)驗(yàn)通過對灌胃桂枝、附子配伍后不同時(shí)間采血的含藥血清色譜圖的考察，分析給藥后血清中藥物成分的動(dòng)態(tài)變化過程。結(jié)果顯示，給藥后60 min取血的血清樣品可以檢測到的入血成分多，色譜峰的分離效果好、離子強(qiáng)度高且干擾小。由于氣相色譜只能分離易揮發(fā)且不分解的物質(zhì)，而附子含有較多大分子物質(zhì)，液相色譜可以分離生物大分子，故采用HPLC對含藥血清進(jìn)行分析。然而中藥含藥血清中的化合物較多且藥物成分含量極低，雜質(zhì)干擾大，HPLC靈敏度相對較低，導(dǎo)致檢測結(jié)果欠理想。未來可以采用HPLC-DAD/MS、LC-MS/MS、HPLC-DAD-MS/MS及GC-MS等分析技術(shù)，有較好的成分分離能力且檢測靈敏度高，能夠?qū)?fù)雜樣品中的多種成分進(jìn)行定性和定量分析。

通過HPLC考察含藥血清的制備方案可以為探討中藥配伍入血成分的物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。對確立中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究具有深遠(yuǎn)影響，對于闡明中藥復(fù)方的組方原理、作用機(jī)制，促進(jìn)臨床合理使用中藥等都具有重要的意義。

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收稿日期：2018-06-25；修回日期：2018-09-30