結核分枝桿菌耐對氨基水楊酸相關基因研究進展

郭艷，陳玲

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的一種傳染病，耐多藥結核?。∕DR-TB）是指同時對利福平和異煙肼耐藥的結核病，而廣泛耐藥結核?。╔DR-TB）指對異煙肼和利福平耐藥同時還對氟喹諾酮類藥物及氨基糖甙類注射液耐藥的結核病。據(jù)統(tǒng)計，2017年全球范圍內(nèi)共有160 684例MDR-TB患者，其中XDR-TB約占8.5%，而約40%的MDR-TB患者集中于印度和中國［1］。我國是結核病高負擔國家之一，耐藥結核病發(fā)病率高于全球平均水平并呈現(xiàn)逐漸升高趨勢［2］，而耐藥結核病的持續(xù)存在給結核病防控工作帶來了嚴峻挑戰(zhàn)［3］。與其他細菌感染治療方案相比，結核病化療方案周期更長、用藥方案更復雜，但整體治療失敗率較高，因此MDR-TB、XDRTB及完全耐藥結核?。═DR-TB）發(fā)病率、致死率均出現(xiàn)逐年升高趨勢。

對氨基水楊酸（PAS）是20世紀40年代研發(fā)的有效抗結核藥物之一，對結核分枝桿菌具有良好的抑制作用［4］，曾在抗結核治療方案中具有重要地位，但隨著之后其他更有效的抗結核藥物出現(xiàn)，PAS地位逐漸下降并遠離人們視線，但其仍是目前世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的有效抗結核藥物之一。研究表明，初、復治結核病患者PAS耐藥率分別為4.69%、26.00%，僅次于左氧氟沙星，居常用抗結核藥物第六位［5］，因此PAS常與其他抗結核藥物聯(lián)用治療MDR-TB及 XDR-TB［1，6-17］。據(jù)調(diào)查，2011—2015年 PAS的臨床使用呈逐漸增多趨勢［6］。

研究表明，PAS與其他抗結核藥物聯(lián)用有利于增強其他抗結核藥物療效并減少其他抗結核藥物耐藥的發(fā)生［10，12］，如增強異煙肼殺菌作用并減少肝功能異常、胃腸道反應等毒副作用的發(fā)生，與鏈霉素聯(lián)用減少鏈霉素耐藥的發(fā)生，與利奈唑胺聯(lián)用具有協(xié)同增效作用等，因此PAS可用于治療難治性肺結核［7，10，18］。此外，PAS 顆粒制劑及其他改良制劑（PAS衍生物）不僅可提高PAS抑菌活性，還有利于提高患者耐受性，且耐藥率較低，因此，對于不能采用其他更有效的二線抗結核藥物治療的MDR-TB或XDR-TB患者，PAS及其改良制劑不失為最好的選擇［9，12-15，19］；但有研究表明，PAS使用頻率為1次/d較間歇性給藥更有利于減少聯(lián)用藥物耐藥的發(fā)生［12］，但PAS的t1/2較短、每日使用劑量較大，因此其效率降低時并不是最佳聯(lián)用藥物［13-14，17］。本文綜述了結核分枝桿菌耐PAS相關基因，旨在為結核分枝桿菌對PAS的耐藥機制研究提供參考。

1 PAS的作用機制

PAS屬抑菌劑，作為葉酸前體對氨基苯甲酸酯（PABA）的緊密結構類似物，其可與PABA競爭性結合二氫葉酸合酶（DHFS），進而抑制四氫葉酸（THF）的生物合成并導致脫氧尿苷5'-磷酸（dUMP）合成脫氧胸苷5'-磷酸（dTMP）途徑受阻，最終造成結核分枝桿菌DNA合成障礙并抑制結核分枝桿菌生長［4，20-21］。此外，PAS還可通過激活二氫蝶酸合酶（DHPS）及DHFS而產(chǎn)生有毒的羥基二氫葉酸，繼而抑制二氫葉酸還原酶抗代謝物并干擾二氫葉酸代謝途徑、抑制葉酸的生物合成，達到抑制結核分枝桿菌生長的目的［22］。

2 PAS耐藥相關基因

PAS的應用雖經(jīng)歷了很長時間，但其具體耐藥機制尚未完全清楚。目前研究結果顯示，PAS耐藥主要與藥物靶基因突變有關，已知的PAS耐藥相關基因包括thyA基因（Rv2764c）、folC基因（Rv2447c）、ribD基 因（Rv2761）、papA1基因（RV3824c）4種。

2.1 thyA基因 thyA基因全長792 bp，編碼胸苷酸合成酶thyA并參與脫氧核糖核苷酸的生物合成，而脫氧核糖核苷酸是DNA生物合成所需dTMP的唯一來源。2004年，RENGARAJAN首次將thyA基因與葉酸途徑聯(lián)系起來，并認為thyA基因突變與PAS耐藥相關，后經(jīng)多項研究證實［20-21，23-30］。thyA基因突變可干擾胸苷酸合酶的合成并導致胸苷酸合酶活性降低，繼而影響胸腺嘧啶生物合成所需葉酸途徑，而PAS屬葉酸拮抗劑，因此推測PAS的耐藥機制與葉酸途徑受阻有關［21，23-28］。研究表明，對PAS耐藥的結核分枝桿菌thyA基因突變頻率約為33%［23，25］（見表1），可以是單基因突變，也可以是雙基因突變，主要突變類型包括置換、顛換、插入、缺失等［23］，以單個堿基缺失和插入突變?yōu)橹?，其中?9位密碼子缺失C、第168位密碼子缺失C最為常見［29］。T202A是thyA基因突變的主要位點，約占66%［24-25］，也是thyA基因突變的特異性位點［28］；體外實驗表明，thyA基因敲除后結核分枝桿菌對PAS高度耐藥，證實thyA基因突變可導致PAS耐藥，但由于thyA基因與thyX基因具有相同功能并可以互補，因此單純敲除thyA基因并不影響體內(nèi)結核分枝桿菌生長［26］。

2.2 folC基因 folC基因全長1 464 bp，編碼參與葉酸途徑的DHFS并將葉酸轉化為聚谷氨酸衍生物。DHFS的主要作用是催化7，8-二氫蝶酸到二氫葉酸的谷氨酰胺化，后經(jīng)二氫葉酸還原酶進一步處理形成THF，而THF是甲酰甲硫氨酰-tRNA生物合成所必需的，也是啟動原核生物蛋白質(zhì)合成的關鍵成分［31］。folC基因突變可導致DHFS活性降低并使PAS無法被活化，從而導致PAS耐藥；通過對結核分枝桿菌folC基因進行測序發(fā)現(xiàn)，結核分枝桿菌folC基因突變頻率約為8%，通過回補實驗證實folC基因突變與PAS耐藥有關。點突變是folC基因突變的主要類型，而突變位點多種多樣［19，22，31-34］，已知突變位點見表1。

2.3 ribD基因 ribD基因又稱ribG基因，全長777 bp，主要催化雙功能酶核黃素生物合成的第二、第三反應途徑，即2，5-二氨基-6-核糖氨基-4（3H）-嘧啶酮5'-磷酸（DAROPP）轉化為5-氨基-6-（1H，3H）-嘧啶二酮5'-磷酸酯（ARIPP）。ribD基因能夠催化二氫葉酸還原為THF，因此ribD基因過表達可結合二氫蝶啶類似物并使其減少，繼而導致PAS耐藥［35］。通常情況下，RibD基因表達水平較低，因此不能完全取代dfrA的功能，而ribD基因過表達可替代二氫葉酸還原酶，進而導致PAS耐藥［36］。

2.4 papA1基因 papA1基因全長1 546 bp，是聚酮合酶相關基因之一，存在于編碼結核分枝桿菌的同一基因組內(nèi)，參與合成和運輸聚酮合酶相關蛋白A1，是結核分枝桿菌生長及其毒力的必需成分，也是結核分枝桿菌SL-1生物合成所必需的［37-38］。papA1基因測序結果僅發(fā)現(xiàn)1個無義突變，為papA1基因339位C→T點突變（見表1），因此推測papA1基因可能作為酰基轉移酶基因而參與PAS耐藥，但由于實驗樣本較少而暫不能明確papA1基因突變是否與PAS耐藥相關［39］。有研究通過對結核分枝桿菌H37Rv papA1基因進行擴增、定點突變、突變修補等證實敲除噬菌體papA1基因可導致無效突變且未找到中間突變體，提示papA1基因是結核分枝桿菌生物合成所必需的基因之一［33］。

3 小結與展望

綜上所述，目前已知的PAS耐藥相關基因包括thyA基因、folC基因、ribD基因、papA1基因4種，其中thyA基因通過與PABA競爭DHFS而干擾葉酸代謝，導致PAS耐藥；folC基因參與形成二氫葉酸類似物，folC基因突變通過影響二氫芥酸酯結合及羥基二異戊酸而導致H2PtePAS谷氨酰胺效率降低，繼而導致PAS耐藥；ribD基因過表達可影響葉酸代謝，進而導致PAS耐藥［30］；papA1基因突變是否與PAS耐藥直接相關還需進一步研究證實。

目前研究表明，PAS作用機制及耐藥機制除與葉酸代謝途徑、?；D移酶途徑有關外，還可能存在其他未知途徑，仍需不斷深入研究及探索；基因突變是結核分枝桿菌對PAS耐藥的主要分子作用機制，其中thyA、folC基因突變導致PAS耐藥已經(jīng)證實并已尋找到多個突變位點，但具體耐藥機制仍需進一步研究，而雖有研究表明ribD、papA1基因突變與PAS耐藥有關，但尚未找到確切突變位點，仍需進一步研究證實。積極尋找新的抗結核藥物或探尋現(xiàn)有抗結核藥物的耐藥機制并進行相應干預有利于減少結核分枝桿菌耐藥的發(fā)生，也是有效防控結核病、快速診斷及治療耐藥結核病的重要研究方向，而關于PAS耐藥基因及耐藥機制的深入研究將有利于保證PAS在MDR-TB/XDR-TB的治療中發(fā)揮應有作用［39］。

表1 已知的PAS耐藥相關基因突變位點及藥敏試驗結果
Table 1 Known drug resistance related gene mutation sites to PAS and drug sensitivity test results

thyA基因G5T 谷氨酸-終止 1/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］G15C 甘氨酸-精氨酸 1/55 0/22 8～32 μg/ml NA MATHYS等［24］G38C 半胱氨酸-絲氨酸 1/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］T52C 絲氨酸-脯氨酸 1/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］G83A 色氨酸-終止 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］G91A 甘氨酸-精氨酸 3/55 0/22 NA NA MATHYS等［24］G91A 甘氨酸-精氨酸 1/55 0/22 NA NA MATHYS等［24］A97G 谷氨酰胺-精氨酸 2/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］C111T 谷氨酰胺-終止 2/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］A117G 天冬氨酸-甘氨酸 5/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］T118A 亮氨酸-終止 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］G127T 精氨酸-亮氨酸 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］T143C 亮氨酸-脯氨酸 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］T146C 半胱氨酸-精氨酸 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］T152G 苯丙氨酸-纈氨酸 1/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］C153A 酪氨酸-終止 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］C164A 酪氨酸-終止 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］T172C 亮氨酸-脯氨酸 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］G182C 丙氨酸-脯氨酸 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］T183G 亮氨酸-纈氨酸 1/55 0/22 ＜64 μg/ml NA MATHYS等［24］G188A 甲硫氨酸-異亮氨酸 NA 1/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］A191G 谷氨酰胺-精氨酸 1/55 0/22 ＜64 μg/ml NA MATHYS等［24］T202A 蘇氨酸-丙氨酸 22/55 0/22 ＜128 μg/ml NA MATHYS等［24］A202G 蘇氨酸-丙氨酸 32/50 5/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］A207G 組氨酸-精氨酸 2/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］G212A 色氨酸-終止 1/22 0/20 NA NA 張宗德等［23］C223A 組氨酸-天冬酰胺 6/22 0/20 NA NA 張宗德等［23］T230G 亮氨酸-精氨酸 1/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］C251G 酪氨酸-終止 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］G259C 丙氨酸-脯氨酸 1/55 0/22 ＜64 μg/ml NA MATHYS等［24］T261G 纈氨酸-甘氨酸 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］C262T 丙氨酸-纈氨酸 1/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］

（續(xù)表1）

注：n/N=基因突變菌株/檢測菌株，MIC=最低抑菌濃度，NA表示未提及或無相關數(shù)據(jù)

基因突變位點（堿基） 氨基酸改變 耐藥菌株突變頻率（n/N）敏感菌株突變頻率（n/N）耐藥菌株MIC值敏感菌株MIC值 參考文獻G263A 纈氨酸-異亮氨酸 1/55 0/22 NA NA MATHYS等［24］G265T 甘氨酸-半胱氨酸 2/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］C327T 異亮氨酸-異亮氨酸 1/22 0/20 NA NA 張宗德等［23］332插入A 谷氨酰胺-精氨酸 3/22 0/20 NA NA 張宗德等［23］C339G 絲氨酸-精氨酸 1/22 0/20 NA NA 張宗德等［23］355缺失C 亮氨酸-纈氨酸 4/22 0/20 NA NA 張宗德等［23］C439T 組氨酸-酪氨酸 1/22 0/20 NA NA 張宗德等［23］T454G 苯丙氨酸-纈氨酸 1/22 0/20 NA NA 張宗德等［23］T490G 酪氨酸-天冬氨酸 1/22 0/20 NA NA 張宗德等［23］550插入C 亮氨酸-脯氨酸 1/22 0/20 NA NA 張宗德等［23］C615G 天冬氨酸-谷氨酰胺 2/22 0/20 NA NA 張宗德等［23］folC基因A40G 谷氨酸-甘氨酸 2/8 0/87 ＞0.125 μg/ml ＜0.125 μg/ml 趙斐［31］T43C 異亮氨酸-酪氨酸 2/8 0/87 ＞0.125 μg/ml ＜0.125 μg/ml 趙斐［31］A43G 異亮氨酸-丙氨酸 1/8 0/87 ＞0.125 μg/ml ＜0.125 μg/ml 趙斐［31］G111A 甘氨酸-絲氨酸 1/8 0/87 ＞0.125 μg/ml ＜0.125 μg/ml 趙斐［31］A112C 天冬氨酸-丙氨酸 1/8 0/87 ＞0.125 μg/ml ＜0.125 μg/ml 趙斐［31］C410T 精氨酸-色氨酸 1/8 0/87 ＞0.125 μg/ml ＜0.125 μg/ml 趙斐［31］papA1基因C339T NA 無義突變 NA NA NA 鄭曉靜等［39］