初治肺結(jié)核患者耐藥情況、耐藥危險(xiǎn)因素、耐藥基因及其輔助診斷技術(shù)研究

楊芳 ，張磊

結(jié)核病是威脅人類健康的重大傳染病之一，近年來(lái)由于結(jié)核分枝桿菌耐藥增多而導(dǎo)致結(jié)核病出現(xiàn)復(fù)燃之勢(shì)［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，目前全球約有5 000萬(wàn)人受到耐藥結(jié)核分枝桿菌感染［2］，我國(guó)結(jié)核分枝桿菌耐藥率約為37.8%，且初治結(jié)核病患者結(jié)核分枝桿菌耐藥率雖低于復(fù)治結(jié)核病患者，但耐藥率仍在35%左右［3］，因此初治結(jié)核病患者結(jié)核分枝桿菌耐藥已成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，在初治肺結(jié)核患者中不僅檢測(cè)到對(duì)一線抗結(jié)核藥物如利福平、異煙肼等耐藥的菌株，還檢測(cè)到對(duì)二線抗結(jié)核藥物耐藥的菌株［4］，提示耐藥結(jié)核分枝桿菌于人際間傳播速度加快，給結(jié)核病的防控工作帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。本研究旨在探討初治肺結(jié)核患者耐藥情況、耐藥危險(xiǎn)因素、耐藥基因及其輔助診斷技術(shù)，為結(jié)核病的有效防控及減少結(jié)核分枝桿菌耐藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年7—12月西安市胸科醫(yī)院收治的初治肺結(jié)核患者478例，均未進(jìn)行過(guò)抗結(jié)核治療或治療時(shí)間＜1個(gè)月，痰培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性并完成藥敏試驗(yàn)；排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有嚴(yán)重心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病及糖尿病者。所有患者中男316例，女162例；年齡6～91歲，中位年齡36歲（Q131歲，Q462歲）；常住人口450例，流動(dòng)人口28例；城鎮(zhèn)居民211例，農(nóng)村居民267例。

1.2 痰培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn) 采用美國(guó)BD公司BACTEC MGIT 960系統(tǒng)進(jìn)行痰培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)，其中藥敏試驗(yàn)采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）推薦的比例法（method of proportion，MOP），檢測(cè)藥物包括4種一線抗結(jié)核藥物（包括異煙肼、利福平、乙胺丁醇及鏈霉素）和7種二線抗結(jié)核藥物（包括左氧氟沙星、利福噴丁、莫西沙星、對(duì)氨基水楊酸鈉、卷曲霉素、丙硫異煙胺、阿米卡星），判斷臨界值為1%。

1.3 耐藥類型判斷標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)核分枝桿菌對(duì)1種一線抗結(jié)核藥物耐藥定義為單耐藥結(jié)核病（MR-TB），對(duì)1種以上一線抗結(jié)核藥物耐藥但不包括同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平耐藥定義為多耐藥結(jié)核?。≒R-TB），至少同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平耐藥定義為耐多藥結(jié)核?。∕DR-TB），對(duì)異煙肼和利福平耐藥同時(shí)對(duì)氟喹諾酮類藥物及二線抗結(jié)核藥物（卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素）中的至少1種耐藥定義為廣泛耐藥結(jié)核?。╔DR-TB）。本研究將出現(xiàn)MR-TB、PR-TB、MDR-TB、XDR-TB中的任1種者統(tǒng)稱為耐藥肺結(jié)核。

1.4 耐藥相關(guān)因素 于患者就診時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)卷收集其人口學(xué)特征，包括性別、年齡、人口類型、受教育程度、家庭人均月收入、身高、體質(zhì)量并計(jì)算體質(zhì)指數(shù)（BMI），以BMI＜18.5 kg/m2為 偏 瘦，18.5～23.9 kg/m2為 正 常，24.0～27.9 kg/m2為超重/肥胖；分析患者臨床特征，包括咳嗽時(shí)間、咯血或血痰、雙肺受累肺野數(shù)及肺結(jié)核患者接觸史；所有患者進(jìn)行胸部X射檢查并由專業(yè)醫(yī)師判斷雙肺受累情況，以第2、4肋骨前端下緣水平線為界，將雙肺分為上、中、下3野，記錄雙肺受累肺野數(shù)。

1.5 耐藥基因檢測(cè)及輔助診斷技術(shù) （1）采用基因芯片法檢測(cè)利福平耐藥相關(guān)rpoB基因、異煙肼耐藥相關(guān)katG/inhA基因突變情況，所用儀器為晶芯 RTisochipTM-A恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀（博奧生物集團(tuán)有限公司生產(chǎn)）。（2）采用熒光探針?lè)ㄟM(jìn)行雙通道聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌DNA片段并采用恒溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌RNA，TB-SAT試劑盒購(gòu)自上海仁度生物科技有限公司，所用儀器為ThermoFisher生產(chǎn)的Veriti儀，以擴(kuò)增CT值≥40為陽(yáng)性。（3）采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)，結(jié)核分枝桿菌免疫反應(yīng)檢測(cè)值〔TB（T-N）〕≥14為陽(yáng)性，TB-IGRA試劑盒購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司。（4）采用蛋白芯片法檢測(cè)結(jié)核抗體三項(xiàng)，包括LAM抗體、38DKa抗體及16DKa抗體，TB03A試劑盒購(gòu)自南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用EpiData 3.1軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)并雙人雙機(jī)錄入數(shù)據(jù)，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（x ±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher's確切概率法；采用Kappa值判斷耐藥基因檢測(cè)與藥敏試驗(yàn)的一致性，Kappa值≤0.20為一致性極低，0.21～0.40為一致性一般，0.41～0.60為一致性中等，0.61～0.80為一致性較高，0.81～1.00為幾乎完全一致；初治肺結(jié)核患者耐藥的危險(xiǎn)因素分析采用多因素Logistic回歸分析（逐步法）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥情況 478例患者中126例耐藥，耐藥率為26.4%。478例患者中對(duì)一線抗結(jié)核藥物異煙肼耐藥64例（13.4%），利福平耐藥33例（6.9%），乙胺丁醇耐藥20例（4.2%），鏈霉素耐藥75例（15.7%）；對(duì)二線抗結(jié)核藥物左氧氟沙星耐藥28例（5.9%），利福噴丁耐藥28例（5.9%），莫西沙星耐藥23例（4.8%），對(duì)氨基水楊酸鈉耐藥21例（4.4%），卷曲霉素耐藥7例（1.5%），丙硫異煙胺耐藥2例（0.4%），阿 米 卡 星 耐 藥2例（0.4%）；MR-TB 50例（10.5%），MDR-TB 30例（6.3%），XDR-TB 21例（4.4%），其他25例（5.2%）。

2.2 耐藥危險(xiǎn)因素 不同耐藥情況患者男性比例、人口類型、家庭人均月收入、BMI、咯血或血痰發(fā)生情況、肺結(jié)核患者接觸史比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同耐藥情況患者年齡、受教育程度、咳嗽時(shí)間≥3周者所占比例、雙肺受累肺野數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。將年齡（賦值：＜30歲=0，30～59歲=1，≥60歲=2）、受教育程度（賦值：初中及以下=0，高中/中專=1，大學(xué)及以上=2）、咳嗽時(shí)間≥3周（賦值：否=0，是=1）、雙肺受累肺野數(shù)（賦值：1～5個(gè)=0，6個(gè)=1）作為自變量，將藥敏試驗(yàn)結(jié)果（賦值：敏感=0，耐藥=1）作為因變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示年齡、雙肺受累肺野數(shù)是初治肺結(jié)核患者耐藥的危險(xiǎn)因素（P＜0.05，見表2）。

表2 初治肺結(jié)核患者耐藥相關(guān)因素的多因素Logistic回歸分析結(jié)果Table 2 Multivariate Logistic regression analysis on related factors of drug resistance in untreated patients with pulmonary tuberculosis

2.3 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 478例患者中210例行利福平耐藥相關(guān)rpoB基因、異煙肼耐藥相關(guān)katG/inhA基因檢測(cè)，結(jié)果顯示利福平耐藥相關(guān)rpoB基因突變?cè)\斷初治肺結(jié)核患者耐藥的靈敏度為83.3%，特異度為99.0%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為83.3%，陰性預(yù)測(cè)值為99.0%，Kappa值為0.823；異煙肼耐藥相關(guān)katG/inhA基因突變?cè)\斷初治肺結(jié)核患者耐藥的靈敏度為58.6%，特異度為100.0%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.0%，陰性預(yù)測(cè)值為93.8%，Kappa值為0.709（見表3）。

表1 初治肺結(jié)核患者耐藥相關(guān)因素的單因素分析〔n（%）〕Table 1 Univariate analysis on related factors of drug resistance in untreated patients with pulmonary tuberculosis

表3 利福平耐藥相關(guān)rpoB基因、異煙肼耐藥相關(guān)katG/inhA基因突變對(duì)初治肺結(jié)核患者耐藥的診斷價(jià)值（例）Table 3 Diagnostic value of rifampin-resistant related rpoB and isoniazidresistant related katG/inhA gene mutation on drug resistance in untreated patients with pulmonary tuberculosis

2.4 輔助診斷技術(shù)檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 雙通道PCR 37例患者雙通道PCR結(jié)核分枝桿菌RNA擴(kuò)增結(jié)果缺失，雙通道PCR結(jié)核分枝桿菌RNA擴(kuò)增診斷初治肺結(jié)核患者耐藥的靈敏度為75.2%，特異度為34.9%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為27.5%，陰性預(yù)測(cè)值為81.1%，Kappa值為0.449；10例患者雙通道PCR結(jié)核分歧桿菌DNA擴(kuò)增結(jié)果缺失，雙通道PCR結(jié)核分歧桿菌DNA擴(kuò)增診斷初治肺結(jié)核患者耐藥的靈敏度為82.4%，特異度為29.4%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為29.9%，陰性預(yù)測(cè)值為82.1%，Kappa值為0.436（見表4）。

2.4.2 結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè) 71例患者結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果缺失；結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)診斷初治肺結(jié)核患者耐藥的靈敏度為71.4%，特異度為22.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為26.0%，陰性預(yù)測(cè)值為67.7%，Kappa值為0.361（見表5）。

2.4.3 結(jié)核抗體三項(xiàng) 35例患者結(jié)核抗體三項(xiàng)結(jié)果缺失。LAM抗體診斷初治肺結(jié)核患者耐藥的靈敏度為65.3%，特異度為39.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為28.2%，陰性預(yù)測(cè)值為75.9%，Kappa值為0.465；38DKa抗體診斷初治肺結(jié)核患者耐藥的靈敏度為69.5%，特異度為43.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為30.9%，陰性預(yù)測(cè)值為79.8%，Kappa值為0.506；16DKa抗體診斷初治肺結(jié)核患者耐藥的靈敏度為2.5%，特異度為92.2%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為12.0%，陰性預(yù)測(cè)值為72.5%，Kappa值為0.691（見表6）。

表4 雙通道PCR結(jié)核分枝桿菌RNA、DNA擴(kuò)增對(duì)初治肺結(jié)核患者耐藥的診斷價(jià)值（例）Table 4 Diagnostic value of Mycobacterium tuberculosis RNA and DNA amplification on drug resistance in dual-channel PCR in untreated patients with pulmonary tuberculosis

表5 結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)對(duì)初治肺結(jié)核患者耐藥的診斷價(jià)值（例）Table 5 Diagnostic value of T cell test for tuberculosis infection on drug resistance in untreated patients with pulmonary tuberculosis

3 討論

遏制耐藥結(jié)核病的流行是當(dāng)前形勢(shì)下控制結(jié)核病傳播的關(guān)鍵，但耐藥結(jié)核病對(duì)常用抗結(jié)核藥物耐藥、治療困難、傳染風(fēng)險(xiǎn)大，可導(dǎo)致患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)加重，已成為我國(guó)公共衛(wèi)生問(wèn)題之一［2］。由于初治肺結(jié)核患者未服用過(guò)抗結(jié)核藥物或治療時(shí)間＜1個(gè)月，因此其體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌耐藥并非藥物作用導(dǎo)致，而是直接感染了耐藥結(jié)核分枝桿菌［5］。了解初治肺結(jié)核患者耐藥情況、耐藥類型對(duì)了解肺結(jié)核傳播、流行規(guī)律并制定有針對(duì)性的防控措施具有重要意義。

表6 結(jié)核抗體三項(xiàng)對(duì)初治肺結(jié)核患者耐藥的診斷價(jià)值（例）Table 6 Diagnostic value of triune tuberculosis antibodies on drug resistance in untreated patients with pulmonary tuberculosis

本研究結(jié)果顯示，478例初治肺結(jié)核患者耐藥率為26.4%，對(duì)一線抗結(jié)核藥物異煙肼耐藥率為13.4%，利福平耐藥率為6.9%，與既往文獻(xiàn)報(bào)道相似［4，6-7］。MDR-TB具有治療成功率低、治療費(fèi)用昂貴、致死率高、治療藥物毒副作用大等特點(diǎn)，是耐藥結(jié)核病研究熱點(diǎn)之一［8-9］。本研究結(jié)果顯示，478例初治肺結(jié)核患者中檢出MDR-TB 30例（6.3%），高于黃靜靜等［4］研究結(jié)果，提示該地區(qū)應(yīng)注意MDR-TB的流行。

研究表明，年齡較大、存在基礎(chǔ)疾病、免疫力低下者感染耐藥結(jié)核分枝桿菌的風(fēng)險(xiǎn)較大［10］。本研究進(jìn)行的單因素分析結(jié)果顯示，不同耐藥情況患者年齡、受教育程度、咳嗽時(shí)間≥3周者所占比例、雙肺受累肺野數(shù)間存在差異，進(jìn)一步行多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，年齡、雙肺受累肺野數(shù)是初治肺結(jié)核患者耐藥的危險(xiǎn)因素，與FURIN等［11］研究結(jié)果一致；本研究未發(fā)現(xiàn)不同藥敏試驗(yàn)結(jié)果患者男性比例、人口類型、家庭人均月收入、BMI、咯血或血痰發(fā)生情況、肺結(jié)核患者接觸史間存在差異，可能與樣本量較小有關(guān)，但需要指出的是，126例耐藥肺結(jié)核患者中年齡＜30歲者所占比例為36.5%，而237例年齡＜30歲的初治肺結(jié)核患者耐藥肺結(jié)核發(fā)生率為19.4%，提示初治肺結(jié)核患者應(yīng)積極行藥敏試驗(yàn)及耐藥篩查并盡量覆蓋一線和二線抗結(jié)核藥物，而不應(yīng)依據(jù)年齡、生活習(xí)慣等忽視耐藥肺結(jié)核的篩查。

近年來(lái)，隨著基因測(cè)序技術(shù)發(fā)展，結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)得以快速推廣應(yīng)用。本研究結(jié)果顯示，利福平耐藥相關(guān)rpoB基因診斷初治肺結(jié)核患者耐藥的靈敏度為83.3%，特異度為99.0%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為83.3%，陰性預(yù)測(cè)值為99.0%，Kappa值為0.823，提示rpoB基因突變對(duì)利福平耐藥的診斷價(jià)值較高，基因檢測(cè)技術(shù)有望成為早期發(fā)現(xiàn)耐藥結(jié)核分枝桿菌的有力手段［12］；異煙肼耐藥相關(guān)katG/inhA基因突變?cè)\斷初治肺結(jié)核患者耐藥的靈敏度為58.6%，特異度為100.0%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.0%，陰性預(yù)測(cè)值為93.8%，Kappa值為0.709，低于耿紅等［13］研究結(jié)果，提示katG/inhA基因突變對(duì)異煙肼耐藥的診斷價(jià)值一般，或耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌可能與katG/inhA基因之外的其他基因突變有關(guān)，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

由于結(jié)核分枝桿菌痰培養(yǎng)所需時(shí)間較長(zhǎng)，因此雙通道PCR、結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)、結(jié)核抗體三項(xiàng)等結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)技術(shù)亦常應(yīng)用［14-15］。本研究結(jié)果顯示，雙通道PCR結(jié)核分枝桿菌RNA擴(kuò)增診斷初治肺結(jié)核患者耐藥的靈敏度為75.2%，特異度為34.9%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為27.5%，陰性預(yù)測(cè)值為81.1%，Kappa值為0.449；雙通道PCR結(jié)核分歧桿菌DNA擴(kuò)增診斷初治肺結(jié)核患者耐藥的靈敏度為82.4%，特異度為29.4%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為29.9%，陰性預(yù)測(cè)值為82.1%，Kappa值為0.436；結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)診斷初治肺結(jié)核患者耐藥的靈敏度為71.4%，特異度為22.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為26.0%，陰性預(yù)測(cè)值為67.7%，Kappa值為0.361；LAM抗體診斷初治肺結(jié)核患者耐藥的靈敏度為65.3%，特異度為39.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為28.2%，陰性預(yù)測(cè)值為75.9%，Kappa值為0.465；38DKa抗體診斷初治肺結(jié)核患者耐藥的靈敏度為69.5%，特異度為43.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為30.9%，陰性預(yù)測(cè)值為79.8%，Kappa值為0.506；16DKa抗體診斷初治肺結(jié)核患者耐藥的靈敏度為2.5%，特異度為92.2%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為12.0%，陰性預(yù)測(cè)值為72.5%，Kappa值為0.691，提示雙通道PCR、結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)、結(jié)核抗體三項(xiàng)對(duì)初治肺結(jié)核患者耐藥的診斷價(jià)值一般，因此應(yīng)注意結(jié)合地區(qū)耐藥結(jié)核病流行規(guī)律及結(jié)核分枝桿菌輔助診斷技術(shù)的靈敏度、特異度等，以提高耐藥結(jié)核分枝桿菌檢出率。

綜上所述，初治肺結(jié)核患者耐藥率為26.4%，MDR-TB檢出率為6.3%，應(yīng)注意MDR-TB的流行；年齡、雙肺受累肺野數(shù)是初治肺結(jié)核患者耐藥的危險(xiǎn)因素，應(yīng)加以重視并注意耐藥篩查；rpoB基因突變對(duì)利福平耐藥的診斷價(jià)值較高，但katG/inhA基因突變對(duì)異煙肼耐藥的診斷價(jià)值一般，雙通道PCR、結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)、結(jié)核抗體三項(xiàng)對(duì)初治肺結(jié)核患者耐藥的診斷價(jià)值亦一般，需結(jié)合地區(qū)耐藥結(jié)核病流行規(guī)律選擇應(yīng)用；但本研究為單中心研究且樣本量有限、部分患者信息不完整，存在一定選擇偏倚，結(jié)論仍需擴(kuò)大樣本量、采用規(guī)范化的樣本處理方案等進(jìn)一步證實(shí)。

作者貢獻(xiàn)：楊芳負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)處理、分析、撰寫論文；張磊負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)與實(shí)施、質(zhì)量監(jiān)督、審校。

本文無(wú)利益沖突。