鮮牛奶中黃曲霉毒素M1檢測(cè)的幾種方法及控制措施

徐 琳

(黑龍江省杜爾伯特蒙古族自治縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,黑龍江 大慶 166200)

1 理化性質(zhì)

黃曲霉毒素M1(AFM1)是黃曲霉毒素B1(AFB1)的羥基化衍生物，二呋喃環(huán)的氧雜萘鄰?fù)鳛槠浠窘Y(jié)構(gòu)，分子式為C17H12O7，相對(duì)分子量為328Da，熔點(diǎn)可高達(dá)299℃。AFM1是一種無(wú)色的長(zhǎng)方形片狀結(jié)晶，在365 nm紫外光照射下會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)紫色熒光，其在極性有機(jī)溶劑中容易溶解，但在非極性溶劑(如乙醚、石油醚和正己烷等)中無(wú)法溶解。該毒素具有極強(qiáng)的耐熱性，只有在溫度達(dá)到299℃是才會(huì)被破壞，因此牛奶中所含的AFM1經(jīng)過(guò)常規(guī)烹調(diào)溫度、超高溫滅菌或者巴氏消毒后基本上不會(huì)被破壞。AFM1在部分化學(xué)試劑(如丙酮和次氯酸鈉)作用下可完全被分解，因此常用于對(duì)污染過(guò)AFM1的材料或者容器進(jìn)行解毒。

2 檢測(cè)方法

免疫親和柱法。原理是對(duì)檢測(cè)樣品先進(jìn)行離心、脫脂、過(guò)濾處理，接著使用免疫親和柱對(duì)濾液進(jìn)行層析凈化，將所含雜質(zhì)除去后再來(lái)洗脫AFM1，之后通過(guò)熒光光度法對(duì)AFM1進(jìn)行定量。樣品預(yù)處理，即取50 mL液體牛奶和牛乳制品放入離心管中，添加氯化鈉1 g，溶解后以4000 r/min的速度進(jìn)行10 min離心，上層為脂肪層，移取下層液體，經(jīng)過(guò)玻璃纖維濾紙過(guò)濾后備用。柱凈化，即先連接玻璃注射器和免疫親和柱，準(zhǔn)確吸取10 mL之前處理好的澄清濾液加入，接著連接空氣壓力泵，通過(guò)壓力調(diào)節(jié)控制溶液以3～6 mL/min的速度流過(guò)免疫親和柱，直到柱體有2～3 mL空氣通過(guò)，之后加入10 mL 10%甲醇溶液對(duì)柱子進(jìn)行2次清洗，流出液體全部棄去，再準(zhǔn)確加入1 mL 80%甲醇溶液將已經(jīng)免疫結(jié)合在柱上的AFM1洗脫，注意此時(shí)調(diào)整流速變?yōu)?～2 mL/min，將洗脫液收集在干凈的玻璃試管中待檢。熒光光度檢測(cè)，先分別在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm和發(fā)射波長(zhǎng)450 nm下對(duì)熒光光度計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn)，綠色標(biāo)定管為0，紅色標(biāo)定管為2.0，黃色標(biāo)定管為1.0±0.2；接著在50 mLAFM1顯陰性的樣品中分別添加濃度為0、0.1 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L的AFM1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照以上分析步驟進(jìn)行分離純化，在濾過(guò)的洗脫液再分別添加1 mL 0.002%溴溶液和AFM1產(chǎn)生衍生物，放入熒光光度計(jì)中對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，由此繪制熒光強(qiáng)度和AFM1標(biāo)準(zhǔn)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；最后在待檢樣品洗脫液添加溴溶液衍生，對(duì)其熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中所含的AFM1。該檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)是凈化效果好、靈敏度高、特異性高等，同時(shí)樣品的前處理過(guò)程明顯簡(jiǎn)化，不需要使用AFM1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使操作者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能受到的潛在危害大幅度降低。但整個(gè)操作比較復(fù)雜、繁瑣，且容易出現(xiàn)浪費(fèi)試劑和環(huán)境污染的情況，導(dǎo)致在一定程度上限制該方法的應(yīng)用推廣。

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。原理是固定于酶標(biāo)板上的抗原和待檢樣品中所含的AFM1會(huì)特異性競(jìng)爭(zhēng)抗體，并在固相載體表面構(gòu)成抗原抗體復(fù)合物，將多余抗體成分洗去后添加酶標(biāo)Ⅱ抗，與抗體反應(yīng)，在酶的作用下促使顯色劑顯色，根據(jù)顯色深淺程度對(duì)樣品中所含的AFM1量進(jìn)行判斷。樣品處理，即取50 mL待檢牛奶樣品，先進(jìn)行降溫處理，直到溫度低于10℃，接著以3500 r/min的速度進(jìn)行10 min離心，之后用吸管吸去上層脂肪層，取下層牛奶液進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，先將抗AFM1抗體包被于微孔板上，置于4℃條件下進(jìn)行過(guò)夜處理，使其充分封閉；先在每孔中添加AFM1標(biāo)準(zhǔn)溶液或者樣品處理液，接著添加AFM1酶結(jié)合物，置于37℃下經(jīng)過(guò)30 min反應(yīng)；洗板后在每孔中分別添加酶基質(zhì)和顯色劑，置于37℃下進(jìn)行15 min顯色，通過(guò)目視法或者儀器法進(jìn)行測(cè)定；根據(jù)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并據(jù)此計(jì)算樣品中所含的AFM1量。該檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)、靈敏、快速、成本低等，儀器操作簡(jiǎn)單，使工作人員的勞動(dòng)量明顯減少，且待檢樣品無(wú)需經(jīng)過(guò)特殊處理，可直接進(jìn)行測(cè)定，在有大批樣品進(jìn)行檢測(cè)篩選使用，且在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí)也可選用。

3 控制措施

嚴(yán)格管理奶牛飼料。奶牛禁止飼喂發(fā)生霉變的飼料，因此在飼料生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、保存過(guò)程中要加強(qiáng)管理，避免收獲飼料原料時(shí)經(jīng)受雨淋，且經(jīng)過(guò)適當(dāng)曬干。合理控制青貯飼料質(zhì)量，防止腐敗，青貯飼料制作完成后要立即使用塑料薄膜覆蓋，盡可能使其密封。調(diào)控精飼料(如玉米、豆粕等)的含水量和溫度。確保飼料貯存條件良好，要求倉(cāng)庫(kù)干燥、陰涼，且適當(dāng)通風(fēng)，還要注意飼料四周要留有適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存空間。料倉(cāng)要定期進(jìn)行清潔，避免鼠咬和發(fā)生蟲(chóng)害等，尤其是倉(cāng)中全部腐敗變質(zhì)的飼料必須清理干凈。

加強(qiáng)檢驗(yàn)檢測(cè)。要求乳制品生產(chǎn)企業(yè)采取質(zhì)量安全責(zé)任，并根據(jù)相關(guān)法律法規(guī)進(jìn)行生鮮牛奶收購(gòu)，且必須對(duì)其黃曲霉毒素M1等各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。如果生鮮乳檢測(cè)不合格，要依法采取無(wú)害化處理。