DNA酶:篩選、生物傳感及展望

佟宗軒，胡沁沁，顧宏周

（復旦大學附屬中山醫(yī)院心血管疾病研究所,復旦大學生物醫(yī)學研究院,上海200032）

DNA酶又稱為脫氧核酶（Deoxyribozymes，DNAzymes），通常由一定長度（幾十個堿基）和特定序列的單鏈DNA通過折疊成某些二維和三維空間結(jié)構(gòu)而獲得催化功能.第一個DNA酶出現(xiàn)在1994年，Breaker等［1］利用指數(shù)富集的配體進化技術(shù)（SELEX），在試管內(nèi)首次獲得了可以在特定位點切割核糖核酸（RNA）的脫氧核糖核酸（DNA）序列［圖1（A）］，這項工作揭開了DNA酶的面紗.此后的系列研究發(fā)現(xiàn)，DNA酶可以像RNA酶（Ribozyme）和蛋白酶一樣高效催化DNA/RNA連接、DNA磷酸化、DNA腺苷化、DNA脫嘌呤化及狄爾斯-阿爾德反應等生化反應［2～6］.從化學的角度來看，DNA只比RNA少了1個2′-OH，其它化學官能團幾乎完全相同，因此DNA像RNA一樣具備多種催化功能.與RNA酶和蛋白酶相比，DNA酶具備一些天然的優(yōu)勢：因其構(gòu)成為DNA，故穩(wěn)定性極佳，且易于化學合成修飾、易于操作和儲存且制備成本低. 這些優(yōu)勢推動了其在生物傳感［7，8］、基因治療［9～11］和生物成像［12，13］等領域的發(fā)展與應用.盡管已有數(shù)十種DNA酶在試管內(nèi)進化分離出來，但迄今尚無很強的證據(jù)顯示DNA酶在自然界中也存在.

除了一類可催化RNA連接反應［14］和一類可催化RNA切割反應［15］的DNA酶的工作機理在原子精度上得到了闡釋之外，目前絕大多數(shù)DNA酶的工作機理尚未知，但DNA酶的催化方式有一定的共性.通常，DNA酶由非保守序列區(qū)和保守序列區(qū)兩部分組成，前者的主要功能是通過堿基互補配對識別并作用于底物，在這個過程中后者與底物之間的距離拉近并可通過進一步折疊形成特定結(jié)構(gòu)以催化底物特定位點上的反應.以切割RNA的第一個DNA酶為例［圖1（A）］［1］：兩端的堿基互補配對使得DNA酶與RNA底物序列間形成很好的識別和雜化，而酶上loop區(qū)的保守序列在Mg2+的幫助下折疊成特定的具有催化活性的結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)可與RNA底物上切割位點處的堿基發(fā)生二級和三級相互作用，激活RNA堿基上的2′-OH作為親核試劑攻擊鄰近磷酸二酯鍵上的5′-O，從而切斷RNA底物鏈上的磷酸二脂鍵.通過堿基互補配對識別底物的方式使DNA酶具有很強的可編程性，但同時也帶來了多重催化效率低下（與自然界存在的蛋白酶相比）的問題：在單個催化轉(zhuǎn)換（single-turnover）效率中，較強的雜化才能使DNA酶較好地識別底物，從而高效地完成single-turnover反應；但較強的雜化作用使反應完成的底物難以從DNA酶上脫落，成為阻止DNA酶繼續(xù)捕獲未反應的底物催化多重催化轉(zhuǎn)換（multiple-turnover）的障礙.最近，我們［16］發(fā)現(xiàn)可以通過簡單的升降溫來促進DNA酶與底物間的分離/結(jié)合，從而使DNA酶的multiple-turnover效率在體外提升至可以與蛋白酶的效率相媲美［圖1（B）］.盡管該升降溫的策略主要是在切割DNA的DNA酶上得以驗證，但理論上其應當可適用于提升絕大多數(shù)DNA酶的turnover效率.

Fig.1 Deoxyribozymes and the classical selection strategy to isolate them

目前，幾乎所有已知的DNA酶都是通過SELEX技術(shù)體外篩選分離獲得的，經(jīng)典的DNA酶的篩選策略主要由合成/制備文庫、與輔助因子共孵育、分離信號DNA序列及聚合酶鏈式反應（PCR）擴增再建庫等4個步驟的多輪次循環(huán)往復構(gòu)成［圖1（C）］.以切割RNA的DNA酶的篩選為例進行說明.首先，化學合成和制備含有隨機序列區(qū)、引物結(jié)合區(qū)及一個核糖核苷酸（rA）為假定切割位點的初始文庫.該文庫一般包含約1014～1015個DNA序列，文庫5′端修飾生物素標簽，可通過生物素-鏈霉親和素的相互作用錨定在固定相上.當輔助因子（如金屬離子、小分子和生物樣本等）與文庫共孵育時，如果某些DNA序列可以與輔因子相互作用折疊成活性結(jié)構(gòu)切割rA位點，則切割后其將從固定相中脫落釋放出來；而無活性未發(fā)生切割的DNA序列則仍保留在固定相上.切割脫落的DNA序列經(jīng)兩步PCR擴增后，重新引入rA切割位點和生物素標簽，用于生成次級文庫進行下一輪篩選.通常，上述循環(huán)過程需重復5～20輪，并可通過縮短孵育時間及降低輔助因子濃度等方式施加篩選進化的壓力.具有切割RNA活性的DNA序列逐步被富集，在文庫中所占比例也不斷升高，經(jīng)過測序和實驗驗證進而明確最優(yōu)的DNA酶的序列信息.

迄今，利用經(jīng)典的篩選策略已分離出多種DNA酶.隨著技術(shù)的進步和下游應用領域的需求不斷增加，DNA酶的篩選策略也在不斷發(fā)展和更新.本文將回顧近5～10年內(nèi)涌現(xiàn)出的篩選新策略及依托其分離出的新型DNA酶，重點闡述響應金屬離子、小分子及生物樣本（包括細菌、細胞或其提取物等）并切割RNA的DNA酶探針，并展望本領域現(xiàn)存的挑戰(zhàn)和發(fā)展方向.

1 催化多種生化反應的DNA酶

1.1 產(chǎn)物捕獲的篩選策略

早期發(fā)現(xiàn)的DNA酶大多作用于核酸底物，包括RNA 切割酶［1，17，18］、DNA 連接酶［19］、RNA連接酶［20，21］、DNA切割酶［22，23］及DNA磷酸化酶［24］等. 選擇核酸作為DNA酶作用底物的主要原因在于兩者屬于同一類材料，有利于核酸篩選文庫的構(gòu)建和核酸信號的擴增放大.近年來，研究人員更多地將目光投向蛋白質(zhì)/多肽的化學催化反應，通過設計新型篩選策略，分離出催化各類蛋白/多肽生化反應的DNA酶，為進一步拓展DNA酶的應用奠定了基礎.

通常，蛋白質(zhì)/多肽生化反應僅僅是化學基團增減的細小變化（如磷酸化、去磷酸化修飾等）.如何判斷DNA序列確實催化了這些生化反應，并有效地從文庫中分離出具有催化活性的DNA序列，是成功篩選可催化蛋白質(zhì)/多肽生化反應的DNA酶的關鍵.為此，Silverman等［25］開發(fā)了產(chǎn)物捕獲的篩選策略（PCS）：在每一輪篩選過程中，用額外的分子（如抗體或修飾的核酸等）與具有所需催化功能的DNA序列發(fā)生交聯(lián)反應或結(jié)合，將其捕獲，再通過簡單有效的凝膠電泳技術(shù)將其與無催化活性的DNA序列分離.運用PCS方法，已成功篩選出多種催化蛋白/多肽生化修飾反應的DNA酶.

2013年，Silverman等［26］報道了第一個具有酪氨酸激酶活性的DNA酶.該DNA酶以5′-三磷酸化RNA寡核苷酸（5′-pppRNA）為供體，可將γ-磷酸基團轉(zhuǎn)移到多肽鏈中酪氨酸的羥基上，使酪氨酸（Tyr）磷酸化（即變?yōu)閜Tyr）.在關鍵的捕獲步驟中，Silverman等使用固相抗pTyr抗體來分離每輪具有催化活性的DNA序列［圖2（A）］.與凝膠電泳等方法相比，固相抗體策略顯著縮短了篩選時間，且可實現(xiàn)多樣品的同時處理.在后續(xù)工作中，Silverman等［27］以不同的天然多肽序列為底物，利用固相抗體捕獲策略高效分離出一系列可催化特定多肽序列中酪氨酸磷酸化的DNA酶，這進一步驗證了該策略的普適性，并為開發(fā)針對生物樣本催化酪氨酸磷酸化的DNA酶掃清了障礙.

與磷酸化相對應，Silverman等［28］同時探索了DNA酶催化氨基酸的去磷酸化反應.在篩選過程中，首先構(gòu)建了包含隨機序列和偶聯(lián)六肽底物（AAASPAA）的核酸文庫，隨后采取產(chǎn)物捕獲策略，即通過5′-硫醇寡核苷酸與脫氫丙氨酸（Dha）發(fā)生邁克爾加成反應，增加有催化活性DNA序列的分子量，即可利用凝膠電泳將其與無催化活性的核酸序列進行有效分離［圖2（B）］，捕獲效率可達40%.研究結(jié)果表明，在Zn2+或Zn2+/Mn2+的輔助下，分離得到的DNA酶可有效去除磷酸化絲氨酸（pSer）中的磷酸基團，生成脫氫丙氨酸（Dha）.與催化氨基酸磷酸化的DNA酶一起，Silverman等的研究［26～28］為DNA酶在磷酸化蛋白質(zhì)組學方面的潛在應用打下了基礎.

蛋白質(zhì)/多肽的合成后再修飾對研究翻譯后修飾、監(jiān)測體內(nèi)的蛋白分布及評估抗體類藥物治療特性等研究至關重要.由于富含電子及在蛋白表面豐度低的特點，酪氨酸（Tyr）通常作為修飾研究的靶點.利用產(chǎn)物捕獲的篩選策略，Silverman等［29］分離出可在多肽鏈中的酪氨酸殘基上引入疊氮化修飾的DNA酶［圖2（C）］.該酶首先催化酪氨酸側(cè)鏈與2′-疊氮基-dATP之間的反應，形成磷酸二酯鍵；隨后，利用銅催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應（CuAAC）可將特定的修飾物聚乙烯醇［（PEG）或熒光標簽等］附加至疊氮基上，實現(xiàn)對酪氨酸的可檢測/可視化標記.篩選獲得的DNA酶DzAz2對YPR多肽序列具有選擇性，而DzAz8則無序列選擇性，可催化游離多肽上的酪氨酸疊氮化修飾.

高效催化蛋白質(zhì)中酰胺鍵的水解可為蛋白質(zhì)組學的研究提供有力的工具.早在2009年，Silverman等［30］就開始嘗試尋找可以水解酰胺鍵的DNA酶，但結(jié)果卻不盡如人意.基于此，Silverman等［31］對核苷酸進行蛋白質(zhì)樣功能團修飾并利用產(chǎn)物捕獲策略分離有催化活性的DNA序列.對文庫隨機序列中的胸腺嘧啶核苷進行修飾，使其攜帶氨基、羧基或羥基，以此模擬能水解蛋白質(zhì)酰胺鍵的天然蛋白酶；同時，利用5′-氨基寡核苷酸與催化酰胺鍵水解后的產(chǎn)物DNA序列發(fā)生共價交聯(lián)反應，將其捕獲分離［圖2（D）］.經(jīng)過如此改進后，他們分離出了多個可催化酰胺鍵水解的DNA酶，使反應速率提升了3個數(shù)量級.

綜上可見，近年來誕生的產(chǎn)物捕獲篩選策略豐富了DNA酶催化反應的種類，多種可催化蛋白質(zhì)/多肽生化反應的DNA酶的發(fā)現(xiàn)為圍繞蛋白質(zhì)的化學生物學的研究提供了潛在的分子工具.

Fig.2 The product?capturing strategy to isolate deoxyribozymes that catalyze reactions on proteins/peptides

1.2 依托環(huán)化酶、正負雙向及人工核酸的篩選策略

作為遺傳信息的攜帶者，DNA是極其穩(wěn)定的.從催化的角度來看，水解DNA的磷酸二酯鍵極具挑戰(zhàn)性；但從DNA編輯的角度，水解切割DNA的需求又非常高.一直以來，水解切割DNA是蛋白酶的專利，直到2009年Silverman等［30］發(fā)現(xiàn)DNA酶同樣可以水解切割DNA，才打破了蛋白酶的壟斷.

最近，本課題組［32］提出了一種基于環(huán)化酶（Circ Ligase）的高效篩選策略［圖3（A）］，根據(jù)該策略，分離出多個可特異水解切割DNA的DNA酶，它們在體外的反應速率可與蛋白酶相媲美.與其它固定切割位點的篩選策略不同，該方法允許DNA序列在DNA骨架上的任意位置發(fā)生水解斷裂，主要包括以下步驟：（1）通過搭橋延伸法構(gòu)建了包含5′-磷酸基團和2個50 nt隨機序列的線性單鏈DNA文庫（較長的序列可以賦予文庫更多的DNA二級結(jié)構(gòu)）；（2）使用環(huán)化酶將線性文庫連接成環(huán)，并用變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）膠分離環(huán)形連接產(chǎn)物，進一步用哌啶處理環(huán)化DNA，去除因DNA損傷發(fā)生的自切割DNA序列，降低篩選過程中的背景信號；（3）將環(huán)狀DNA文庫在含輔助因子（Zn2+）的篩選緩沖液中孵育，并用變性PAGE膠分離出因切割導致斷裂的線性DNA；（4）再次使用環(huán)化酶將線性DNA切割產(chǎn)物連接成環(huán)（環(huán)化酶只能識別并環(huán)化連接含5′-磷酸基團和3′-羥基的DNA序列，因此只有水解切割磷酸二酯鍵的DNA序列能被連接成環(huán)，而因氧化損傷等導致斷裂成線性的DNA序列則無法成環(huán)；此外，環(huán)化酶催化的DNA連接無需搭橋序列的幫助，是在切割位點未預先設定的DNA底物被切割后能再次被連接成環(huán)的關鍵）；（5）通過PCR擴增上一步中的環(huán)形DNA序列，為建立次級文庫作準備.經(jīng)過上述步驟的多輪重復篩選，最終分離出2類可感應Zn2+并快速水解DNA的DNA酶，其中I類酶的催化核心區(qū)域僅為15個保守的堿基，在體外的反應速率（kobs）可達到1～3 min-1.目前，這些酶已被用于單鏈DNA ladder的開發(fā)［33］和單鏈DNA序列的生物法制備［34］.

Fig.3 Strategies to isolate deoxyribozymes that catalyze reactions on nucleic acids

N6-腺苷酸甲基化（m6A）是生物體內(nèi)最廣泛的RNA修飾之一，準確區(qū)分特定RNA位點的甲基化修飾意義重大.2018年，Sednev等［35］報道了一類可特異識別m6A修飾并切割RNA的DNA酶，該DNA酶具有檢測特定RNA序列中的甲基化率的潛力.為了獲得識別m6A修飾的特異性，他們采用了雙向篩選策略［圖3（B）］，以含有m6A修飾的RNA（R1）為底物進行正向篩選，以無修飾的RNA（R2）為對照進行負向篩選，通過消除識別未修飾RNA并切割的DNA序列來保證篩選的特異性｛［圖3（B）］中紅色順時針方向｝；同時，如果以R2為底物進行正向篩選，以R1為對照進行負向篩選，則可獲得特異識別未被m6A修飾的RNA并將其切割的DNA酶｛［圖3（B）］中綠色逆時針方向｝.理論上，這種雙向的篩選策略可被進一步推廣，用于開發(fā)可特異識別轉(zhuǎn)錄組中其它RNA修飾的DNA酶.

除了常規(guī)DNA外，人工合成核酸（XNA）也具有催化活性［36，37］.Holliger等［38］率先提出X-SELEX策略，即指數(shù)放大的交叉化學選擇性富集技術(shù)（Cross-chemistry Selective Enrichment by Exponential Amplification），用于開發(fā)人工合成核酸酶（XNAzymes）［圖3（C）］.X-SELEX的第一步是構(gòu)建XNA文庫（約1014個不同分子），以含有隨機序列的DNA文庫為模板，同時雜交偶聯(lián)短的DNA，RNA或XNA，在XNA聚合酶作用下延伸出與DNA模板互補的XNA序列（DNA/XNA雙鏈形式）；第二步，利用生物素/親和素強相互作用，分離獲得單鏈的XNA文庫；第三步，將XNA文庫置于篩選環(huán)境中一段時間后，通過變性PAGE膠回收有催化活性的XNA序列；第四步，利用反轉(zhuǎn)錄酶獲得與XNA序列互補的互補脫氧核糖核酸（cDNA）；第五步，以cDNA為模板，PCR擴增放大信號成次級DNA文庫，為下一輪篩選作好準備.采用X-SELEX篩選策略，Taylor等［39］發(fā)現(xiàn)了具有RNA內(nèi)切酶、連接酶和XNA-XNA連接酶活性的人工合成核酸酶；Chaput等［40，41］分離出具有切割RNA活性的核酸酶.X-SELEX篩選策略極大地豐富了人工合成核酸酶的種類.由于XNA不能很好地被天然的脫氧核糖核酸酶（DNase）識別，在生物環(huán)境中具備更好的穩(wěn)定性，因此可能在潛在的體內(nèi)應用中擁有一定的優(yōu)勢.

2 切割核酸的工具型DNA酶傳感器

2.1 特定金屬離子作為配體

自DNA酶問世以來，在二十多年的發(fā)展歷史中，催化切割RNA的DNA酶（RNA-cleaving deoxyribozymes）一直占據(jù)重要地位，是研究最多的一類DNA酶.DNA酶催化RNA的切割需要輔因子（特別是金屬離子）的參與，一系列響應不同金屬離子（主要是二價態(tài)）或小分子的切割RNA的DNA酶［42，43］，包括響應 Pb2+［44］，Ca2+［45］，Cd2+［46］，Zn2+［47］，F(xiàn)e2+［48］，UO22+［49］及鑭系金屬［50～52］等，已被分離出來. 近年來，隨著篩選策略的不斷優(yōu)化，一些新的響應不同價態(tài)金屬離子的切割RNA的DNA酶陸續(xù)被發(fā)現(xiàn).

在篩選過程中，增加對有催化活性DNA序列的分離純化步驟，即多步分離，可提高篩選效率，縮短篩選輪數(shù).通常，對切割RNA的DNA酶的輔因子選擇多為二價金屬離子.而一價金屬離子（如Na+），由于其中和DNA骨架上負電荷的能力遠小于二價金屬離子如Mg2+，因此較難輔助DNA序列折疊成具有催化活性的二級結(jié)構(gòu)，這對體外篩選響應一價金屬離子的DNA酶探針提出了挑戰(zhàn).2015年，Lu等［53］采用兩步分離純化策略，篩選出了Na+依賴的RNA切割DNA酶探針.先將響應Na+并發(fā)生切割RNA底物的DNA序列從固定相上洗脫下來，再用變性PAGE膠對切割下來的DNA信號進行二次純化分離［圖4（A）］.在起始核酸文庫中，有催化活性的DNA序列比例遠遠小于無活性的DNA序列.因此，增加的膠純化步驟可以有效去除從固相柱上非特異性洗脫下來的、未切割的DNA序列，從而降低背景噪音、提高篩選效率.篩選出的DNA酶探針NaA43ES展現(xiàn)出高于其它離子104倍的選擇性和良好的檢測靈敏度（檢測限為135 μmol/L），為細胞內(nèi)Na+的監(jiān)測成像提供了新方法.Liu等［54］采用類似方法開發(fā)了可以在有機相（乙醇和二甲基亞砜）中感應Na+并切割RNA的DNA酶EtNa.這一系列的研究工作大大拓展了DNA酶的應用范圍.

將DNA酶中的保守序列部分進行部分退化后再篩選，可進化出更特異、更活潑的突變體.Ag10C是一類采用經(jīng)典的篩選策略獲得的響應Ag+并切割RNA的DNA酶［55］，其催化速率為0.41 min-1.對Ag10C的催化原理進行深入研究后發(fā)現(xiàn)，Ag10C可以同時結(jié)合2個Ag+，且其對Ag+的選擇性不是很高，當Na+存在且濃度升高時可顯著提高Ag10C的催化活性［56］.在對Ag10C保守序列區(qū)域的19個堿基實施部分退化（單個嘌呤由100%退化成50%的鳥嘌呤和50%的腺嘌呤，單個嘧啶由100%退化成50%的胸腺嘧啶和50%的胞嘧啶）并進行重篩選后［圖4（B）］，獲得的突變體AgB1具有較小的催化結(jié)構(gòu)域；與Ag10C相比，AgB1的催化活性提高了200%，并且對Ag+展現(xiàn)出更顯著的選擇性［57］.

Fig.4 Optimizing strategies to select the metal?ion?dependent RNA?cleaving deoxyribozymes

在核酸文庫中引入修飾的核苷酸序列可增加篩選的成功率和篩選出的DNA酶的化學多樣性，這一策略在篩選切割RNA的DNA酶中多次被使用.在切割位點rA堿基處引入硫代修飾，有利于將親硫的金屬離子招募到rA的磷酸二酯鍵附近，提高篩選成功率［圖4（C）］.基于該方案已分離出特異響應Cu2+并切割RNA的DNA酶PSCu10［58］，該DNA酶的催化區(qū)域只含有8個堿基，切割速率可達0.1 min-1.為了避免篩選到Ce13d這類特異性差的核酸酶（一類可被包括Cu2+在內(nèi)所有親硫的金屬離子激活的DNA酶），在每一輪的篩選步驟中可通過添加與Ce13d保守區(qū)域互補雜交的DNA片段，封閉掉潛在的Ce13d序列的催化活性，從而將其從文庫中去除.采用類似的篩選方法也分離得到了特異響應Cr3+和Cr4+并切割RNA的DNA酶［59］.

此外，在RNA堿基切割位點處進行咪唑和羧基修飾，也可以為金屬離子提供更多的結(jié)合位點［圖4（D）］.根據(jù)該策略分離得到的識別Zn2+的切割RNA的DNA酶可結(jié)合多達3個Zn2+，并且對Zn2+的特異感應性隨著結(jié)合Zn2+數(shù)目的增多而增強：結(jié)合1，2和3個Zn2+的DNA酶對Co2+的選擇性分別提高了20，1000和5000倍［60］.

除了在切割位點處引入修飾外，在隨機序列區(qū)引入含修飾的堿基也是常用的一種手段.進行PCR擴增時可在一定程度上引入8-組胺化脫氧腺苷5′-三磷酸（dAimTP）、5-氨基烯丙基脫氧胞苷5′-三磷酸（dCaaTP）和5-胍基烯丙基脫氧尿嘧啶核苷三磷酸（dUgaTP）等修飾過的堿基，生成的含有多個修飾的文庫可用來篩選可降解全RNA序列的DNA酶Dz7-38-32［圖4（E）］［61］，該酶在低鎂離子（0.5 mmol/L）生理條件下的催化效率可達106L·mol-1·min-1.

由此可見，通過優(yōu)化篩選策略，如多步純化信號DNA序列、對已有的DNA酶退化再進化及引入適當?shù)幕瘜W修飾等，可全面提升DNA酶的特異性、靈敏度、活性及催化種類，并為圍繞其進行生物傳感方面的研究提供必要的支撐.

Fig.5 Cancelling strategies for the selection of deoxyribozymes that specifically target a biological sample[64]

2.2 對沖抵消的策略:篩選感應特定生物樣本的DNA酶傳感器

選擇某一特定的、明確的離子或分子作為輔助因子進行RNA切割型的DNA酶的篩選策略已經(jīng)相對成熟，其中的一部分DNA酶已被進一步編輯，用來作為檢測某些生物和化學樣本中相應離子或分子的探針.但一些重大惡性疾病的生物樣本中（如細菌、細胞的分泌物或胞內(nèi)提取物等）待檢測的目標分子的身份可能是不明確的（如三陰性乳腺癌的亞型繁多，缺乏標志物），對于這類樣本能否做到特異性檢測是一個極具挑戰(zhàn)性的難題.

近十年來，可催化切割RNA的DNA酶作為一個易操作且易編輯的工具，為解決特異識別靶標不明確的生物樣本檢測的難題提供了高效的解決方案.Li等［62］首創(chuàng)了一種對沖抵消的篩選策略.以細菌為例，根據(jù)該篩選策略［63，64］，首先各自收集菌株（目標菌株及參照物菌株）的未純化的粗提代謝混合物（CEM），以CEM為篩選對象確保所篩DNA酶探針在復雜生物樣品環(huán)境中仍具備催化活性；其次，該篩選策略采用兩步篩選法來保證DNA酶探針識別的特異性（圖5）：（1）負向篩選（Counter selection），即核酸文庫與非目標菌株的CEM共孵育，去除發(fā)生RNA切割的DNA序列，保留未切割序列進入下一步；（2）正向篩選（Positive selection），分離與目標菌株CEM共孵育后發(fā)生切割的DNA序列，利用PCR放大信號進入下一步.這種對沖抵消篩選策略的優(yōu)勢在于無需預先知道靶標分子身份即可獲得特異感應目標菌株（代謝物）的DNA酶探針；此外，負向篩選可確保去除目標菌株CEM中的非獨有成分對DNA酶切割響應，即通過篩選本身來保證DNA酶探針的特異性.

2011年，Li等［65］采用對沖抵消篩選策略首次獲得了特異感應大腸桿菌（E.coliK12）的DNA酶探針RFD-EC1.在篩選過程中，以枯草芽孢桿菌CEM作為對照進行負向篩選，以大腸桿菌CEM（E.coliK12）為研究對象進行正向篩選，從而保證DNA酶探針的特異性.同時，通過在切割位點（rA）兩側(cè)的T堿基引入一對熒光基團和猝滅基團，可實現(xiàn)每一輪篩選切割信號的可視化.Li等［66］還采用相同策略獲得了特異感應艱難梭狀芽胞桿菌BI/027-H菌株的DNA酶探針RFD-CD1；同時，結(jié)合分子篩技術(shù)和生信分析等手段，與RFD-CD1探針特異相互作用的分子被發(fā)現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄因子TcdC截短突變體.該研究表明，在靶標分子未知情況下，采取對沖抵消篩選策略不僅可以獲得特異識別BI/027-H菌株的DNA酶探針，還可以利用所篩探針進一步明確其響應的靶標分子身份.對沖抵消的篩選策略也被用于篩選特異識別水生鰻弧菌CEM的DNA酶VAE-2［67］，基于VAE-2再編輯成的熒光生物傳感器可檢測低至4000 cfu/mL的信號，適用于魚肉組織和飲水樣品中鰻弧菌的檢測.

在哺乳類細胞水平上，對沖抵消篩選策略也獲得了成功.Li等［68］以正常乳腺細胞MCF-10A的裂解液為對照進行負向篩選，以三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231裂解液為目標進行正向篩選，獲得了特異響應MDA-MB-231細胞裂解液并在RNA位點發(fā)生切割的DNA酶RFD-AAI2-5.該探針能有效區(qū)分MDA-MB-231細胞與正常乳腺細胞及其它亞型乳腺癌細胞，檢測限低至約5000 cell/mL.在進一步對反應緩沖液的pH值、輔助因子種類和濃度及DNA序列的有效長度進行優(yōu)化后，該探針的檢測限提高至約2000 cell/mL，且能從3種正常細胞和10種腫瘤細胞中特異識別出MDA-MB-231細胞［69］.

除了乳腺癌細胞外，對沖抵消策略也被用于慢性髓細胞性白血病細胞K562的DNA酶探針的篩選［70］，分離獲得的探針RFD-A1-3可高特異性識別該細胞，圍繞此探針可建立一種簡單快速、用于早期臨床診斷分析慢性髓細胞性白血病的方法.該方法可有效區(qū)分K562胞外分泌物與其它白血病亞型細胞、腫瘤細胞系，檢測限低至10 nmol/L，且適用于含人血清的復雜環(huán)境.

上述研究表明，在靶標未知情況下，利用對沖抵消策略可篩選獲得特異識別生物樣本（如細菌和細胞等）并在RNA位點發(fā)生切割的DNA酶探針，其易于與化學發(fā)光相結(jié)合及放大檢測信號的特點有望為致病菌和重大惡性腫瘤的臨床診斷提供便利和解決方案.

2.3 DNA酶在活細胞中的檢測和智能化應用

除了Lu等［53］開發(fā)的感應Na+的DNA酶探針用于細胞內(nèi)Na+的監(jiān)測成像外，近年來，已有多個DNA酶探針被開發(fā)并應用于活細胞內(nèi)特定信號的檢測放大和活細胞內(nèi)藥物分子的智能釋放.由于DNA酶探針極強的可編輯及可修飾性，它們已被證明可非常方便地與納米顆粒融合在一起，從而提升被特定細胞攝取的效率.2017年，Zhao等［71，72］報道了可利用氧化錳（MnO2）納米紙片攜帶感應錳離子（Mn2+）的DNA酶探針在活細胞內(nèi)監(jiān)測放大DNA堿基缺失修復的信號和活細胞中端粒酶的信號.MnO2納米紙片不僅作為DNA酶探針的載體，在進入活細胞后，其可被還原成Mn2+，從而觸發(fā)DNA酶探針的切割；待檢測的細胞內(nèi)信號分子，如DNA堿基缺失修復酶和端粒酶等，被設計成與MnO2還原為Mn2+直接關聯(lián)，因此DNA酶探針在活細胞內(nèi)的切割信號就可以反映待檢測的胞內(nèi)分子的水平.2019年，Wang等［73］報道了利用氧化鋅（ZnO）納米顆粒攜帶感應鋅離子Zn2+的DNA酶探針和多柔比星（Dox）藥物分子用于對癌細胞智能化的釋放藥物.DNA酶在活細胞中的檢測和智能化應用剛剛開端，極有可能是下一個5～10年的研究熱點.

3 總結(jié)與展望

近年來，針對DNA酶的篩選策略不斷發(fā)展和完善，新發(fā)現(xiàn)的DNA酶的種類越來越豐富，特異性和靈敏度都在提升，這也促進了DNA酶作為一種生物型檢測工具的應用.但DNA酶的篩選過程仍然比較繁瑣且耗時，如何借助微流控等微納技術(shù)實現(xiàn)DNA酶的高通量和自動化篩選，如何縮短開發(fā)DNA酶的時間和人力成本，是未來需要解決的問題.目前，DNA酶已在生物傳感和基因治療等領域嶄露頭角，未來也很可能會進一步在生物醫(yī)療領域大放異彩.在臨床上發(fā)揮作用之前，DNA酶還需突破包括器官、組織和細胞等在內(nèi)的重重障礙；如何有效遞送DNA酶并使之在體內(nèi)發(fā)揮等同于體外的功能，并能同時抵抗生理環(huán)境中DNase的降解，是推進DNA酶應用需解決的另一問題.解析DNA酶的晶體結(jié)構(gòu)有助于科學家們更好地理解其功能，并設計合理的篩選策略開發(fā)新的DNA酶.當前，已有2個DNA酶的晶體結(jié)構(gòu)被成功解析［14，15］.伴隨著結(jié)構(gòu)生物學的迅猛發(fā)展，相信越來越多的DNA酶將會在原子/分子水平上得到解析，人類對于DNA酶的了解、掌握和應用必將越來越深入.