大腸桿菌毒力因子及耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

赫鳴睿

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

大腸埃希氏菌(Escherichia coli)通常被稱(chēng)為大腸桿菌，是德國(guó)科學(xué)家Theodor Escherich于1885年發(fā)現(xiàn)，在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，被認(rèn)為是腸道內(nèi)微生物的正常組成部分，而且是不引起致病作用的[1]。直到20世紀(jì)中期，科學(xué)家才發(fā)現(xiàn)有一部分血清型比較特殊的大腸桿菌可以對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生致病性，這類(lèi)大腸桿菌常引起幼齡動(dòng)物發(fā)生嚴(yán)重腹瀉和敗血癥等疾病?，F(xiàn)在根據(jù)不同的生物學(xué)特性將致病性大腸桿菌主要分成6類(lèi)：腸致病性大腸桿菌(EPEC)、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸黏附性大腸桿菌(EAEC)和彌散黏附性大腸桿菌(DAEC)。這些可致病的大腸桿菌能夠在不引起動(dòng)物發(fā)病的情況下，長(zhǎng)期生活在健康動(dòng)物的腸道內(nèi)，并且這類(lèi)具有致病性的大腸桿菌還能在不同種動(dòng)物之間進(jìn)行傳播，給我國(guó)的畜牧業(yè)發(fā)展帶來(lái)巨大威脅[2]。

1 大腸桿菌毒力因子研究進(jìn)展

1.1 黏附素

大腸桿菌侵入動(dòng)物體內(nèi)后，首先要保證菌體在宿主體內(nèi)定植，這樣才可以有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，大腸桿菌的黏附作用是作為其腸道內(nèi)生存的必備定植條件。因此稱(chēng)這種起到黏附作用的菌體成分為定植因子也叫作黏附素。黏附素是分布在菌體表面的一種結(jié)構(gòu)成分，這些表面結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類(lèi)眾多，不同的黏附素對(duì)腸表面細(xì)胞黏附作用程度也不同。大腸桿菌利用其特殊的黏附素緊密附著在在腸上皮細(xì)胞表面，以免受到腸蠕動(dòng)而脫落。根據(jù)黏附素的形態(tài)結(jié)構(gòu)差異一般分為菌毛黏附素和非菌毛黏附素兩種。菌毛黏附素包括I型菌毛黏附素、P菌毛黏附素和卷曲菌毛黏附素；非菌毛黏附素包括菌體表面蛋白、血凝素、纖毛樣物質(zhì)等。由于每種菌毛黏附素只能黏附于具有相應(yīng)受體的細(xì)胞表面，所以細(xì)菌的黏附具有細(xì)胞特異性和宿主特異性。例如，含F(xiàn)4菌毛的大腸桿菌只定植于宿主的小腸前段，含F(xiàn)5菌毛的大腸桿菌則可以定植于空腸、回腸段。

1.2 腸毒素

大腸桿菌腸毒素是一種細(xì)菌外毒素，是由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中在菌體內(nèi)產(chǎn)生的，并且可以釋放到菌體外。根據(jù)腸毒素對(duì)高溫條件的不同耐受程度分為兩類(lèi)，一類(lèi)為耐熱型腸毒素(ST)，另一類(lèi)為不耐熱腸毒素(LT)。ST是由18～19個(gè)氨基酸形成的一種多肽小分子， ST是細(xì)菌外毒素，具有和其他細(xì)菌外毒素一樣的活性，可以對(duì)動(dòng)物腸道產(chǎn)生毒性，由于ST分子量小且基本沒(méi)有免疫原性，所以對(duì)ST的研究程度較低。LT是由一個(gè)A亞單位和5個(gè)B亞單位組合構(gòu)成的大分子。與ST不同，LT具有良好的免疫原性，因此LT在預(yù)防動(dòng)物疾病方面受到廣泛研究。

1.2.1 耐熱腸毒素(ST)

ST在100 ℃加熱30 min都不會(huì)失活。ST蛋白的分子量約在2 Kda左右，一個(gè)ST分子具有3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，二硫鍵是保證ST分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要因素，原因是二硫鍵有較高的鍵能。ST不僅耐熱，還耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿和多種有機(jī)溶劑。研究表明通過(guò)特殊方法處理可以使ST表現(xiàn)出免疫原性。J.C.Frantz報(bào)道稱(chēng)，將ST與載體蛋白相連，再加入弗氏佐劑后，作為疫苗對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫可使動(dòng)物產(chǎn)生高水平的抗ST抗體，這對(duì)易感動(dòng)物抵抗ETEC感染具有良好的效果。

1.2.2 不耐熱腸毒素(LT)

LT在65℃溫度下加熱30min就能夠完全滅活，LT具有很好地免疫原性，是由于LT中的B亞單位這一特殊結(jié)構(gòu)，不僅LT具有免疫原性，單獨(dú)的B亞單位自身也具有良好的免疫原性。這使得LT在作為黏膜免疫原，以及黏膜免疫佐劑這兩項(xiàng)研究方面得到極大重視。研究發(fā)現(xiàn)可以把無(wú)毒LT或者單獨(dú)B亞單位作為黏膜免疫原，也可以將LT作為黏膜免疫佐劑，與其他免疫蛋白一同進(jìn)行免疫，都能夠有效刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

1.3 HPI毒力島

HPI又稱(chēng)強(qiáng)毒力島，在大腸桿菌致病過(guò)程中發(fā)揮很大的作用，HPI首次發(fā)現(xiàn)于耶爾森菌屬，之后在其他腸道致病菌的染色體中也檢測(cè)出HPI毒力島。在HPI毒力島中，有一個(gè)被稱(chēng)作irp2-fyuA的基因簇，它是由irp2-irp1-irp3-irp4-irp5-fyuA這5段基因聯(lián)合組成的，被認(rèn)為是HPI的核心功能區(qū)，其中irp2基因與鐵調(diào)節(jié)蛋白有很大關(guān)系。irp2和fyuA是HPI中非常重要的兩個(gè)功能基因，用于檢測(cè)大腸桿菌基因組中是否存在HPI毒力島的標(biāo)志基因。

1.4 LEE毒力島

LEE稱(chēng)為致病性腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)毒力島，它發(fā)現(xiàn)于腸致病性大腸桿菌(EPEC)的染色體中，EPEC在入侵機(jī)體后，首先會(huì)黏附在宿主細(xì)胞表面部位，之后對(duì)宿主組織造成嚴(yán)重病理?yè)p傷，這種損傷叫作黏附與脫落(A/E)。eaeA和ler是LEE毒力島中最重要的兩個(gè)功能基因。在所有能夠?qū)е翧/E損傷的大腸桿菌全基因組中，都能檢測(cè)到eaeA基因。

2 大腸桿菌耐藥機(jī)制

有研究顯示，大腸桿菌極非常容易產(chǎn)生耐藥性，而且各類(lèi)耐藥菌株其耐藥譜廣泛，菌株變異速度增加，導(dǎo)致現(xiàn)在臨床常用的抗生素治療效果不佳甚至無(wú)效。常清利等報(bào)道[3]，對(duì)河南部分地區(qū)分離得到的215株大腸桿菌進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，其中，對(duì)氨芐西林的耐藥率最高，可以達(dá)到84.8%，對(duì)慶大霉素、阿莫西林、頭孢呋辛等也高達(dá)70%左右的耐藥率。方雨玲等報(bào)道[4]，對(duì)湖北地區(qū)231株大腸桿菌臨床分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其中，大腸桿菌對(duì)強(qiáng)力霉素、氨芐青霉素、卡那霉素等藥物具有較高耐藥性，對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物已經(jīng)完全耐藥。目前多重耐藥株十分普遍，這使得臨床使用抗生素治療大腸桿菌病的困難加大，細(xì)菌性疾病嚴(yán)重影響畜禽的生產(chǎn)性能，所以必須要加強(qiáng)畜牧業(yè)生產(chǎn)中對(duì)抗生素使用的管制措施。

2.1 大腸桿菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制

葉酸對(duì)蛋白質(zhì)、核酸的合成及各種氨基酸的代謝具有重要作用，缺乏葉酸可使細(xì)菌由于代謝功能紊亂而造成死亡?；前奉?lèi)藥物結(jié)構(gòu)與對(duì)氨基苯甲酸結(jié)構(gòu)相似，當(dāng)前者濃度在菌體內(nèi)遠(yuǎn)大于后者時(shí)，可在二氫葉酸合成中取代對(duì)氨基苯甲酸的位置而阻斷二氫葉酸的合成，這導(dǎo)致大腸桿菌的葉酸合成受阻造成細(xì)菌死亡。之所以革蘭氏陰性菌能夠產(chǎn)生耐藥性，主要與sul 1、sul 2和sul 3這三種耐藥基因有關(guān)，這三種耐藥基因的主要作用就是編碼二氫葉酸合成酶的蛋白結(jié)構(gòu)，使其能夠不受磺胺類(lèi)藥物的干擾與正常的對(duì)氨基苯甲酸結(jié)合，產(chǎn)生二氫葉酸，從而介導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[5-6]。研究顯示，sul族類(lèi)基因能夠定位在Tn21家族的轉(zhuǎn)座子中，同時(shí)與其他一些耐藥基因連接導(dǎo)致耐藥性[7]。

2.2 大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制

大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥機(jī)制主要有兩種方式，一是主動(dòng)外排泵，二是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺水解酶，其中最主要的機(jī)制是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺水解酶。這種酶能夠水解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，破壞抗生素的分子結(jié)構(gòu)，使其不能發(fā)揮作用。

2.3 大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制

大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物有三種耐藥機(jī)制，一是改變細(xì)胞壁的通透性，這使得少量藥物能進(jìn)入菌體，無(wú)法達(dá)到足夠殺滅病原體的藥量，導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)耐藥；二是改變作用靶位點(diǎn)，氨基糖苷類(lèi)藥物的結(jié)合位點(diǎn)在細(xì)菌30S核糖體亞單位的16S rRNA解碼區(qū)的A部位，影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，大腸桿菌能夠使16S rRNA發(fā)生甲基化，從而改變解碼區(qū)A部位的結(jié)構(gòu)和位置，使得氨基糖苷類(lèi)藥物不能結(jié)合作用位點(diǎn)而失去效果；三是氨基糖苷類(lèi)鈍化酶的產(chǎn)生[8-9]，產(chǎn)生鈍化酶是細(xì)菌最主要的耐藥機(jī)制，細(xì)菌可以產(chǎn)生3種鈍化酶，分別是氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶；氨基糖苷核苷轉(zhuǎn)移酶；氨基糖苷乙酞轉(zhuǎn)移酶，經(jīng)過(guò)鈍化酶對(duì)抗生素的修飾和水解作用破壞氨基糖苷類(lèi)藥物活性[9]。

2.4 大腸桿菌對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制

大腸桿菌對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制為主動(dòng)外排作用。大腸桿菌基因組中含有tet外排泵基因，它能夠編碼一種大小為46 ku的膜結(jié)合外排泵蛋白，該蛋白是外排系統(tǒng)的主要功能蛋白，外排系統(tǒng)將擴(kuò)散進(jìn)細(xì)菌中的抗菌藥物泵出菌體外，導(dǎo)致大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性。

2.5 大腸桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制

喹諾酮類(lèi)藥物作用于細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶，進(jìn)而阻斷細(xì)菌DNA復(fù)制，引起細(xì)菌死亡。大腸桿菌基因突變導(dǎo)致DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶的結(jié)構(gòu)和功能也發(fā)生改變，還會(huì)改變藥物作用的靶位點(diǎn)，使喹諾酮類(lèi)藥物不能結(jié)合DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶，就不會(huì)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)起到抑制作用。

3 小結(jié)

預(yù)防家畜發(fā)生大腸桿菌病，首先要加強(qiáng)環(huán)境的管理工作，及時(shí)清理畜舍糞便、做好消毒工作、保持通風(fēng)、維持舍內(nèi)溫度，確保飼養(yǎng)舍干燥與清潔?，F(xiàn)在已開(kāi)發(fā)出眾多可用于治療家畜大腸桿菌病的商品抗體。其中，商品化雞卵黃抗體因其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、易規(guī)模化生產(chǎn)等特點(diǎn)充分凸顯其應(yīng)用價(jià)值而備受養(yǎng)殖戶(hù)歡迎，研究表明雞卵黃抗體對(duì)于家畜大腸桿菌病有很高的治愈率。大腸桿菌自家滅活疫苗用于預(yù)防本場(chǎng)常年流行的大腸桿菌病效果顯著，因?yàn)檫@是用本場(chǎng)中引起發(fā)病的大腸桿菌株制備的滅活疫苗，具有安全性高、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，而且制苗菌株的抗原性和發(fā)病菌株的抗原性高度一致，可以發(fā)揮良好的保護(hù)作用。養(yǎng)殖戶(hù)必須及時(shí)做好疫苗免疫工作，一方面做好流動(dòng)人員的防護(hù)和消毒工作，防止外源性致病菌的侵入，另一方面要經(jīng)常觀察家畜狀態(tài)，提供家畜新鮮的水源和飼料，保持家畜的機(jī)體健康，不要給內(nèi)源性病原大量繁殖提供便利，全面做到以上工作才能降低養(yǎng)殖場(chǎng)中大腸桿菌病的發(fā)病率，為養(yǎng)殖場(chǎng)創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益。