人類Argonaute基因家族與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展*

張成晨，劉莉娟，李 楠，郭秀麗，章夢琦綜述，肖 娟，翟立紅審校（湖北文理學(xué)院，湖北襄陽441053）

Argonaute（AGO）蛋白通過結(jié)合小RNAs來調(diào)控蛋白質(zhì)的合成或影響mRNA的穩(wěn)定性即RNA干擾（RNAi）。AGO蛋白家族是 RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的核心蛋白，在RNAi中發(fā)揮重要作用，參與染色質(zhì)修飾，靶向mRNA斷裂、翻譯抑制，從而產(chǎn)生特異性基因沉默作用[1]，并與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。AGO蛋白家族是一類高度保守的堿性蛋白，分為AGO亞家族（包括AGO 1～4）和PIWIL亞家族（包括PIWIL 1～4），其典型特征為N端的PAZ結(jié)構(gòu)域、Mid結(jié)構(gòu)域和C末端的PIWI結(jié)構(gòu)域[2]。PAZ結(jié)構(gòu)域和PIWI結(jié)構(gòu)域形成一個供底物結(jié)合的溝槽，有助于sRNA和目標(biāo)mRNA結(jié)合，并可以剪切mRNA[3]。PAZ結(jié)構(gòu)域是核糖核蛋白復(fù)合體（RISC）中小RNAs的結(jié)合位點，PIWI結(jié)構(gòu)域是RISC中的酶切割活性中心。

1 AGO1與腫瘤的關(guān)系

AGO1的PIWI結(jié)構(gòu)域結(jié)合RNaseⅢ內(nèi)切酶Dicer來調(diào)節(jié)Dicer酶和AGO蛋白之間的相互作用，從而促進(jìn)RNAi的進(jìn)行[4]。有研究提示，AGO1可能還通過參與異染色質(zhì)沉默進(jìn)而參與腫瘤的進(jìn)展[5?6]。AGO1在細(xì)胞核中作用于DNA啟動子區(qū)域，使組蛋白和靶基因發(fā)生甲基化，從而抑制基因表達(dá)[6?7]。AGO1在正常肺和腎的發(fā)育過程中和在缺少Wilms腫瘤抑制基因WT1的腎癌中高表達(dá)[8]，提示AGO1在這些組織的胚胎發(fā)生過程中起重要作用。BEHMT?ANSMANT 等[9]還發(fā)現(xiàn)，AGO1蛋白的PIWI結(jié)構(gòu)域可與RNA沉默相關(guān)的GW182蛋白N端的GW重復(fù)結(jié)構(gòu)相互作用，從而參與微小RNA（miR?NA）途徑對目標(biāo)mRNA的降解。姜琳等[10]對AGO蛋白亞家族研究發(fā)現(xiàn)，在人乳腺癌MCF7、子宮頸癌HeLa細(xì)胞系中，小干擾RNA（siRNAs）對AGO蛋白的基因沉默效果明顯，AGO蛋白沉默導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性下降，使腫瘤細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，其中AGO1沉默所致的細(xì)胞生長抑制程度最大。在結(jié)腸癌研究中，LI等[11]發(fā)現(xiàn)AGO1～4和PIWIL1～4表達(dá)于腫瘤組織明顯高于癌旁組織；結(jié)腸癌組織與非癌組織相比，AGO1和PIWIL2表達(dá)顯著可能代表新的早期診斷結(jié)腸癌標(biāo)志物。

2 AGO2與腫瘤的關(guān)系

AGO蛋白家族在腫瘤的研究中，關(guān)于AGO2蛋白的報道較多。AGO2蛋白在生物體內(nèi)廣泛表達(dá)，具有核酸內(nèi)切酶活性。AGO2的PIWI結(jié)構(gòu)域與miRNA結(jié)合而參與mRNA的基因沉默[12]。AGO2表達(dá)水平與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，以及腫瘤細(xì)胞的增殖與分化、新生血管的發(fā)生、對缺氧應(yīng)激的耐受性等密切相關(guān)。miRNA廣泛參與腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。

在癌前病變?nèi)展庑越腔?、皮膚基底細(xì)胞癌、鱗癌中，AGO2 均高表達(dá)[13]。在胃癌中，ZHANG 等[14]發(fā)現(xiàn)，隨著病程的發(fā)展，AGO2的表達(dá)也在不斷變化。在乙型肝炎病毒相關(guān)肝細(xì)胞癌研究中發(fā)現(xiàn)，AGO2 mRNA的表達(dá)水平在癌癥組織中較高，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)AGO2可以通過增加黏附斑激酶基因的表達(dá)來參與肝細(xì)胞癌的進(jìn)展[15?16]。在多發(fā)性骨髓瘤研究中，WU 等[17]發(fā)現(xiàn)，AGO2的高表達(dá)可使抗血管生成的miR?145和促血管生成的let?7家族及miR?17/92基因簇表達(dá)失調(diào)，進(jìn)一步促進(jìn)新生血管形成，進(jìn)而參與腫瘤的遷移。VAKSMAN等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在晚期卵巢漿液癌患者中，化療后的AGO2 mRNA和蛋白水平較未化療患者低，這可能是延長患者生存時間的一個潛在指標(biāo)。在非小細(xì)胞肺癌研究中，DIEDERICHS等[19]發(fā)現(xiàn)，抑制AGO2的表達(dá)可使癌基因miR?100的表達(dá)下調(diào)，也使抑癌基因miR?34a、miR?125b的表達(dá)上調(diào)，提示AGO2在非小細(xì)胞肺癌中的高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。最近研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌中，通過miRNA和GRSF1參與miRNA途徑AGO2的正向調(diào)節(jié)[20]。AGO2的表達(dá)增強(qiáng)通過 miR?346和GRSF1獨立于AGO2穩(wěn)定性的增加。miR?346通過上調(diào)AGO2的表達(dá)來增加宮頸癌細(xì)胞的惡性表型。miR?346對AGO2的上調(diào)也發(fā)生在其他類型的癌細(xì)胞中，包括SW480結(jié)直腸癌細(xì)胞和OVCAR3卵巢癌細(xì)胞。證明了miR?346在GRSF1依賴的方式上增加AGO2的表達(dá)，從而參與調(diào)節(jié)其他miRNAs的活性。這一發(fā)現(xiàn)暗示，miR?346可能是宮頸癌預(yù)防和治療的潛在治療靶點。CUBILLOS?RUIZ等[21]在對卵巢癌相關(guān)樹突狀細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞內(nèi)注入合成的內(nèi)源性雙鏈pre?miR?155表達(dá)出來的卵巢癌抑癌基因miR?155首先與AGO2結(jié)合，進(jìn)入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體后，miR?155的活性明顯增強(qiáng)，隨后通過改變mRNA的表型來增強(qiáng)抗腫瘤免疫能力，提示AGO2可能與其他抑癌基因表達(dá)蛋白親和力較高并可增強(qiáng)抑癌基因作用。SHEN等[22]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中的AGO2表達(dá)可與表皮生長因子受體（EGFR）互相作用。在缺氧狀態(tài)下AGO2與EGFR的結(jié)合力加強(qiáng)，AGO2?Y393的磷酸化程度提高，進(jìn)而降低了AGO2與Dicer的結(jié)合力，miRNA成熟受阻滯，進(jìn)一步增加了腫瘤細(xì)胞的壽命及侵襲力。因此，AGO2的作用取決于其調(diào)節(jié)miRNA的功能來充當(dāng)致癌基因或抑癌基因。

AGO2在不同腫瘤中的具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究，有望將AGO2作為腫瘤的早期診斷、發(fā)展過程及治療預(yù)后的一個新的標(biāo)志物，并為使用RNAi技術(shù)進(jìn)行抗腫瘤治療提供依據(jù)。

3 AGO3、4與腫瘤的關(guān)系

關(guān)于AGO3、4蛋白功能的報道相對較少。AGO3、1、4均位于1p34，串聯(lián)在一個小的250 kb的區(qū)域，這一區(qū)域在原發(fā)神經(jīng)外胚層瘤、Wilms瘤及許多其他惡性腫瘤中常發(fā)生缺失，提示上述3個基因的缺失可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

最近研究了miRNA生物合成基因單核苷酸多態(tài)性（SNPs）與肺癌風(fēng)險之間的關(guān)系，評估了在GEMIN4和AGO1中的5個SNP之間的關(guān)聯(lián)，統(tǒng)計學(xué)上發(fā)現(xiàn)GEMIN4中的rs7813基因型和AGO1中的rs595961基因型仍與肺癌風(fēng)險有關(guān)[23]。miRNA與一些重要的蛋白質(zhì)，包括GEMIN4和AGO1，形成了miRISC，通過對目標(biāo)mRNA的翻譯和穩(wěn)定性進(jìn)行了負(fù)面的調(diào)控[24?26]。miRISC發(fā)揮作用類似于癌基因或抑癌基因通過抑制靶基因的表達(dá)參與多種腫瘤。miRNAs let?7的失調(diào)導(dǎo)致了細(xì)胞狀態(tài)的分化和癌癥的發(fā)展：通過靶向RAS和HM?GA2，let?7在人類細(xì)胞中作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。WINTER等[27]發(fā)現(xiàn)，AGO3由其PAZ和MID域介導(dǎo)優(yōu)先結(jié)合 let?7a?3，并特別規(guī)范了 let?7a?3p 活動，影響miRNA生命周期的晚期活動。在結(jié)腸癌中，LI等[11]發(fā)現(xiàn)AGO蛋白家族在癌癥組織中均是高表達(dá)，在結(jié)腸癌的遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移過程中AGO2～4和PIWIL4比其他AGO亞族蛋白表達(dá)量均高，提示高表達(dá)的AGO2～4和PI?WIL4可能有助于提高腫瘤侵襲能力。

姜琳等[10]在對人類乳腺癌MCF7、子宮頸癌HeLa、肺腺癌A549和胚腎細(xì)胞HEK293這4種細(xì)胞系中研究發(fā)現(xiàn)，AGO1～4在細(xì)胞系中均是穩(wěn)定表達(dá)，提示AGO亞族蛋白在這4種細(xì)胞生長和增殖過程中扮演一個或不可缺的角色。

4 PIWIL1與腫瘤的關(guān)系

PIWIL1在人體中廣泛表達(dá)，包括腦、心、肝、腎、骨骼肌、前列腺、卵巢。在人類干細(xì)胞的自我更新和RNA沉默起著至關(guān)重要的作用[28?29]，影響癌細(xì)胞的增殖。

在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，PIWIL1在青年人和成年人中高表達(dá)[30]。田瑞卿等[31]發(fā)現(xiàn)，在卵巢細(xì)胞ES?2、肝癌細(xì)胞 QGY?7703、胃癌細(xì)胞 MGC803 和前列腺癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞PC?3M?2B4中表達(dá)水平較高。對于前列腺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系來說，PIWIL1表達(dá)水平低。在不同肝癌腫瘤細(xì)胞系中，PIWIL1的表達(dá)水平也不一致。不同腫瘤的PIWIL1的表達(dá)存在較大差異，同種腫瘤不同細(xì)胞株P(guān)IWIL1表達(dá)差異的機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。在子宮內(nèi)膜癌研究中，CHEN等[32]初步研究發(fā)現(xiàn)，PIWIL1在正常子宮內(nèi)膜癌組織中沉默或表達(dá)弱，但在子宮內(nèi)膜非典型增生和子宮內(nèi)膜癌組織中強(qiáng)。特異性敲除子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的PIWIL1，導(dǎo)致腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移發(fā)生潛在變化。PIWIL1可能是子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的自我更新被激活所必需的分子道路的一部分。CD133和CD44是子宮內(nèi)膜癌腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物。過表達(dá)PIWIL1，CD44表達(dá)增加；敲除PIWIL1，標(biāo)志物CD44表達(dá)水平下降。在子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中，通過抑制PIWIL1，腫瘤干細(xì)胞增殖、遷移能力、侵襲和成球的能力減弱。因此，PIWIL1可以調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞干性。PIWIL1還參與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，在子宮內(nèi)膜癌誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin、N?adherin的表達(dá)，PIWIL1可多上調(diào)上皮標(biāo)志物E?鈣黏蛋白。進(jìn)一步研究表明，PI?WIL1上調(diào)Snail的轉(zhuǎn)錄，表明PIWIL1可能是Snail誘導(dǎo)EMT所必需的[32]。敲除Snail可以逆轉(zhuǎn)EMT并顯著減弱癌細(xì)胞的遷移侵襲和腫瘤干細(xì)胞樣特性。PIWIL1可以誘導(dǎo)EMT，賦予子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞干細(xì)胞樣特性，但是Snail參與PIWI1調(diào)控的具體機(jī)制尚不清楚。在結(jié)腸癌中，PIWIL1的表達(dá)作用類似于子宮內(nèi)膜癌，但PI?WIL1的確切機(jī)制尚不清楚。在體外研究膠質(zhì)瘤、乳腺瘤和肉瘤顯示，抑制PIWIL1通過不同機(jī)制抑制癌細(xì)胞生長[33?35]。

根據(jù)以往的研究，在提高腫瘤的增殖和侵襲等惡性行為中，PIWIL1 過表達(dá)起關(guān)鍵作用[36?38]，進(jìn)而增加腫瘤發(fā)展的風(fēng)險，是結(jié)腸癌、軟組織肉瘤和胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后不良的標(biāo)志，可能是食管鱗狀細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌預(yù)后的不良因素。在子宮內(nèi)膜癌的研究發(fā)現(xiàn)，PIWIL1的表達(dá)與淋巴間隙受累、淋巴轉(zhuǎn)移、肌層浸潤之間呈顯著正相關(guān)。因此，PIWIL1將可能作為抗癌治療策略的一個新的、有前途的目標(biāo)。

5 PIWIL2與腫瘤的關(guān)系

正常組織中，PIWIL2表達(dá)具有特異性，僅限在睪丸的生殖干細(xì)胞和精原細(xì)胞中表達(dá)。PIWIL2和參與的piRNA道路共同起轉(zhuǎn)座子基因的表觀修飾、穩(wěn)定基因組特性的作用。在正常組織中缺乏PIWIL2蛋白的表達(dá)，而在腫瘤中異常高表達(dá)，則提示PIWIL2還參與了腫瘤的發(fā)生。PIWIL2可能也參與了DNA的修復(fù)[39?41]，從而發(fā)揮了其抑癌基因的作用。PIWIL2抑制細(xì)胞凋亡并通過激活 Stat3/bcli?xl通道（16）來促進(jìn)增殖，PIWIL2/Stat3/c?src形成三聚蛋白復(fù)合物，進(jìn)一步證實了這一發(fā)現(xiàn)。Stat3被c?src磷酸化，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。隨后Stat3與P53啟動子結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄，從而抑制P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[42]。PIWIL2是作為癌基因或抑癌基因仍存在爭議，在腫瘤中的主要機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

PIWIL2基因的表達(dá)在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤、前列腺、乳腺、胃腸道、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌鱗狀細(xì)胞癌、宮頸腺癌和乳腺癌的各個階段及白血病中得到驗證[43]。在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）研究中，殷德濤等[44]發(fā)現(xiàn)，PIWIL2過表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PIWIL2 mRNA也升高，可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，PIWIL2 mRNA的表達(dá)在所有檢查的膀胱癌細(xì)胞系中都很低，甚至無法檢測，在良性或惡性膀胱組織中PIWIL2的表達(dá)估計不到控制睪丸組織水平的0.5%[43]。在膀胱移行細(xì)胞癌研究中，曹正國等[45]發(fā)現(xiàn)PIWIL2高表達(dá)且體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA可抑制BIU?87細(xì)胞PIWIL2的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。提示PIWIL2與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為治療膀胱腫瘤提供依據(jù)。HE等[46]對宮頸癌的輔助腫瘤標(biāo)志物的研究發(fā)現(xiàn)，PIWIL2在所有的癌前病變和惡性病變組織中都表達(dá)，在不同階段和不同病變類型的宮頸癌中較p16INK4a有更廣泛的表達(dá)，可以作為宮頸癌早期診斷的一個新的腫瘤標(biāo)志物。在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的PIWI同系物表達(dá)中，只有PIWIL2高表達(dá)。PIWIL2上調(diào)在NSCLC的進(jìn)展中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。PIWIL2高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化活動，抑制PIWIL2觸發(fā)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期G2/M期阻滯[47]。PIWIL2在預(yù)后差的NSCLC中表達(dá)過量。因此，PIWIL2的表達(dá)水平可以作為NSCLC預(yù)后的一個指標(biāo)。在已有的乳腺癌研究中，LIU等[48]通過免疫組織化學(xué)比較PIWIL2與目前已知的乳腺癌腫瘤標(biāo)志物雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、Her?2 和 Ki?67 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)PIWIL2在各個階段乳腺癌中均表達(dá)，而PI?WIL2在正常的組織中只有在睪丸中表達(dá)。提示PI?WIL2 較 ER、PR、Her?2 和 Ki?67 在診斷乳腺癌具有更高的靈敏度和特異性。

綜上所述，PIWIL2在結(jié)腸癌、膀胱癌、宮頸癌、乳腺癌、甲狀腺癌等腫瘤中都均高表達(dá)，并可作為上述惡性腫瘤的早期診斷、預(yù)后評估的一個新腫瘤標(biāo)志物，以及為靶向治療提供依據(jù)。

6 PIWIL3、PIWIL4與腫瘤的關(guān)系

關(guān)于PIWIL3和PIWIL4蛋白功能的報道很少。在果蠅的異染色質(zhì)和染色質(zhì)中，只有一種PIWI基因，在組蛋白H3賴氨酸9（H3K9）上印上了甲基化標(biāo)志，起著沉默目標(biāo)基因和抑制RNA PolⅡ轉(zhuǎn)錄作用[49]。而在人類細(xì)胞中，PIWIL4 在腫瘤抑制基因位點 p16Ink?4a（CD?KN2A）上誘導(dǎo) H3K9 甲基化（CDKN2A）[50]。最近研究發(fā)現(xiàn)，PIWIL4在乳腺癌MDA?MB?231細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和組織中高表達(dá)，PIWIL4表達(dá)的減少嚴(yán)重影響乳腺癌細(xì)胞遷移的能力，增加其凋亡，輕度影響其增殖[51]。通過蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組的分析表明，在乳腺癌中的功能至少部分是通過其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）和成纖維生長因子（FGF）信號通路與主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（MHCⅡ）類蛋白。提示PIWIL4可作為乳腺癌的一個潛在的治療靶點。在人卵巢透明細(xì)胞癌ES?2細(xì)胞研究中，郭麗敏等[52]采用半定量RT?PCR檢測發(fā)現(xiàn)，較癌旁組織中PIWIL4高表達(dá)。設(shè)計并化學(xué)合成針對PIWIL4的siRNA，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)入ES?2細(xì)胞內(nèi)，通過MTT和克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，PIWIL4?siRNA可有效抑制ES?2細(xì)胞的生長活性和增殖能力，提示PIWIL4參與與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展。

PIWI蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)，是轉(zhuǎn)座子活性調(diào)節(jié)劑和表觀遺傳調(diào)節(jié)器；位于細(xì)胞質(zhì)中，又是RNA翻譯和穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)因子[53]。PIWI蛋白在干細(xì)胞的自我更新、轉(zhuǎn)座子和RNA沉默、精子發(fā)生過程中、染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄調(diào)控在各種生物中起著重要的作用[54?55]。大多數(shù)研究表明，PIWI蛋白在人類癌癥中過度表達(dá)，PIWIL1～4表達(dá)與T分期、高表達(dá)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床TNM分期和患者生存時間較短呈正相關(guān)[11，56]。在異常DNA甲基化的轉(zhuǎn)座原件發(fā)現(xiàn)TES區(qū)域，TES區(qū)域不穩(wěn)定可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定并影響癌基因和抑癌基因的表達(dá)，而PI?WI蛋白在控制TES穩(wěn)定性中扮演重要角色[57?58]。通過與piRNA相互作用，PIWI維持基因組的穩(wěn)定性[59]。但在腫瘤中的具體作用如異染色質(zhì)化、DNA修復(fù)等還需要進(jìn)一步研究。隨著研究的深入，PIWI蛋白在腫瘤的早期診斷、治療和預(yù)后評估有望成為一種新的標(biāo)記物和治療靶點。

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