SBR反應器中C60對活性污泥的影響

郭洪霞

(安徽三聯(lián)學院 教務處， 安徽 合肥 230601)

隨著納米材料的大規(guī)模生產(chǎn)和應用，納米材料對人類健康及生態(tài)環(huán)境都有負面影響[1-4]，其環(huán)境效應和安全性受到高度重視[5.6].作為應用最廣泛的磷納米材料之一，富勒烯存在潛在環(huán)境和健康風險[7]，對細胞[8,9]、微生物[10,11]、水生生物[12-14]等均有毒性作用.C60水懸液會引起土壤中微生物群落的持續(xù)低水平變化[15]，C60顆粒狀或水懸液對土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能均無顯著的毒性作用[16].富勤烯能在環(huán)境介質(zhì)中進行遷移而污染水份，國內(nèi)外尚無此類研究.本文以四氫呋喃法制備的C60水懸液對SBR中活性污泥的影響為研究目的，通過對活性污泥生化特性的監(jiān)測，并利用PCR-DGGE技術來考察微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，以及C60內(nèi)對活性污泥的影響，以期為富勒烯的合理開發(fā)和利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試劑：C60、三水合乙酸鈉、氯化銨、磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸鎂、氫氧化鈉、甲苯等均為分析純.

活性污泥：本試驗使用的污泥取自合肥市望塘污水處理廠的回流池，經(jīng)人工配水馴化一周后開始試驗.

人工配水：本試驗所用的原水為人工配水，即在自來水中加入一定量的營養(yǎng)物質(zhì)配制而成.以乙酸鈉為碳源，使進水COD=500 mg/L；具體營養(yǎng)物質(zhì)及含量如下： NH4Cl 95 mg/L；K2HPO4·3H2O 30 mg/L；CaCl225 mg/L； MgSO420 mg/L，這樣可保證配水中營養(yǎng)物質(zhì)符合微生物生長比例CNP=10051，并加入適量的微量元素.

1.2 試驗方法

1.2.1 C60標準曲線繪制

精確稱取20.70 mg C60溶于50 mL甲苯中，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容至刻度，配置成標準貯備液.準確移取10.00 mL標準貯備液置于100 mL量筒中并用甲苯定容，配置成標準使用液.分別移取體積為 2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL C60標準使用液置于25 mL比色管中，用甲苯溶液稀釋至20.00 mL.以甲苯溶液為空白，在330 nm處測定吸光度.以濃度對吸光度作圖，繪制C60標準曲線.

1.2.2 C60水懸液的制備與表征

稱取4 mg C60納米顆粒溶于250 mL四氫呋喃中，磁力攪拌24 h，經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾.將濾液緩慢加入到迅速攪拌著的等體積蒸餾水中，形成淡黃色懸濁液；將此懸濁液進行蒸餾以去除四氫呋喃，蒸至約300 mL，加蒸餾水200 mL繼續(xù)蒸餾至體積減半，如此反復兩次之后，將C60水懸液濃縮至100 mL左右.對制備的水懸液進行紫外可見吸收光譜 (UV-Vis) 分析及粒徑分布表征，C60穩(wěn)定水懸液經(jīng)高氯酸處理和甲苯萃取后，萃取液在330 nm處測定吸光度，確定C60水懸液的濃度.

1.2.3 C60水懸液對活性污泥影響

試驗在均為2.5 L的4個序批式(SBR)反應器中進行.試驗前將馴化好的污泥曝氣24 h，以耗盡所有外源基質(zhì)，然后用自來水、蒸餾水各清洗三次，以去除溶液中的殘留底物以及代謝產(chǎn)物等，最后將反應器中的活性污泥濃度MLSS調(diào)整到2 000 mg/L 左右.向1、2號反應器(實驗組)中各加入200 mL制備好的濃度為48.27 mg/L的C60水懸液，同時向3、4號反應器(對照組)中加入等量的蒸餾水作為對照組，這樣每個反應器中有機底物的濃度相等.控制反應器曝氣量為0.4 m3/h，SBR反應器在20 ℃條件下運行，反應周期為6 h，并間隔一定時間取適量的污泥混合液以溶氧儀測定耗氧速率(OUR).同時，監(jiān)測水樣中總有機碳以及氨氮的降解情況，反應結(jié)束后提取污泥樣品的DNA，采用PCR-DGGE確定活性污泥中微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化.

1.2.4 PCR擴增和變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

接種活性污泥及反應器中的活性污泥經(jīng)DNA提取試劑盒分別提取基因組DNA.使用細菌通用引物F338 (5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3')和R534 (5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')，正向引物F338的5' 端連有一個40 bp富含GC的序列(5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCACGG GGG G-3')，擴增16S rRNA基因的V3區(qū)域.PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.DGGE分析采用8%聚丙烯酰胺，30%～50%變性劑，以75 V和60 ℃使用D-Code system (BioRad Laboratories, Hercules, CA) 恒溫電泳14 h后，溴化乙錠 (1 μg/mL)染色20 min，用Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并照相.

1.2.5 分析方法

混合液懸浮固體濃度(MLSS)、混合液揮發(fā)性懸浮固體濃度(VSS)、污泥體積指數(shù)(SVI)、氨氮(NH3-N)、耗氧速率(OUR)均采用標準方法[17]測定，TOC用總有機碳分析儀(vario TOC CUBE，德國Elementar)測定，ζ電位及粒徑分布采用Zeta電位分析儀(Nano-ZS， 英國馬爾文儀器公司)測定 .

2 結(jié)果與分析

2.1 C60水懸液的制備與表征

C60具有強疏水性而難溶于水，采用四氫呋喃法制備出的富勒烯水懸液形成穩(wěn)定的富勒烯聚集體 (nC60)，即“親水性”膠體[18,19].C60水懸液的UV-vis吸收譜如圖1，富勒烯聚集體的UV-vis吸收特征不同于C60分子在溶劑中的吸收光譜.圖2中制備的C60水懸液的粒徑主要在100 nm 左右.UV-vis吸收光譜顯示nC60的特征吸收峰分別是218、274、343 nm，與C60在正己烷中形成的溶液相比，特征吸收峰變寬，而且在400～500 nm處出現(xiàn)了新的吸收峰，這是由于C60分子結(jié)構(gòu)中的離域共軛π鍵具有高電子親和力，是強電子受體，水中的氧作為電子供體可與nC60形成電子供體-受體復合物[20]，進而在nC60表面形成水化殼，結(jié)果導致吸收光譜的變化.經(jīng)測定，制備得到的C60水懸液的ζ電位為-31.64±1.35 mV.根據(jù)理論計算，分散到水中的nC60表面的負電荷來源于水中氧原子與nC60之間的電荷轉(zhuǎn)移作用[21].C60聚集體所帶的負電荷量因制備方法不同而不同，nC60顆粒表面的負電荷從-13.5～-50 mV不等[22].正是由于顆粒表面的負電荷,使得顆粒之間相互排斥，從而形成穩(wěn)定的水溶膠性質(zhì)的納米富勒烯聚集體，均與文獻[9]一致，說明制備的是納米富勒烯水懸液.

圖1 C60水懸液UV-Vis吸收光譜

圖2 C60水懸液粒徑分布圖

2.2 C60對耗氧速率的影響

耗氧速率(OUR)是評價污泥代謝活性的重要指標，可用來評估系統(tǒng)的處理能力.在污泥體系受到毒物沖擊時OUR會有所下降，因此，測定污泥中的OUR是評價化合物對于活性污泥中微生物毒性效應的一種重要手段[23].圖3為加C60和不加C60的反應器在運行一個周期內(nèi)的OUR隨時間的變化圖.可以看出，隨著反應器的運行，試驗組和對照組反應器中污泥耗氧速率都經(jīng)歷了首先迅速上升，達到最大值后短時間平穩(wěn)，急速下降，緩慢下降，達到穩(wěn)定這五步.兩組反應器的OUR最大值均為160 mg/L/h左右，急速下降時間段均發(fā)生在40 min左右，且OUR值相當.之后的緩慢下降階段均持續(xù)了約一個小時，最后基本穩(wěn)定在10 mg/L/h.穩(wěn)定階段的耗氧速率極低，因為此時反應器中的營養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)基本耗盡，標志著體系進入了內(nèi)源呼吸階段.從OUR整體的變化趨勢和具體數(shù)值來看，C60水懸液對好氧活性污泥的耗氧速率沒有顯著影響.

2.3 C60對氨氮降解的影響

氨氮是廢水處理中評價好氧活性污泥處理能力的重要指標.圖4中氨氮的初始值均在10 mg/L左右.試驗組與對照組反應器中氨氮的含量均經(jīng)歷了線性下降和達到平衡兩個階段.線性部分在90 min時結(jié)束，此時氨氮值下降到0.45 mg/L，此后為平衡期，氨氮數(shù)值極低并且變化不大，氨氮去除率達95.5%.由圖3可知，在反應前90 min，耗氧速率較大，說明此時微生物活性較高，氨氮去除速率較快；此后隨著微生物活性的降低，氨氮的去除速率也隨之降低，而反應器中的氨氮含量也趨于零.但從整體趨勢及數(shù)值來看，試驗組與對照組在氨氮降解方面并無明顯差別.由以上結(jié)果推斷，C60在活性污泥對氨氮的降解能力方面并未產(chǎn)生顯著影響.

圖3 反應器中耗氧速率隨時間的變化

圖4 NH3-N 濃度變化曲線

2.4 C60對總有機碳降解的影響

微生物對碳源的降解可以從另一方面反映微生物活性的大小.由圖5可知，反應器內(nèi)總有機碳(TOC)在反應開始的40 min內(nèi)經(jīng)歷了一個較快的線性下降的階段，降解速率達1.85 mg/L/min，之后降解速率大大降低，最終維持在一個較低的水平，試驗組與對照組對總有機碳的去除率分別為67.7%和66.7%，兩組對總有機碳降解并無顯著影響.

圖5 反應器中總有機碳濃度變化

結(jié)合圖3、圖4和圖5可知，OUR的急速下降時間與TOC的快速降解時間一致，緩慢下降并產(chǎn)生第二個階躍的時間與氨氮氧化時間相同.耗氧速率首先上升是由于反應剛開始時，微生物由外源基質(zhì)耗盡轉(zhuǎn)入營養(yǎng)基質(zhì)后處于活性恢復階段.微生物活性恢復后OUR急速上升，達到最大值并短暫穩(wěn)定，在這一階段TOC降解非常迅速，OUR水平很高，這個階段的OUR變化主要是由TOC快速降解引起的.當TOC降解速率較低時，即在40 min左右，OUR產(chǎn)生第一個急速下降，此時TOC降解已經(jīng)達到67%左右，之后OUR變化較為緩慢.在反應進行到90 min時，產(chǎn)生第二次階躍，這次OUR變化主要是由氨氮氧化引起的.

2.5 C60對微生物種群結(jié)構(gòu)的影響

PCR-DGGE技術將相同長度、不同序列的PCR擴增片段在變形梯度凝膠上分離，從分子水平上快速、準確地表征微生物群落結(jié)構(gòu)和演替規(guī)律，目前已廣泛應用于土壤[24]、固體廢棄物[25]、水體[26]等研究中.本研究分別取接種污泥、反應6 h后試驗組與對照組的活性污泥提取DNA，并對提取出的DNA經(jīng)過PCR擴增以后采用DGGE技術比較分析兩種活性污泥中微生物菌群的結(jié)構(gòu)變化.在PCR-DGGE圖譜中，每一條帶代表某種可能的微生物類群，電泳條帶的數(shù)目越多，說明生物多樣性越豐富；條帶亮度越強，其在群落所占數(shù)目越多.

圖6 活性污泥DGGE圖譜比較注：A為接種污泥，B為對照污泥，C為nC60處理污泥.

如圖6可知，在SBR反應器中活性污泥樣品的DGGE圖譜中，條帶數(shù)目較多，說明污泥微生物的種群十分豐富.但從圖譜中條帶的位置及數(shù)量可以看出，反應前后反應器中微生物的菌群結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯變化.每個樣品中均有3～4個較亮的條帶出現(xiàn).圖中a、b、c、d這些條帶所代表的類群均為反應器中的優(yōu)勢種群.然而，C60的加入并沒有影響到條帶的位置及亮度，即短期內(nèi)C60對于活性污泥中微生物的種群結(jié)構(gòu)并無明顯影響.這可能是由于本研究僅僅考察了C60對活性污泥體系在一個運行周期內(nèi)的影響，微生物群落結(jié)構(gòu)的改變未能在短期內(nèi)做出響應.

Nyberg等[27]考察了富勒烯C60對污泥厭氧硝化過程的影響，90天內(nèi)氣體的產(chǎn)生量無顯著差異，C60對微生物群落結(jié)構(gòu)無顯著影響.Tong等[16]發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落對C60具有較強的耐受性，微生物功能和結(jié)構(gòu)受其影響甚小.本研究成果與以上結(jié)果具有相似性，說明C60在這些復雜自然環(huán)境中的生態(tài)行為，不能簡單地根據(jù)其對純培養(yǎng)微生物或細胞的毒性作用來推測.自然環(huán)境中的腐殖質(zhì)類物質(zhì)，巨大表面積的活性污泥絮體，及對C60的吸附作用等都會減少其生物有效性.因此對于復雜的環(huán)境樣品來說，納米材料的環(huán)境效應會受多種因素的影響，需進一步考察高濃度碳納米材料作用下的長期效應，為納米材料的開發(fā)和利用提供參考.

3 結(jié)論

(1)通過監(jiān)測反應器中活性污泥對有機碳源的降解和氨氮的利用及好氧呼吸速率，發(fā)現(xiàn)C60水懸液對SBR反應器中活性污泥的生化特性無顯著影響.反應器投加C60水懸液90 min后，NH3-N和TOC的去除率分別是95.5%和66.7%，與未投加C60水懸液反應器的去除率(95.5%和67.7%)無明顯差別.

(2)PCR-DGGE分析結(jié)果顯示，代表優(yōu)勢種群的條帶數(shù)目、亮度和位置均未發(fā)生明顯改變，表明C60水懸液的投加沒有造成活性污泥中微生物菌群結(jié)構(gòu)的較大變化.活性污泥系統(tǒng)中微生物之間的功能豐余性增加了該群落對環(huán)境的適應性，C60水懸液在短期內(nèi)對污泥微生物種群的功能和結(jié)構(gòu)不會產(chǎn)生顯著影響.