間充質(zhì)干細(xì)胞治療克羅恩病肛瘺研究進(jìn)展

程 芳綜述，張 浩審校（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶400010）

克羅恩病（CD）是一種以透壁炎癥和瘺管形成特征的慢性炎癥性腸病，肛瘺是其常見并發(fā)癥。目前，肛瘺的治療包括藥物與外科手術(shù)，但均不能實(shí)現(xiàn)CD肛瘺的治愈。近年來，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）對CD肛瘺的治療日益得到重視，由于其具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)等潛能，可實(shí)現(xiàn)腸道免疫的重建，從根本上避免免疫介導(dǎo)的腸道炎癥的發(fā)生，有可能實(shí)現(xiàn)CD肛瘺的長期愈合，提高患者生活質(zhì)量，是治愈CD肛瘺最具潛力的新型治療方法。現(xiàn)將MSCs治療CD肛瘺的臨床研究進(jìn)展綜述如下。

1 CD肛瘺的治療概述

CD是一類免疫介導(dǎo)的以消化道炎癥為主要表現(xiàn)的慢性復(fù)發(fā)性、全身性疾病，其特征在于透壁性。目前認(rèn)為，其發(fā)病是遺傳易感宿主免疫系統(tǒng)對腸道微生態(tài)免疫失調(diào)所致，其中包括促炎性免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子誘導(dǎo)腸道組織損傷，瘺管形成可涉及整個(gè)腸道。

肛瘺是CD最常見并發(fā)癥之一，高達(dá)26.0%～28.0%的患者在診斷CD后20年內(nèi)會(huì)形成肛瘺，特別是結(jié)腸、直腸受累者。

肛瘺相關(guān)的疼痛、瘺管排泄、膿腫形成等嚴(yán)重降低了患者生活質(zhì)量。目前，CD肛瘺的治療主要包括抗菌藥物、免疫抑制劑、生物制劑等藥物治療和外科手術(shù)治療，但60.0%～70.0%的患者藥物治療停止后會(huì)復(fù)發(fā)，僅少部分患者可實(shí)現(xiàn)長期緩解[1]。

以英夫利昔為例，盡管其治療CD肛瘺有效，但在英夫利昔終止治療3個(gè)月后，CD肛瘺復(fù)發(fā)率達(dá)50.0%，即使維持治療，在第54周也只有36.0%的患者維持瘺管的完全閉合[2]；且有研究顯示，英夫利昔治療時(shí)相當(dāng)部分患者會(huì)再次遭受疾病活動(dòng)與復(fù)發(fā)[3]，且生物制劑的長期使用可能增加患者機(jī)會(huì)性感染與發(fā)生惡性腫瘤的概率，因此，生物制劑維持瘺管的持續(xù)愈合作用是有限的，在風(fēng)險(xiǎn)與效益平衡之間仍然存在巨大挑戰(zhàn)。

外科手術(shù)是肛瘺治療的另一種選擇，但術(shù)后復(fù)發(fā)率也為11.0%～45.0%，另外10.0%～35.0%的患者在術(shù)后出現(xiàn)大便失禁。還有研究表明，糞菌移植具有控制CD病情活動(dòng)度的作用，但復(fù)發(fā)率也較高，20.0%～40.0%的患者最終將進(jìn)行直腸切除術(shù)[4]。因此，CD肛瘺的治療及實(shí)現(xiàn)長期愈合仍是臨床醫(yī)生面臨的重大挑戰(zhàn)。近年來，再生醫(yī)學(xué)及干細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域取得巨大進(jìn)步，干細(xì)胞治療已成為臨床研究熱點(diǎn)，多項(xiàng)臨床研究已證實(shí)，MSCs對目前藥物及外科手術(shù)治療失敗的CD肛瘺患者具有積極的治療作用，為CD肛瘺提供了一種具有前景的新型替代治療方法。

2 MSCs治療CD肛瘺的機(jī)制

干細(xì)胞是具有自我更新能力的未分化細(xì)胞，主要包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，后者又可分成MSCs、造血干細(xì)胞和腸道干細(xì)胞等，當(dāng)前用于CD肛瘺治療較多的MSCs是來源于中胚層的具有免疫抑制及促進(jìn)組織修復(fù)的非造血多能干細(xì)胞，在不同微環(huán)境下可分化成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等不同類型的間質(zhì)細(xì)胞。MSCs可從骨髓、脂肪、臍帶、胎盤或大多數(shù)器官的結(jié)締組織中分離。MSCs表達(dá)低水平的人類白細(xì)胞抗原-Ⅰ類抗原（HLA-Ⅰ），而不表達(dá)人類白細(xì)胞抗原-Ⅱ類抗原（HLA-Ⅱ）和共刺激分子（如 CD80、CD86或 CD40），所以，免疫原性極低。

MSCs治療CD肛瘺的機(jī)制可能包括以下方面：（1）MSCs的免疫調(diào)節(jié)是依賴于炎癥環(huán)境的多級(jí)過程。①樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞通過T淋巴細(xì)胞的生成和極化參與了CD肛瘺的發(fā)病。MSCs通過抑制異基因淋巴細(xì)胞增殖而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用已經(jīng)多項(xiàng)臨床研究證實(shí)[5-6]。在CD肛瘺患者中樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg）比例是降低的，特別是在外周血中更低。MSCs可通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D2和p27Kip1表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，從而抑制單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞的成熟，抑制樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞和遷移功能。且還可通過對樹突狀細(xì)胞成熟標(biāo)志物，如主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ、共刺激分子（CD40、CD80和CD86）的下調(diào)來抑制樹突狀細(xì)胞的遷移、成熟、抗原呈遞功能。MSCs通過Notch信號(hào)通路誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞，同時(shí)，增加抗炎性細(xì)胞因子——白細(xì)胞介素-10（IL-10）等的分泌并減少促炎性細(xì)胞因子——IL-12等的生成，阻止初始和記憶CD4+細(xì)胞及CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖、分化，促進(jìn)初始及記憶T淋巴細(xì)胞生成Treg。②CD肛瘺的發(fā)病機(jī)制還涉及輔助性T淋巴細(xì)胞1（Th1）/Th17與Treg分化比例失衡，MSCs可抑制Th1、Th17分泌促炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α、γ 干擾素（IFN-γ）、IL-6、IL-12、IL-17、IL-23等，促進(jìn)具有抑制自身免疫和有免疫耐受作用的CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的生成，同時(shí)，通過分泌可溶性因子，如前列腺素E2、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、HLA-G等或依賴T淋巴細(xì)胞與CC類趨化因子配體1（CCL1）和CC類趨化因子受體8（CCR8）之間的相互作用，從初始及記憶T淋巴細(xì)胞中招募Treg，從而恢復(fù)Th1/Th17與Treg之間的平衡，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能。當(dāng)然MSCs還可依賴環(huán)境信號(hào)和MSCs/效應(yīng)細(xì)胞比例，作用于B淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，抑制B淋巴細(xì)胞活化、增殖、趨化和免疫球蛋白G的分泌，增加IL-10產(chǎn)生CD5+調(diào)節(jié)性B淋巴細(xì)胞，促進(jìn)幼稚B淋巴細(xì)胞增殖、分化為可分泌免疫球蛋白的漿細(xì)胞，同時(shí)，抑制自然殺傷細(xì)胞增殖及其分泌促炎性細(xì)胞因子。在體內(nèi)MSCs遷移到炎癥部位對基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α及次級(jí)淋巴組織趨化因子及在體外對補(bǔ)體蛋白、生長因子和趨化因子做出應(yīng)答。在炎癥部位MSCs通過IFN-γ、腫瘤壞死因子-α或IL-1β的激活產(chǎn)生可溶性免疫應(yīng)答抑制因子（包括吲哚胺2，3-雙加氧酶、前列腺素E2、腫瘤壞死因子-α刺激基因-6和一氧化氮）導(dǎo)致巨噬細(xì)胞極化到抗炎M2表型，誘導(dǎo)耐受性樹突狀細(xì)胞和Treg，促進(jìn)Th1/Th2轉(zhuǎn)換，抑制肥大細(xì)胞和Th17分化，以及誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡。③MSCs還通過涉及細(xì)胞凋亡的膜表面分子/細(xì)胞凋亡的膜表面分子配體途徑、程序性死亡分子-1/程序性死亡配體-1、半乳凝素、CD39-腺苷代謝和Notch信號(hào)的接觸依賴性殺傷機(jī)制誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。（2）MSCs促進(jìn)損傷組織修復(fù)。MSCs可通過IFN-γ、IL-1β等的激活和血管細(xì)胞黏附分子抗體包被來促進(jìn)其向腸道炎癥組織“歸巢”。MSCs還可通過表達(dá)生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子、血小板生長因子等及通過趨化因子與各種CC類趨化因子受體之間的相互作用作為調(diào)節(jié)遷移的信號(hào)，選擇性地遷移到腸道固有層、肌層、黏膜下層和腸系膜淋巴結(jié)等損傷及炎癥部位而發(fā)揮作用。且MSCs還可分泌參與炎性免疫細(xì)胞遷移的黏附分子（細(xì)胞間黏附分子、血管細(xì)胞黏附分子等）和整聯(lián)蛋白，促進(jìn)MSCs遷移至腸道炎癥組織。在腸道炎癥組織中MSCs能分化成不同類型的間質(zhì)細(xì)胞，上調(diào)平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)，促進(jìn)受損組織修復(fù)。但也有研究表明，MSCs的組織修復(fù)能力并非由于其具有自身分化能力，而是MSCs通過刺激血管生成和抑制受損組織細(xì)胞的凋亡及纖維化來刺激局部損傷組織細(xì)胞的存活及恢復(fù)其功能。目前，尚不清楚MSCs在損傷組織中停留的時(shí)間長短，大多數(shù)研究對MSCs在腸道組織中的追蹤分析僅在注射后第1周，且每次均能在腸道炎癥區(qū)域被發(fā)現(xiàn)[7-8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在MSCs注射后第5天可在腸道炎癥區(qū)域被檢測到，而在第7天未能被追蹤到[9]。另有證據(jù)表明，MSCs在注射后存在于腸道炎癥組織中至少15 d[10]。

3 MSCs對CD肛瘺治療的臨床應(yīng)用及安全性

目前，已有11項(xiàng)臨床研究證實(shí)，自體或同種異體來源的骨髓或脂肪MSCs局部瘺管內(nèi)注射治療難治性CD肛瘺的療效佳及安全性可。累計(jì)有300多例CD肛瘺患者接受了MSCs局部瘺管內(nèi)注射治療，其中大部分患者對藥物或外科手術(shù)治療失敗，研究結(jié)果顯示，超過50.0%的CD肛瘺可得到臨床應(yīng)答，且該臨床應(yīng)答在75.0%的患者中可持續(xù)至少 24周[11-21]。2005年，GARCíA-OLMO等[11]首次報(bào)道采用MSCs治療難治性CD肛瘺患者，結(jié)果顯示，75.0%的患者可在第8周實(shí)現(xiàn)瘺管閉合。2016年，發(fā)表于Lancet雜志的具有里程碑意義的Ⅲ期臨床研究納入了212例難治性CD肛瘺患者，107例患者被隨機(jī)分配到單次瘺管內(nèi)注射120×106同種異體脂肪MSCs（Cx601組），105例患者被隨機(jī)分配至接受瘺管內(nèi)注射24 mL生理鹽水作為對照組，結(jié)果顯示，至24周時(shí)Cx601組患者肛瘺聯(lián)合緩解率（臨床查體、磁共振成像檢查）高于對照組，分別為50.0%、34.0%，且Cx601組患者可在更短時(shí)間獲得肛瘺臨床緩解，分別為6.7、14.6周。目前該研究仍在進(jìn)行中，計(jì)劃延長觀察到104周[20]。2015年進(jìn)行的一項(xiàng)meta分析結(jié)果同樣顯示，MSCs治療CD肛瘺的療效佳，CD肛瘺患者愈合率可達(dá)61.3%，且僅出現(xiàn)了輕度不良事件，如發(fā)熱、腹瀉、直腸疼痛、肛周膿腫等，大多數(shù)是一過性，并不需要患者入院治療，表明耐受性好[22]。2017年進(jìn)行的一項(xiàng)meta分析結(jié)果再次提示MSCs治療CD肛瘺愈合率較對照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（優(yōu)勢比=0.21，P=0.000）[23]。

目前，采用自體或同種異體來源的骨髓或脂肪MSCs。治療CD肛瘺應(yīng)用較多的是自體脂肪MSCs，大多數(shù)選擇單次瘺管內(nèi)注射MSCs，另外，在未觀察到瘺管閉合的情況下選擇間隔6～8周后重復(fù)注射相同或更高細(xì)胞數(shù)量的MSCs，雖然目前MSCs治療CD肛瘺的細(xì)胞來源、細(xì)胞數(shù)量及治療間隔時(shí)間不同，但均能使難治性CD肛瘺患者獲益。目前，仍有幾項(xiàng)MSCs治療CD肛瘺的臨床研究正在進(jìn)行中，期待能有更充分的證據(jù)明確MSCs治療CD肛瘺的療效及安全性。

總體而言，MSCs治療CD肛瘺的安全性較高，截至目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道由于MSCs自身造成的不良事件，常見不良事件為肛周疼痛、便血、發(fā)熱、腹痛、腹瀉、肛周膿腫等，大多數(shù)為一過性的，很少導(dǎo)致患者需入院治療或致殘，且這些不良事件與MSCs局部注射的操作程序（如瘺管的刮除、內(nèi)部開口的封閉等）或疾病本身進(jìn)展相關(guān)，而非MSCs本身所致。而外科手術(shù)常導(dǎo)致的并發(fā)癥如大便失禁并未見于MSCs治療的文獻(xiàn)報(bào)道。

考慮MSCs具有免疫抑制性，其是否具有潛在的致癌作用目前尚未明確。有動(dòng)物研究顯示，MSCs可促進(jìn)腫瘤生長[24-25]；但在目前已報(bào)道的臨床研究中尚未得到證實(shí)。MOLENDIJK等[19]報(bào)道了1例患者在MSCs局部瘺管內(nèi)注射后15個(gè)月發(fā)生盲腸腺瘤，但考慮到MSCs在體內(nèi)具有非常有限的壽命及患者有結(jié)腸癌家族史，且患者在入組初及治療后第12周時(shí)內(nèi)鏡隨訪腸道活檢均未見腫瘤組織，因此，認(rèn)為該腫瘤發(fā)生與遺傳因素相關(guān)而非由于MSCs治療所致。DE LA PORTILLA等[15]報(bào)道了1例患者在MSCs治療隨訪期間發(fā)現(xiàn)了子宮平滑肌瘤，但考慮到子宮平滑肌瘤為子宮的非癌性生長、育齡期女性發(fā)生率高且其癌變率極低甚至不發(fā)生癌變等特征，因此，在該臨床研究中也未揭示MSCs治療具有任何致癌風(fēng)險(xiǎn)。但需考慮到惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能需在更長隨訪時(shí)間后才會(huì)明顯，一項(xiàng)隨訪時(shí)間長達(dá)4年的研究提示，MSCs無致癌風(fēng)險(xiǎn)[14]；但需考慮由于該研究納入樣本量少，且在各研究中對MSCs治療不良事件尚未具有標(biāo)準(zhǔn)化定義，因此，目前在評(píng)價(jià)安全性方面尚未達(dá)成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，存在局限性。所以，在未來的臨床研究中需更大樣本量患者的長期隨訪，以進(jìn)一步評(píng)估MSCs治療CD肛瘺的安全性。

4 MSCs治療CD肛瘺的研究方向

目前，關(guān)于MSCs治療CD肛瘺仍存在許多尚未解決的問題：（1）目前仍未知不同來源MSCs治療CD肛瘺的療效是否存在差異。有研究表明，脂肪、骨髓、臍帶MSCs之間存在免疫調(diào)節(jié)能力等的不同。雖然自體來源MSCs在體外具有相似的生長潛力和T淋巴細(xì)胞抑制特性，但自體MSCs增殖率較低，可能療效欠佳[26]，且需考慮自體MSCs體外擴(kuò)增需一定的時(shí)間，可能會(huì)延誤治療。同種異體MSCs雖可及時(shí)獲得，但MSCs表達(dá)低水平的人類白細(xì)胞抗原，所以，同種異體MSCs仍有增加免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)。（2）MSCs的最佳治療數(shù)量、治療時(shí)間間隔仍未有定論。有研究表明，中等細(xì)胞數(shù)量的MSCs可取得更高的瘺管愈合率，考慮系較高的MSCs細(xì)胞濃度可能導(dǎo)致較低的細(xì)胞存活率及降低了細(xì)胞功能，且MSCs達(dá)到一定細(xì)胞數(shù)量時(shí)可能表現(xiàn)出免疫原性，導(dǎo)致細(xì)胞被清除及失活率增加。（3）MSCs在治療CD肛瘺時(shí)因其與免疫抑制劑及生物制劑享有共同的靶目標(biāo)，因此，聯(lián)合治療是否會(huì)相互影響尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。有研究表明，MSCs暴露于一定濃度免疫抑制劑或生物制劑中并不影響其細(xì)胞存活率及其對單核細(xì)胞增殖的抑制作用，二者甚至具有協(xié)同作用[27]。但也有研究表明，高濃度硫唑嘌呤可降低大鼠骨髓MSCs的增殖，增加MSCs的凋亡、壞死[28]；且免疫抑制劑可能對活化MSCs的關(guān)鍵細(xì)胞因子IFN-γ的分泌造成影響。因此，MSCs是否與藥物聯(lián)合治療CD肛瘺尚有待于進(jìn)一步明確。（4）未來臨床研究需在進(jìn)一步明確MSCs治療CD肛瘺的機(jī)制基礎(chǔ)上設(shè)立更多的隨機(jī)對照試驗(yàn)直接比較MSCs與免疫抑制劑、生物制劑、外科手術(shù)之間的療效差異。由于目前研究數(shù)據(jù)的局限性，未來研究中尚需考慮影響瘺管愈合的相關(guān)因素（如患者性別、年齡、瘺管直徑/長度、瘺管類型、CD病程長短、CD疾病活動(dòng)指數(shù)等），在選擇合適的細(xì)胞數(shù)量、來源等的基礎(chǔ)上使CD肛瘺患者獲得最優(yōu)化治療。

綜上所述，目前臨床藥物及外科手術(shù)對CD肛瘺的治療作用是有限的，由于MSCs具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)潛能等為難治性CD肛瘺的治療提供了新的希望。目前，已有多項(xiàng)臨床研究證實(shí)，MSCs對難治性CD肛瘺治療有效，且并未發(fā)現(xiàn)與本身MSCs治療相關(guān)的不良事件的發(fā)生，其療效佳及安全性可。但由于目前研究數(shù)據(jù)的局限性，未來的臨床研究需進(jìn)行更多的隨機(jī)對照試驗(yàn)以支持該結(jié)論。

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