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    帕金森病中的CDK5相關(guān)通路*

    2018-02-13 18:43:18劉佩佩綜述審校揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院江蘇省蘇北人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科江蘇揚州225001
    現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生 2018年11期
    關(guān)鍵詞:泛素神經(jīng)細(xì)胞磷酸化

    劉佩佩 綜述,朱 艷 審校(揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院/江蘇省蘇北人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,江蘇揚州225001)

    帕金森?。≒D)是一種常見于中老年的神經(jīng)退行性疾病。其發(fā)病時以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態(tài)障礙為主要的臨床表現(xiàn)。該病具有發(fā)病隱匿、進展緩慢、預(yù)后差等臨床特點[1-2]。新的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,中國年齡65歲人群PD患病率超過1%,美國60歲以上人群患病率則接近1%,且隨著年齡的增加而升高。雖然多年來對PD進行了持續(xù)性研究,但PD的病因依然不明。目前,普遍認(rèn)為,遺傳因素、環(huán)境因素、神經(jīng)系統(tǒng)老化等均有所影響[3-4]。其病理則表現(xiàn)為漸進性、選擇性的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的丟失及殘存神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)特征性路易小體,且病理變化程度與PD患者癥狀相關(guān)[5]。

    在許多神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞周期重啟被認(rèn)為與神經(jīng)細(xì)胞死亡密切相關(guān)。細(xì)胞周期依賴性激酶(CDK)則被認(rèn)為在神經(jīng)細(xì)胞的死亡中具有重要作用。其中CDK5不僅在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)較多,還在神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、生長過程中具有重要作用[6],更是在異常細(xì)胞周期重啟中發(fā)揮了重要作用[5,7-9]。

    目前,PD的具體發(fā)病機制仍不明確。近年來,大量研究表明,細(xì)胞周期異常重啟在PD發(fā)病過程中具有重要作用。而CDK5作為一個特殊的細(xì)胞周期蛋白依賴激酶,在很多通路中被觀察到與PD的發(fā)生相關(guān),如與肌細(xì)胞增強因子2D(MEF2D)、DNA修復(fù)酶嘌呤/嘧啶內(nèi)切酶1(Ape1)等相聯(lián)系的信號通路等。現(xiàn)對CDK5在PD的發(fā)生中的相關(guān)通路進行簡要回顧。

    1 CDK5?parkin 途徑

    有關(guān)PD的遺傳研究結(jié)果顯示,至少有9個基因突變被認(rèn)為與家族性PD相關(guān),其中parkin基因(PARK2)突變較為常見[10]。PARK2突變與常染色體隱性遺傳的青少年型PD發(fā)病相關(guān)。此外,還有研究表明,PARK2也是散發(fā)型PD的危險因素之一[11]。

    PARK2包含了12個外顯子,在許多組織中廣泛存在,尤其是在肌肉及大腦中[12]。其編碼具有泛素連接酶活性的parkin蛋白。而泛素作為一種被廣泛需求的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子在許多細(xì)胞通路中起作用,如細(xì)胞周期的調(diào)控、內(nèi)吞、DNA修復(fù)等。泛素與目的蛋白結(jié)合需要泛素活化酶、泛素結(jié)合酶及泛素連接酶共同發(fā)揮作用。PARK2突變影響了parkin蛋白功能,進而影響其與下游的連接[11,13-14]。

    parkin蛋白可受多種內(nèi)外因素及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié),CDK5可磷酸化parkin蛋白。AVRAHAM等[15]研究表明,無論是體內(nèi)環(huán)境還是體外環(huán)境,CDK5均可磷酸化parkin蛋白。CDK5主要在S131位點磷酸化parkin蛋白,以調(diào)節(jié)其泛素連接酶的作用,影響其與底物synphilin-1或絲裂原活化蛋白激酶p38的結(jié)合。而synphilin-1則與PD患者包涵體的形成、聚集相關(guān)。當(dāng)parkin蛋白的S131突變時失去了CDK5的磷酸化,S131A的parkin蛋白的泛素連接酶的功能得到加強,更加有利于內(nèi)涵體的聚集。提示CDK5是parkin蛋白的一個新的調(diào)節(jié)因子,CDK5對其的磷酸化會增加毒性parkin蛋白底物的聚集,降低多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞對毒素的抵制[5,15]。

    CDK5在S131位點磷酸化parkin蛋白增強了parkin蛋白作為底物與酪蛋白酶Ⅰ的結(jié)合能力。RUBIO DE LA TORRE等[5]對parkin蛋白進一步的研究發(fā)現(xiàn),酪蛋白酶Ⅰ可在S101、S127、S378位點磷酸化parkin蛋白。當(dāng)這3個位點全部突變時酪蛋白酶Ⅰ則幾乎完全不能與parkin蛋白結(jié)合。而當(dāng)CDK5主要磷酸化的S131位點突變時酪蛋白酶Ⅰ與parkin蛋白的結(jié)合程度較野生型降低。同樣情況發(fā)生在應(yīng)用了CDK5的高選擇性抑制劑—— 羅考維停(roscovitine)之后,證明CDK5在S131位點對parkin蛋白磷酸化可使parkin蛋白能更好地與酪蛋白酶Ⅰ結(jié)合。

    2 鈣依賴蛋白酶(calpain)-絲裂原活化蛋白激酶p35?p25/CDK5?MEF2 途徑

    SMITH 等[16]對 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)的PD模型中的CDK5及其上、下游均進行研究發(fā)現(xiàn),MPTP造模后,p25水平上升,但p35水平變化不大,說明p35因鈣蛋白酶作用而轉(zhuǎn)變?yōu)閜25在整體中所占的比例不大。使用選擇性鈣蛋白酶抑制劑后,p25水平明顯下降。同時,MPTP作用后CDK5活性明顯上升,而該活性上升程度亦可被鈣蛋白酶抑制劑在一定程度上抑制。但CDK5被鈣蛋白酶抑制劑影響的程度小于p25被影響的程度,說明CDK5活性可能具有更多的影響因素。但鈣蛋白酶在CDK5的活化中仍具有重要作用。

    進一步的研究結(jié)果顯示,在生理情況下p35缺如小鼠與野生型比較,黑質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量、運動功能、酪氨酸羥化酶(TH)均無明顯差異。TH是多巴胺合成限速酶,亦是多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的表型標(biāo)志物之一,其可被CDK5磷酸化,反過來可使CDK5活性上升。MPTP處理后TH在野生型中的數(shù)量卻較p35缺如型明顯下降,而在鈣蛋白酶抑制劑處理的樣本中也觀察到同樣現(xiàn)象。同時,黑質(zhì)中的神經(jīng)細(xì)胞也與TH保持同樣的變化趨勢。在MPTP模型中p35缺如或鈣蛋白酶抑制劑作用,阻斷了CDK5對下游的影響,從而對神經(jīng)細(xì)胞起到了保護性作用。

    MEF2是一種促存活轉(zhuǎn)錄因子,有A~D 4種亞型,是一個在許多細(xì)胞周期過程中具有重要作用的因子,其中包括神經(jīng)細(xì)胞的存活過程。MEF2是多個關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)信號通路的終點,這些通路均影響著細(xì)胞的存活和凋亡[17]。SMITH 等[16]和 MOUNT 等[18]研究證實,MEF2在MPTP模型中對多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞具有保護作用。

    GONG等[19]研究表明,無論是體內(nèi)實驗還是體外實驗,CDK5均可磷酸化MEF2以抑制其轉(zhuǎn)錄活性。而神經(jīng)毒素可增強CDK5活性。進一步研究發(fā)現(xiàn),MEF2轉(zhuǎn)錄活性主要由其被磷酸化的程度所決定,而并不太受MEF2蛋白量的影響[20]。外源性 dnCDK5(dominant-negative form of CDK5)能加強結(jié)合能力,但沒有酶活性,且可通過搶奪p35或p25而影響內(nèi)源性CDK5的能力。當(dāng)外源性dnCDK5作用時,與無外源性dnCDK5時比較,被抑制的MEF2活性明顯回升。當(dāng)應(yīng)用CDK5高選擇性抑制劑——Roscovitine時結(jié)果相同,說明上升的CDK5活性確實抑制了MEF2相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄能力。

    也有研究發(fā)現(xiàn),CDK5可在S444位點磷酸化MEF2。當(dāng)S444位點突變時被磷酸化的MEF2明顯較野生型減少。突變的MEF2可抵制CDK5的磷酸化,且可保護神經(jīng)細(xì)胞免于神經(jīng)毒素引起的細(xì)胞凋亡。

    3 CDK5?Ape1 途徑

    Ape1是氧化或其他因素導(dǎo)致基因損傷后對DNA進行修復(fù)的堿基切除修復(fù)通路中一個重要的酶。在堿基切除修復(fù)通路中Ape1發(fā)揮其脫嘌呤/脫嘧啶(AP)內(nèi)切酶活性,切開AP位點。AP位點可進一步被其他的酶作用以修復(fù)DNA。這是氧化性DNA損傷時一條主要的修復(fù)途徑[21]。另外,Ape1還具有類似氧化還原因子的作用,可保持轉(zhuǎn)錄因子處于還原態(tài),這是轉(zhuǎn)錄因子可進行轉(zhuǎn)錄的首要條件。

    HUANG等[22]對CDK5及Ape1之間的聯(lián)系進行研究發(fā)現(xiàn),MPTP作用后可誘導(dǎo)CDK5對Ape1的磷酸化。免疫共沉淀也證實,Ape1直接與p35相連接。且當(dāng)Ape1的t232位點突變時被CDK5/p35的磷酸化水平明顯下降;當(dāng)S53位點突變時磷酸化水平輕微下降;當(dāng)ST2位點突變時對磷酸化無影響。而使用CDK5高選擇性抑制劑——roscovitine可消除所有的磷酸化。說明CDK5/p35直接作用于Ape1,且主要在Thr232位點磷酸化Ape1。進一步采用p35-/-的模型進行相關(guān)研究,依然未發(fā)現(xiàn)磷酸化的Ape1。說明在MPTP模型中Ape1的磷酸化只由CDK5所引導(dǎo)。

    進一步研究CDK5介導(dǎo)的Ape1磷酸化對其功能的影響時發(fā)現(xiàn),Thr232位于Ape1的C′端,已被證實與Ape1的 AP內(nèi)切酶活性相關(guān)[23]。分別突變 T232、S53、ST2位點,并分別在CDK5/p25陰性、CDK5/p25陰性的情況下,比較其相應(yīng)的AP內(nèi)切酶活性,結(jié)果顯示,CDK5雖對多個位點具有磷酸化作用,但只在Thr232位點的磷酸化會降低Ape1內(nèi)切酶活性。抑制CDK5活性時可明顯提升AP內(nèi)切酶活性。

    有研究對Ape1進行了小干擾RNA轉(zhuǎn)染,并對相應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞進行熒光標(biāo)記。在MPTP模型中發(fā)現(xiàn),未轉(zhuǎn)染Ape1時存活的神經(jīng)細(xì)胞較多。而轉(zhuǎn)染后Ape1功能受影響,死亡了較多的神經(jīng)細(xì)胞。證實在MPTP模型中Ape1對神經(jīng)細(xì)胞具有保護作用。而CDK5對Ape1的磷酸化,降低了其AP內(nèi)切酶活性,影響了Ape1的功能,降低了其對神經(jīng)細(xì)胞的保護作用,從而加重了MPTP模型中神經(jīng)細(xì)胞死亡及DNA損傷。

    此外,BUSSO等[24]報道,CDK5可增強內(nèi)源性Ape1泛素化,而Ape1泛素化可能與其修復(fù)DNA功能及基因調(diào)節(jié)能力具有內(nèi)在聯(lián)系,但目前其具體機制尚不明確。

    4 CDK5?過氧化物還原酶 2(Prx2)途徑

    Prx2是一種具有過氧化物酶活性的抗氧化劑,而氧化應(yīng)激也是PD的可能致病因素之一[25]。有研究對Prx2及PD之間關(guān)系進行了探討。

    QU等[26]研究發(fā)現(xiàn),在MPTP作用的細(xì)胞或小鼠模型中Prx2直接通過p35與CDK5結(jié)合。當(dāng)p35-/-時Prx2磷酸化水平有所下降,但不是完全的改變,可能由于絲裂原活化蛋白激酶p39存在的緣故。因而改用CDK5高選擇性抑制劑——roscovitine,Prx2磷酸化水平同樣下降了,證實Prx2的磷酸化確實受CDK5的影響。進而推測CDK5可能是在T89位點磷酸化Prx2。該研究分別檢測了野生型Prx2及T89位點突變的Prx2在MPTP作用下的磷酸化水平,結(jié)果顯示,Prx2在T89A位點上幾乎未檢測到磷酸化,從而說明CDK5對Prx2的磷酸化發(fā)生在T89位點。

    那么,CDK5對Prx2的磷酸化對其功能有何影響呢?有研究將磷酸化Prx2與未磷酸化Prx2分離,采取相同的數(shù)量以評估磷酸化前后Prx2過氧化物酶活性,結(jié)果顯示,磷酸化Prx2過氧化物酶活性僅為未磷酸化Prx2的37%,即磷酸化Prx2過氧化物酶活性明顯降低。所以,CDK5在T89位點磷酸化Prx2,降低了Prx2過氧化物酶活性。

    Prx2活性降低的影響可通過Prx2在MPTP模型中作用來說明:(1)經(jīng)MPTP處理后Prx2含量并未明顯增高,但磷酸化Prx2含量卻發(fā)生了顯著變化。(2)Prx2的活性受T89位點磷酸化影響,Prx2的存在可顯著保護神經(jīng)細(xì)胞免于死亡。而Prx2 T89A影響了CDK5對Prx2的磷酸化,同樣表現(xiàn)出毒性情況下對神經(jīng)細(xì)胞的顯著保護作用。而應(yīng)用干擾小RNA干擾了Prx2的表達(dá)時神經(jīng)細(xì)胞也相應(yīng)地對MPTP毒性更加敏感,存活更少[27]。表明Prx2對神經(jīng)細(xì)胞具有保護作用。MPTP作用的模型中CDK5在T89位點磷酸化Prx2,降低了Prx2過氧化物酶活性,降低了Prx2的保護作用,則可加重神經(jīng)細(xì)胞死亡[26,28]。

    上述途徑并不只存在于PD或相關(guān)模型中,在其他疾病中也存在并發(fā)揮著相應(yīng)作用,如CDK5與Prx2在缺血損傷模型中也具有重要關(guān)聯(lián)[29]。但其在具體不同疾病中所起的作用及作用大小仍需進行相關(guān)的研究加以證實。此外,CDK5與PD之間尚存在其他的可能途徑,如CDK5與α-核突觸蛋白(α-synuclein)之間存在關(guān)聯(lián),CDK5 可促進 α-synuclein 聚集[8-9,30],但具體的路徑尚不清楚,尚有待于進一步研究。

    綜上所述,CDK5在PD的神經(jīng)細(xì)胞死亡中發(fā)揮了重要作用,其有可能是PD治療的一個靶點。但由于CDK5具有復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng),在成為治療靶點前尚有大量疑問需進一步研究澄清。

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