帕金森病中的CDK5相關(guān)通路*

劉佩佩 綜述，朱 艷 審校（揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院/江蘇省蘇北人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇揚州225001）

帕金森?。≒D）是一種常見于中老年的神經(jīng)退行性疾病。其發(fā)病時以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態(tài)障礙為主要的臨床表現(xiàn)。該病具有發(fā)病隱匿、進展緩慢、預(yù)后差等臨床特點[1-2]。新的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，中國年齡65歲人群PD患病率超過1%，美國60歲以上人群患病率則接近1%，且隨著年齡的增加而升高。雖然多年來對PD進行了持續(xù)性研究，但PD的病因依然不明。目前，普遍認(rèn)為，遺傳因素、環(huán)境因素、神經(jīng)系統(tǒng)老化等均有所影響[3-4]。其病理則表現(xiàn)為漸進性、選擇性的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的丟失及殘存神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)特征性路易小體，且病理變化程度與PD患者癥狀相關(guān)[5]。

在許多神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞周期重啟被認(rèn)為與神經(jīng)細(xì)胞死亡密切相關(guān)。細(xì)胞周期依賴性激酶（CDK）則被認(rèn)為在神經(jīng)細(xì)胞的死亡中具有重要作用。其中CDK5不僅在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)較多，還在神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、生長過程中具有重要作用[6]，更是在異常細(xì)胞周期重啟中發(fā)揮了重要作用[5，7-9]。

目前，PD的具體發(fā)病機制仍不明確。近年來，大量研究表明，細(xì)胞周期異常重啟在PD發(fā)病過程中具有重要作用。而CDK5作為一個特殊的細(xì)胞周期蛋白依賴激酶，在很多通路中被觀察到與PD的發(fā)生相關(guān)，如與肌細(xì)胞增強因子2D（MEF2D）、DNA修復(fù)酶嘌呤/嘧啶內(nèi)切酶1（Ape1）等相聯(lián)系的信號通路等。現(xiàn)對CDK5在PD的發(fā)生中的相關(guān)通路進行簡要回顧。

1 CDK5?parkin 途徑

有關(guān)PD的遺傳研究結(jié)果顯示，至少有9個基因突變被認(rèn)為與家族性PD相關(guān)，其中parkin基因（PARK2）突變較為常見[10]。PARK2突變與常染色體隱性遺傳的青少年型PD發(fā)病相關(guān)。此外，還有研究表明，PARK2也是散發(fā)型PD的危險因素之一[11]。

PARK2包含了12個外顯子，在許多組織中廣泛存在，尤其是在肌肉及大腦中[12]。其編碼具有泛素連接酶活性的parkin蛋白。而泛素作為一種被廣泛需求的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子在許多細(xì)胞通路中起作用，如細(xì)胞周期的調(diào)控、內(nèi)吞、DNA修復(fù)等。泛素與目的蛋白結(jié)合需要泛素活化酶、泛素結(jié)合酶及泛素連接酶共同發(fā)揮作用。PARK2突變影響了parkin蛋白功能，進而影響其與下游的連接[11，13-14]。

parkin蛋白可受多種內(nèi)外因素及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，CDK5可磷酸化parkin蛋白。AVRAHAM等[15]研究表明，無論是體內(nèi)環(huán)境還是體外環(huán)境，CDK5均可磷酸化parkin蛋白。CDK5主要在S131位點磷酸化parkin蛋白，以調(diào)節(jié)其泛素連接酶的作用，影響其與底物synphilin-1或絲裂原活化蛋白激酶p38的結(jié)合。而synphilin-1則與PD患者包涵體的形成、聚集相關(guān)。當(dāng)parkin蛋白的S131突變時失去了CDK5的磷酸化，S131A的parkin蛋白的泛素連接酶的功能得到加強，更加有利于內(nèi)涵體的聚集。提示CDK5是parkin蛋白的一個新的調(diào)節(jié)因子，CDK5對其的磷酸化會增加毒性parkin蛋白底物的聚集，降低多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞對毒素的抵制[5，15]。

CDK5在S131位點磷酸化parkin蛋白增強了parkin蛋白作為底物與酪蛋白酶Ⅰ的結(jié)合能力。RUBIO DE LA TORRE等[5]對parkin蛋白進一步的研究發(fā)現(xiàn)，酪蛋白酶Ⅰ可在S101、S127、S378位點磷酸化parkin蛋白。當(dāng)這3個位點全部突變時酪蛋白酶Ⅰ則幾乎完全不能與parkin蛋白結(jié)合。而當(dāng)CDK5主要磷酸化的S131位點突變時酪蛋白酶Ⅰ與parkin蛋白的結(jié)合程度較野生型降低。同樣情況發(fā)生在應(yīng)用了CDK5的高選擇性抑制劑—— 羅考維停（roscovitine）之后，證明CDK5在S131位點對parkin蛋白磷酸化可使parkin蛋白能更好地與酪蛋白酶Ⅰ結(jié)合。

2 鈣依賴蛋白酶（calpain）-絲裂原活化蛋白激酶p35?p25/CDK5?MEF2 途徑

SMITH 等[16]對 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)的PD模型中的CDK5及其上、下游均進行研究發(fā)現(xiàn)，MPTP造模后，p25水平上升，但p35水平變化不大，說明p35因鈣蛋白酶作用而轉(zhuǎn)變?yōu)閜25在整體中所占的比例不大。使用選擇性鈣蛋白酶抑制劑后，p25水平明顯下降。同時，MPTP作用后CDK5活性明顯上升，而該活性上升程度亦可被鈣蛋白酶抑制劑在一定程度上抑制。但CDK5被鈣蛋白酶抑制劑影響的程度小于p25被影響的程度，說明CDK5活性可能具有更多的影響因素。但鈣蛋白酶在CDK5的活化中仍具有重要作用。

進一步的研究結(jié)果顯示，在生理情況下p35缺如小鼠與野生型比較，黑質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量、運動功能、酪氨酸羥化酶（TH）均無明顯差異。TH是多巴胺合成限速酶，亦是多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的表型標(biāo)志物之一，其可被CDK5磷酸化，反過來可使CDK5活性上升。MPTP處理后TH在野生型中的數(shù)量卻較p35缺如型明顯下降，而在鈣蛋白酶抑制劑處理的樣本中也觀察到同樣現(xiàn)象。同時，黑質(zhì)中的神經(jīng)細(xì)胞也與TH保持同樣的變化趨勢。在MPTP模型中p35缺如或鈣蛋白酶抑制劑作用，阻斷了CDK5對下游的影響，從而對神經(jīng)細(xì)胞起到了保護性作用。

MEF2是一種促存活轉(zhuǎn)錄因子，有A～D 4種亞型，是一個在許多細(xì)胞周期過程中具有重要作用的因子，其中包括神經(jīng)細(xì)胞的存活過程。MEF2是多個關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)信號通路的終點，這些通路均影響著細(xì)胞的存活和凋亡[17]。SMITH 等[16]和 MOUNT 等[18]研究證實，MEF2在MPTP模型中對多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞具有保護作用。

GONG等[19]研究表明，無論是體內(nèi)實驗還是體外實驗，CDK5均可磷酸化MEF2以抑制其轉(zhuǎn)錄活性。而神經(jīng)毒素可增強CDK5活性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MEF2轉(zhuǎn)錄活性主要由其被磷酸化的程度所決定，而并不太受MEF2蛋白量的影響[20]。外源性 dnCDK5（dominant-negative form of CDK5）能加強結(jié)合能力，但沒有酶活性，且可通過搶奪p35或p25而影響內(nèi)源性CDK5的能力。當(dāng)外源性dnCDK5作用時，與無外源性dnCDK5時比較，被抑制的MEF2活性明顯回升。當(dāng)應(yīng)用CDK5高選擇性抑制劑——Roscovitine時結(jié)果相同，說明上升的CDK5活性確實抑制了MEF2相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄能力。

也有研究發(fā)現(xiàn)，CDK5可在S444位點磷酸化MEF2。當(dāng)S444位點突變時被磷酸化的MEF2明顯較野生型減少。突變的MEF2可抵制CDK5的磷酸化，且可保護神經(jīng)細(xì)胞免于神經(jīng)毒素引起的細(xì)胞凋亡。

3 CDK5?Ape1 途徑

Ape1是氧化或其他因素導(dǎo)致基因損傷后對DNA進行修復(fù)的堿基切除修復(fù)通路中一個重要的酶。在堿基切除修復(fù)通路中Ape1發(fā)揮其脫嘌呤/脫嘧啶（AP）內(nèi)切酶活性，切開AP位點。AP位點可進一步被其他的酶作用以修復(fù)DNA。這是氧化性DNA損傷時一條主要的修復(fù)途徑[21]。另外，Ape1還具有類似氧化還原因子的作用，可保持轉(zhuǎn)錄因子處于還原態(tài)，這是轉(zhuǎn)錄因子可進行轉(zhuǎn)錄的首要條件。

HUANG等[22]對CDK5及Ape1之間的聯(lián)系進行研究發(fā)現(xiàn)，MPTP作用后可誘導(dǎo)CDK5對Ape1的磷酸化。免疫共沉淀也證實，Ape1直接與p35相連接。且當(dāng)Ape1的t232位點突變時被CDK5/p35的磷酸化水平明顯下降；當(dāng)S53位點突變時磷酸化水平輕微下降；當(dāng)ST2位點突變時對磷酸化無影響。而使用CDK5高選擇性抑制劑——roscovitine可消除所有的磷酸化。說明CDK5/p35直接作用于Ape1，且主要在Thr232位點磷酸化Ape1。進一步采用p35-/-的模型進行相關(guān)研究，依然未發(fā)現(xiàn)磷酸化的Ape1。說明在MPTP模型中Ape1的磷酸化只由CDK5所引導(dǎo)。

進一步研究CDK5介導(dǎo)的Ape1磷酸化對其功能的影響時發(fā)現(xiàn)，Thr232位于Ape1的C′端，已被證實與Ape1的 AP內(nèi)切酶活性相關(guān)[23]。分別突變 T232、S53、ST2位點，并分別在CDK5/p25陰性、CDK5/p25陰性的情況下，比較其相應(yīng)的AP內(nèi)切酶活性，結(jié)果顯示，CDK5雖對多個位點具有磷酸化作用，但只在Thr232位點的磷酸化會降低Ape1內(nèi)切酶活性。抑制CDK5活性時可明顯提升AP內(nèi)切酶活性。

有研究對Ape1進行了小干擾RNA轉(zhuǎn)染，并對相應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞進行熒光標(biāo)記。在MPTP模型中發(fā)現(xiàn)，未轉(zhuǎn)染Ape1時存活的神經(jīng)細(xì)胞較多。而轉(zhuǎn)染后Ape1功能受影響，死亡了較多的神經(jīng)細(xì)胞。證實在MPTP模型中Ape1對神經(jīng)細(xì)胞具有保護作用。而CDK5對Ape1的磷酸化，降低了其AP內(nèi)切酶活性，影響了Ape1的功能，降低了其對神經(jīng)細(xì)胞的保護作用，從而加重了MPTP模型中神經(jīng)細(xì)胞死亡及DNA損傷。

此外，BUSSO等[24]報道，CDK5可增強內(nèi)源性Ape1泛素化，而Ape1泛素化可能與其修復(fù)DNA功能及基因調(diào)節(jié)能力具有內(nèi)在聯(lián)系，但目前其具體機制尚不明確。

4 CDK5?過氧化物還原酶 2（Prx2）途徑

Prx2是一種具有過氧化物酶活性的抗氧化劑，而氧化應(yīng)激也是PD的可能致病因素之一[25]。有研究對Prx2及PD之間關(guān)系進行了探討。

QU等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在MPTP作用的細(xì)胞或小鼠模型中Prx2直接通過p35與CDK5結(jié)合。當(dāng)p35-/-時Prx2磷酸化水平有所下降，但不是完全的改變，可能由于絲裂原活化蛋白激酶p39存在的緣故。因而改用CDK5高選擇性抑制劑——roscovitine，Prx2磷酸化水平同樣下降了，證實Prx2的磷酸化確實受CDK5的影響。進而推測CDK5可能是在T89位點磷酸化Prx2。該研究分別檢測了野生型Prx2及T89位點突變的Prx2在MPTP作用下的磷酸化水平，結(jié)果顯示，Prx2在T89A位點上幾乎未檢測到磷酸化，從而說明CDK5對Prx2的磷酸化發(fā)生在T89位點。

那么，CDK5對Prx2的磷酸化對其功能有何影響呢？有研究將磷酸化Prx2與未磷酸化Prx2分離，采取相同的數(shù)量以評估磷酸化前后Prx2過氧化物酶活性，結(jié)果顯示，磷酸化Prx2過氧化物酶活性僅為未磷酸化Prx2的37%，即磷酸化Prx2過氧化物酶活性明顯降低。所以，CDK5在T89位點磷酸化Prx2，降低了Prx2過氧化物酶活性。

Prx2活性降低的影響可通過Prx2在MPTP模型中作用來說明：（1）經(jīng)MPTP處理后Prx2含量并未明顯增高，但磷酸化Prx2含量卻發(fā)生了顯著變化。（2）Prx2的活性受T89位點磷酸化影響，Prx2的存在可顯著保護神經(jīng)細(xì)胞免于死亡。而Prx2 T89A影響了CDK5對Prx2的磷酸化，同樣表現(xiàn)出毒性情況下對神經(jīng)細(xì)胞的顯著保護作用。而應(yīng)用干擾小RNA干擾了Prx2的表達(dá)時神經(jīng)細(xì)胞也相應(yīng)地對MPTP毒性更加敏感，存活更少[27]。表明Prx2對神經(jīng)細(xì)胞具有保護作用。MPTP作用的模型中CDK5在T89位點磷酸化Prx2，降低了Prx2過氧化物酶活性，降低了Prx2的保護作用，則可加重神經(jīng)細(xì)胞死亡[26，28]。

上述途徑并不只存在于PD或相關(guān)模型中，在其他疾病中也存在并發(fā)揮著相應(yīng)作用，如CDK5與Prx2在缺血損傷模型中也具有重要關(guān)聯(lián)[29]。但其在具體不同疾病中所起的作用及作用大小仍需進行相關(guān)的研究加以證實。此外，CDK5與PD之間尚存在其他的可能途徑，如CDK5與α-核突觸蛋白（α-synuclein）之間存在關(guān)聯(lián)，CDK5 可促進 α-synuclein 聚集[8-9，30]，但具體的路徑尚不清楚，尚有待于進一步研究。

綜上所述，CDK5在PD的神經(jīng)細(xì)胞死亡中發(fā)揮了重要作用，其有可能是PD治療的一個靶點。但由于CDK5具有復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)，在成為治療靶點前尚有大量疑問需進一步研究澄清。

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