山東地區(qū)漢族人群SLITRK6基因多態(tài)性與抽動(dòng)穢語(yǔ)綜合征遺傳易感性關(guān)系的研究

(1 菏澤市立醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 菏澤 274000； 2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科； 3 青島市婦女兒童醫(yī)院教育科； 4 青島大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心)

抽動(dòng)穢語(yǔ)綜合征(TS)是一種主要于兒童時(shí)期起病的神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為多種運(yùn)動(dòng)性抽動(dòng)合并一種或多種發(fā)聲抽動(dòng)，同時(shí)伴有強(qiáng)迫障礙和注意力缺陷多動(dòng)障礙[1]。遺傳因素是導(dǎo)致這一復(fù)雜的神經(jīng)精神性疾病的主要原因[2]，目前TS的發(fā)病率已經(jīng)超過(guò)1%[3-4]。近年來(lái)，新發(fā)現(xiàn)的SLITRK基因家族逐漸受到研究者關(guān)注，其所編碼的蛋白質(zhì)具有調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸生長(zhǎng)的作用[5]。SLITRK基因家族共發(fā)現(xiàn)有6名成員，分別命名為SLITRK1～6[6]。ABELSON等[7]在2005年研究發(fā)現(xiàn)TS病人染色體的13q31.1處的SLITRK1基因中有2處罕見(jiàn)突變var CDf和var321，可能與TS的發(fā)生有一定的關(guān)系，SLITRK基因家族可能通過(guò)其所編碼的蛋白質(zhì)來(lái)調(diào)控神經(jīng)突觸的生長(zhǎng)，基因突變會(huì)使其所編碼蛋白抑制突觸生長(zhǎng)。KANG等[8]證實(shí)，SLITRK1與SLITRK4基因突變會(huì)影響神經(jīng)元樹(shù)突的正常生長(zhǎng)，使突觸密度顯著降低。研究證實(shí)，SLITRK3分子可顯著抑制神經(jīng)突觸軸突生長(zhǎng)[9]，SLITRK6基因突變可以導(dǎo)致哺乳動(dòng)物神經(jīng)突觸密度降低[10-11]。本次試驗(yàn)選取295例TS核心家庭成員(包括病人及其生物學(xué)父母)作為研究對(duì)象，旨在探討SLITRK6基因rs3825413和rs7336083位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)漢族人群TS發(fā)病的關(guān)聯(lián)性。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2007—2018年于青島大學(xué)附屬醫(yī)院、東營(yíng)勝利油田中心醫(yī)院、青島市婦女兒童醫(yī)院、日照人民醫(yī)院和臨沂市人民醫(yī)院就診的TS病人295例，男221例，女74例；平均年齡(8.26±2.84)歲。所有病人均經(jīng)由臨床工作經(jīng)驗(yàn)豐富的神經(jīng)與精神病學(xué)專(zhuān)家確診，且臨床表現(xiàn)均符合《美國(guó)精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》第4版(DSM-Ⅳ)或第5版(DSM-Ⅴ)中關(guān)于TS的診斷與排除標(biāo)準(zhǔn)。本項(xiàng)研究已通過(guò)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核并批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象在血液標(biāo)本采集前均已由本人或其法定監(jiān)護(hù)人簽署了知情同意書(shū)。鑒于TS發(fā)病具有明顯的遺傳傾向，因此，本次研究也同時(shí)將病人的生物學(xué)父母納入研究范圍，以此來(lái)探討其發(fā)病的遺傳學(xué)特征。

1.2 儀器和試劑

TaqMan熒光探針以及Taq酶體系由美國(guó)的Invitrogen有限公司提供，普通PCR引物以及普通PCR底物的混合液由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司提供，天根全血基因組DNA提取試劑盒由青島秀佰銳生物器材有限公司提供，普通PCR儀由美國(guó)PE公司提供，C1000TM Thermal Cycler熒光定量PCR儀由美國(guó)Bio-rad(伯樂(lè))公司提供，電泳儀由上海復(fù)星高科技集團(tuán)公司提供，凝膠成像儀由美國(guó)寶麗來(lái)公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1研究對(duì)象DNA的提取 采用靜脈采血器采集研究對(duì)象(病人及其生物學(xué)父母)的肘靜脈血共2 mL，置于含有EDTA抗凝劑的真空采血管中，震蕩搖勻后置于-20 ℃冰箱中，吸取其中的200 μL用全血基因組DNA提取試劑盒提取患者及其父母的DNA，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)提取DNA的純度和濃度，合格的標(biāo)本置于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用Taqman探針以實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)SLITRK6基因2個(gè)SNP位點(diǎn)(rs3825413和rs7336083)的基因型。所用探針及引物均由美國(guó)Applied Biosystems of Life Technologies(ABI)生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)并研制。其中rs3825413位點(diǎn)的上游引物序列為5′-TATCCTCAAGGTCAATCTGGGTTAG-3′，下游引物序列為5′-AAATCAAGATCATCCAAAATATTAC-3′；rs7336083上游引物序列為：5′-TGTGGCATGATT-TTGGCCCTTGACA-3′，下游引物序列為5′-AGG-TGACTACCAGACAAAAACTAGA-3′。RT-PCR總的反應(yīng)體系為25 μL，其中含12.5 μL的2×TaqMan Genotyping Master Mix，1.25 μL的20×TaqMan探針原液，1 μL的待測(cè)樣本DNA模板以及10.25 μL的去離子水；RT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，退火延伸1 min(溫度56～60 ℃)，循環(huán)45次。C1000TM Thermal Cycler的每次循環(huán)均檢測(cè)不同等位基因發(fā)出的不同的熒光強(qiáng)度，用VIC或FAM表示,以此判斷各待測(cè)樣本的基因分型情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。對(duì)TS患者及其父母的SLITRK6基因rs3825413以及rs7336083位點(diǎn)基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。采用傳遞不平衡檢驗(yàn)(TDT)和單倍型相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析(HRR)檢測(cè)有無(wú)傳遞不平衡現(xiàn)象以及兩組間的差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)采用基于單倍型的HRR(HHRR)對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果表明，本研究的所有研究對(duì)象的遺傳分布均達(dá)到了平衡，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 研究人群的TDT、HRR和HHRR

對(duì)295例TS病人及其生物學(xué)父母的SLITRK6基因rs3825413、rs7336083位點(diǎn)的多態(tài)性分別進(jìn)行TDT、HRR和HHRR，結(jié)果顯示，兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性與TS發(fā)病之間均不存在明顯關(guān)聯(lián)(rs3825413位點(diǎn)TDT:AA為279例，AG為142例，GA為121例，GG為48例，χ2=1.677,P=0.217,OR=0.779，95%CI=0.527～1.152；HRR:χ2=0.821,P=0.365,OR=0.863,95%CI=0.623～1.190；HHRR:χ2=1.766,P=0.184,OR=1.183,95%CI=0.923～1.517。rs7336083位點(diǎn)TDT:AA為127例，AG為157例，GA為136例，GG為170例，χ2=1.505,P=0.243,OR=1.011，95%CI=0.731～1.399；HRR:χ2=1.793,P=0.181,OR=1.271，95%CI=0.895～1.805；HHRR:χ2=1.503,P=0.220,OR=1.154,95%CI=0.918～1.451)。結(jié)果見(jiàn)表1、2。

3 討 論

TS一般發(fā)病于兒童時(shí)期，超過(guò)90%的病人通常在10歲之前發(fā)病，男女患病率約為4∶1[12]。大多數(shù)TS病人通常會(huì)合并其他精神性疾病，其中最常見(jiàn)是強(qiáng)迫癥和注意力缺陷多動(dòng)障礙，伴發(fā)的共病發(fā)病率以及嚴(yán)重程度在不同的研究人群中各不相同[13]。目前臨床上用于緩解TS癥狀最廣泛的藥物是氟哌啶醇、阿立哌唑等神經(jīng)精神鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物，這些藥物有效成分大多含有多巴胺受體激動(dòng)劑，改善抽動(dòng)癥狀的療效已經(jīng)得到臨床廣泛認(rèn)可[14]。TS病人神經(jīng)系統(tǒng)藥物治療的有效性進(jìn)一步提示，TS與中樞神經(jīng)系統(tǒng)基底節(jié)-丘腦-皮質(zhì)環(huán)路的病變密不可分，KALANITHI等[15]在對(duì)TS死亡病人進(jìn)行尸檢研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，TS病人基底節(jié)中間神經(jīng)元的跨膜蛋白較正常人顯著減少；另外TS病人大腦MRI的擴(kuò)散張量成像(DTI)結(jié)果顯示，病兒左側(cè)蒼白球和雙側(cè)丘腦的信號(hào)明顯下降，尾狀核、殼核的表觀彌散系數(shù)(ADC)值明顯增加，表明這些病兒的大腦結(jié)構(gòu)存在異常[16]。

表1SLITRK6rs3825413(A>G)和rs7336083(G>A)位點(diǎn)的HRR分析結(jié)果

分組rs3825413(A>G)G(+)G(-)rs7336083(G>A)A(+) A(-)傳遞組14614921283未傳遞組15713819798

表2SLITRK6rs3825413(A>G)和rs7336083(G>A)位點(diǎn)的HHRR分析結(jié)果

分組rs3825413(A>G)AGrs7336083(G>A)A G傳遞組421169284306未傳遞組400190263327

SLITRK家族蛋白富含亮氨酸串聯(lián)重復(fù)序列，在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)，通過(guò)與白細(xì)胞共同抗原受體酪氨酸磷酸酶相互作用，共同調(diào)控突觸的發(fā)生及其功能[17]。SLITRK基因調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸生長(zhǎng)的方式各不相同，其中，SLITRK2主要在不成熟神經(jīng)元中表達(dá)，起到抑制神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的作用，而主要在成熟神經(jīng)元中表達(dá)的SLITRK1，能夠誘導(dǎo)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)發(fā)育[18]。正如其他突觸黏附分子一樣，SLITRK基因的某些點(diǎn)突變已被證實(shí)與精神分裂癥、強(qiáng)迫癥、TS和注意力缺陷多動(dòng)障礙等疾病的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)。研究顯示，SLITRK6基因與TS的致病相關(guān)，SLITRK1、SLITRK2、SLITRK4基因的一些錯(cuò)義突變與精神分裂癥、強(qiáng)迫癥病人的發(fā)病密切相關(guān)[19]。

為進(jìn)一步探討SLITRK6基因與TS之間的關(guān)系，本研究通過(guò)分析rs3825413、rs7336083位點(diǎn)多態(tài)性來(lái)探討SLITRK6基因與山東漢族人群TS病人發(fā)病之間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明，山東地區(qū)漢族人群SLITRK6基因與TS之間不存在明顯的關(guān)聯(lián)，即SLITRK6基因可能不是TS的易感基因。但是基因多態(tài)性受種族及地域分布影響較大，本文的研究對(duì)象及選擇標(biāo)準(zhǔn)僅針對(duì)中國(guó)山東地區(qū)的漢族人群，局限性較大，所以兩者之間的關(guān)聯(lián)性仍需進(jìn)一步在不同地域以及種族中查驗(yàn)。同時(shí)，本研究樣本僅為295例TS核心家系成員，樣本量較小，今后的關(guān)聯(lián)研究仍需擴(kuò)大樣本量繼續(xù)分析。